Summary
Biz hücre ölümü yaralanma/olduğu gibi fare eklemlerin eklem yüzeyinde kayma ölçüde kontrollü mekanik yükler veya etkileri uygulamadan sonra değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, osteoartrit, genetik faktörler ve/veya farklı yükleme rejimleri içinde situ kondrosit güvenlik açığı nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Eklem kıkırdak homeostazı ikamet hücreleri (kondrosit) canlılığı üzerinde bağlıdır. Ne yazık ki, mekanik travma yaygın kondrosit ölüm, potansiyel olarak önde gelen eklem geri dönülemez arıza ve osteoartrit başlangıcı için teşvik edebilirsiniz. Ayrıca, bakım kondrosit canlılık osteokondral greft yordamlar en uygun cerrahi sonuçlar için önemlidir. Biz hücre ölümü yaralanma/olduğu gibi fare synovial eklemlerin eklem yüzeyinde kayma ölçüde kontrollü mekanik yükler veya etkileri uygulamadan sonra değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem karşılaştırmalı çalışmalarda farklı mekanik yükleme rejimleri, farklı çevresel koşullar veya genetik manipülasyon etkileri, hem de kıkırdak dejenerasyon kısa - ve/veya uzun vadeli farklı aşamalarında araştırmak için kullanılabilir güvenlik açığı, yerinde artiküler kondrosit. El yazması tanıttı Protokolü hücre ölümü yaralanma/fare synovial eklemlerin eklem yüzeyinde kayma ölçüde değerlendirmek için hedeftir. Önemlisi, bu yöntem tamamen bozulmamış kıkırdak yerli sınır koşulları ödün vermeden test sağlar. Ayrıca, hayati lekeli artiküler kondrosit gerçek zamanlı görselleştirme ve kontrollü statik ve rejimleri yükleme etkisi uygulama tarafından indüklenen hücre hasarı tek yansıma tabanlı analizi için olanak sağlar. Temsilcisi sonuçlarımız sağlıklı kıkırdak explants hücre yaralanma kayma ölçüde hassas yük büyüklüğü ve etkisi yoğunluğu üzerinde bağlı olduğunu göstermektedir. Bizim yöntem farklı mekanik yükleme rejimleri, farklı çevresel koşullar veya in situ eklem kondrosit mekanik güvenlik açığı farklı genetik manipülasyon etkilerini araştırmak için kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Eklem kıkırdak (AC) kapsar ve pürüzsüz eklem eklem sağlayan kemik sinovyal eklemlerde korur doku taşıyan bir yük olduğunu. Doku homeostazı kondrosit, AC içinde ikamet eden tek hücre tipi canlılığı bağlıdır. Ancak, kıkırdak maruz aşırı güçleri nedeniyle travma (Örneğin, falls, araç kaza veya spor yaralanmaları) veya posttravmatik eklem istikrarsızlık nedeniyle kondrosit ölüm, ortak (osteoartrit) geri dönülemez arıza için önde gelen neden olabilir 1. Ayrıca, osteokondral hasarlı kıkırdak yerel hataları onarmak için amaç yordamlar aşılama, greft ekleme ilişkili mekanik travma kondrosit canlılığı azaltır ve cerrahi sonuçları2üzerinde zararlı etkileri vardır.
Kıkırdak explant modelleri sık eklem kondrosit duyarlılık için mekanik olarak indüklenen hücre ölümü incelemek için kullanılır. Bu modeller genellikle büyük hayvanlardan explants koşulları, çevre koşullarına ve hücre güvenlik açığı3,4,5,6, diğer faktörlere yükleme etkilerini incelemek için kullanın 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Ancak, yerel eklem büyük büyüklüğü nedeniyle, bu modeller genellikle böylece yerel sınır koşulları ödün sağlam bir ortak eklem yüzeyi bir fiş kaldırılmasını gerektirir. Ayrıca, genel olarak hücre yaralanma ikna etmek için büyük mekanik yükler uygulama gerektirir. Alternatif olarak, fare kıkırdak explant modelleri situ kondrosit mekanik güvenlik açığı eğitim daha büyük hayvan modelleri çeşitli avantajlar sağlar. Özellikle, kendi küçük boyutları nedeniyle, bu modeller tam sağlam artiküler kıkırdak yerel doku bütünlüğü değiştirmeden test kolaylaştırmak. Ayrıca, yükleme fare kıkırdak kondrosit ölüm/yaralanma küçük yükler ile indüklenen öyle ki küçük kişi alanlar üzerinde oluşur (< 1 N). Son olarak, fare genom kolaylıkla, situ kondrosit duyarlılık mekanik yaralanma için nasıl belirli genlerin etkisini test sağlayan yönetilebilir.
Görselleştirmek içinde gerçek-zaman-kayma ölçüde içinde in situ hücre ölüm/yaralanma nedeniyle tam olarak olduğu gibi fare kıkırdak-Tarih-kemik Uygulamalı Mekanik Yük içinde in vitroexplants ve bu el yazması tanıttı yöntemi genel amacı ölçmek etmektir. Bildiriyi kondrosit canlılığı, biz son zamanlarda geliştirilen bir test platformu için benzer bir mikroskop monte aygıtı kullanarak hayati lekeli explants mekanik test ederek takip ödün vermeden fare synovial eklemlerin dikkatli diseksiyon fare kıkırdak mekanik özellikler16ölçmek için. Mekanik test sırasında disseke kemik (sağlam) eklem yüzeyi büyük bir bölümünü bir yük uygulandıktan sonra hızlı hücre canlılığı analizini sağlayan bir tek floresans test üzerinde görünür. Fare kıkırdak explants yüzey hücre canlılık benzer bir analiz daha önce ama yük17eşzamanlı uygulama olmadan yapıldı. Bizim yönteminin potansiyel uygulamalar artiküler kondrosit farklı kontrollü mekanik ve çevre koşullarına açığı yanı sıra duyarlılığı azaltmaya yönelik tedaviler ile taranması araştırmak için karşılaştırmalı çalışmalar arasında mekanik yükleme kondrosit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iş hayvan kaynakları Rochester Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi.
1. çözümler
- Hank'in dengeli tuz solüsyonu hazırlayın (1 X HBSS) kalsiyum, magnezyum ve yok fenol red içeren. PH 7.4 için az miktarda HCl veya NaOH ekleyerek ayarlayın.
- 303 mOsm Osmolarite NaCl veya deiyonize su ekleyerek ayarlayın. Arabellek gruptakiler, numune hazırlama ve mekanik test sırasında kullanın.
2. tam sağlam artiküler kıkırdak ile proksimal Humerus Distal Femur ve diseksiyonu
- Fareyi bir CO2 inhalasyon odası tarafından servikal yerinden çıkması takip kullanarak kurumsal esaslarına göre ötenazi. Aseptik teknik boyunca izleyin.
Not: Fareler ve 81 8 haftalık herhangi bir zorlanma ve seks arasında kullanılabilir. - Gruptakiler için aşağıdaki cerrahi araçları kullanın: mikro-makas (insizyon yapmak için kullanılan), standart diseksiyon makası (kemik kesim için kullanılır), neşter #11 ile neşter blade (kesme yumuşak doku için kullanılır), kuyumcu 's forseps (yumuşak kaldırılması için kullanılır doku) ve standart forseps (yumuşak doku ve cilt soyma için kullanılır).
- Distal femur gruptakiler için aşağıdaki talimatları uygulayın.
- Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Diz ön kısmındaki deride küçük (~ 5 mm) kesi yapmak.
- Belgili tanımlık kesme ta diz çevresi genişletmek ve diz eklem ve bacak kasları ortaya çıkarmak için cilt geri çekin.
- Proksimal femur sonundan başlayarak, bir neşter bıçak (#11) distal yönde kesmek için kullanın. Kuadriseps kas-tendon birim ve femur şaft ön tarafı arasında bıçak getirin. Kesme patella geçmiş ve doğru genişletmek ve böylece kuadriseps kas-tendon birim kaldırma patellar tendon orta aracılığıyla keserek bitirmek.
- Proksimal femur sonundan başlayarak, bir neşter bıçak (#11) distal yönde kesmek için kullanın. Hamstring kas-tendon birim ve femur şaft arka tarafı arasında bıçak getirin. Bir kez kesme diz eklemi yaklaşımlar, neşter ve femur distal condyles eklem yüzeyinde arasında temas kaçınarak yumuşak doku ile kesme başlar. Diz eklemi geçmiş kesme bitirmek.
- Kuadriseps ve hamstring kaslar uyluk kemiği ortaya çıkarmak için çekin. Aşırı kas uyluk kemiği lateral ve medial taraftan kes gitsin.
- Buzağı kas proksimal tibia arka tarafında kesmek ve uyluk arka tarafında görselleştirmek için bacak ters çevirin.
- Uyluk ve arka yüzey proksimal tibia distal condyles diz eklemi etrafında aşırı doku kaldırarak maruz.
- Bir neşter, femur condyles uzak kesme kullanarak anterior ve posteiror çapraz bağ kesilmiş. Tibia femur uzak çekmek ve alt bacak kalça kemiği ayırmak için tüm bağ kesti.
- Standart diseksiyon makası kullanarak, uyluk ile yan taraftan (tibio-femoral eklem üzerinde 8 mm) kemiğin proksimal sonunda kesti. Kemik kesme sonra uzak görünür herhangi bir kemik iliği kemik kemik iliği hücrelerinden mümkün kirlenmesini önlemek için dış silin.
Not: Kesme yan taraftan kemiği boyunca çatlamak yayılma riskini azaltır. - Yumuşak doku (yani, ligamentler ve aşırı kas) kuyumcu 's forseps kullanarak uyluk çevreleyen kaldırmak ve her iki condyles femur distal uçta üzerinde kıkırdak bulaşmasına neden. Kıkırdak ve forseps arasında temasından kaçının.
- Pazı kemiği gruptakiler için aşağıdaki talimatları uygulayın.
- Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Mikro-makas kullanarak dirsek arka tarafındaki deride bir kesi (~ 5 mm) yapmak, dirsek çevresinde kesik genişletmek ve kol ve omuz kasları ortaya çıkarmak için cilt geri çekin.
- Proksimal humerus sonundan başlayarak, bir neşter bıçak (#11) distal yönde kesmek için kullanın. Triceps kas-tendon birim ve kol kemiğinin arka tarafı arasında bıçak getirin. Humerus distal sonuna doğru kesme genişletmek ve triceps tendon ile kesme tarafından bitirmek.
- Hümeral kafa maruz kadar triceps proksimal humerus sonuna doğru çekin.
- Eklem yüzeyi dokunmadan bağ dokusu bir neşter bıçak (#11) kullanarak humerus başının etrafında kesmek ve bacak (kol ve omuz) vücuttan çıkarın. Düzenli aralıklarla hümeral kafa HBSS ile eklem yüzeyi nemlendirin.
- Pazı kemiği kol Dirsek kemiği forseps kullanarak ve bağ dokusu humerus distal ucunda kesim kol arka tarafındaki proksimal sonu kapalı ilk kırarak bağlantısını kesin. Pazı kemiği üzerinde herhangi bir aşırı dokuyu.
- Standart diseksiyon makası kullanarak kol kemiğinin arka tarafındaki deltoid yumrunun kesti.
- Disseke specimen(s) HBSS arabellek içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.
3. canlı (Calcein AM) / ölü (Propidium iyodür) protokolü boyama
- Calcein AM aşağıdaki gibi kullanarak leke.
- Calcein AM stok çözeltisi dimetil sülfoksit (DMSO) 12.5 µL ekleyerek calcein 4 mg/mL (4.02 mM) hisse senedi bir konsantrasyon içinde kaynaklanan AM, 50 µg bir şişe içine getirin.
- Hisse senedi calcein çözüm 1: 400 10 µg/mL (10,05 µM) konsantrasyonu kalsiyum AM ulaşmak için HBSS içinde seyreltik (örneğin, hisse senedi çözüm 1,25 µL HBSS 500 µL için ekleyin).
- Santrifüj kapasitesi sulandırılmış boyama çözüm 5 için tüm zaman zaman tüp duvarlarını yapışabilir, boya, karışımları ile tampon sağlamak için 2.000 x g s. Süpernatant kaldırmayın. Girdap uygun karıştırma sağlamak için belgili tanımlık eriyik.
- Disseke Numune boyama seyreltilmiş çözeltinin 500 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp koymak. 30 dk içinde bir thermomixer için 37 ° C'de numune 800 rpm'de Tantanacı kuluçkaya. Tüplerin gün ışığına maruz korumak için alüminyum folyo tutulduğundan emin ol.
- Numune calcein özgür AM HBSS arabellek aktarın. Bu noktada, numune mekanik test etmek için hazırdır.
- Çözüm aşağıdaki gibi boyama propidium iyodür (PI) hazırlayın.
- Çözüm satın alınan hisse senedi çözüm (1 mg/mL, 1.5 mM) 1:25 40 µg/mL (60 µM) pi ulaşmak için HBSS içinde sulandrarak boyama PI hazırlayın. Örneğin, hisse senedi çözüm 40 µL HBSS 1000 µL için ekleyin.
- Gün ışığına maruz korumak için alüminyum folyo kaplı çözüm boyama PI tutun. Boyama çözüm hemen mekanik test sonra yaralı hücreleri (bakınız Bölüm 4) tespit etmek için kullanın.
Not: Bir PI yükleme öncesinde de daha titizlikle diseksiyonlarının kalitesini değerlendirmek için boyama gerçekleştirebilirsiniz.
4. mekanik test protokolü
- Öyle ki posterior femur condyles veya hümeral kafa eklem yüzeyinde cam (Şekil 1) oturuyor (femur veya kol kemiği) örnek bir özel mikroskop monte mekanik test cihazı cam slayt üzerine yerleştirin.
Not: bir 10 mm-uzun ahşap aplikatör bağlayın (çapı = 2 mm) numune düz yüzeye stabilize etmek için cihazın yerleştirmeden önce cyanoacrylate tutkal kullanarak humerus distal tarafına. Mekanik test platformu ayrıntılı bir açıklaması için bkz: ek dosya 1: Bölüm 1. - Numune HBSS ile hidrat ve aygıtla birlikte numune floresan mikroskop üzerine yerleştirin.
- Artiküler kondrosit lekeli calcein AM ile görüntü (uyarma/emisyon dalga boylarında 495/515 = nm) yük bir 4 X floresan mikroskop altında uygulanması (temel) Kuru önce lens (NA 0,13 =). Görüntü kalitesini optimize etmek için satın alma ayarlarını.
- Eklem kıkırdak karşı cam sıkıştırılmış öyle ki mekanik numune üzerine yükleme uygulanır.
- Statik yüklemeiçin üstünde tepe-in numune (femur veya kol kemiği) öngörülen bir statik yük (Örneğin, 0,5 N) uygulanır. 5 min için yük tutun ve kaldırın.
- Etkisiiçin (Örneğin, 1 cm) bir reçete yüksekliği bilinen ağırlık (Örneğin, 0,1 N) silindirik bir Impactor bırakarak bir reçete etkisi enerji (Örneğin, 1 mJ) numune uygulayın. Yük 5 s darbeden sonra serbest bırakın.
Not: Aşağıdaki denklemi kullanarak etkisi enerji (E) ağırlığı (mg) Impactor ve öngörülen yüksekliği (h) dönüştürülebilir: E mgh =.
- Oda sıcaklığında 5 min için çözüm boyama PI numune kuluçkaya.
- Artiküler kondrosit lekeli calcein AM ile görüntü ve PI (uyarma/emisyon dalga boylarında 535/617 = nm) altında floresan mikroskop (Şekil 2).
5. veri analizi
- Yaralı/ölü hücreleri Uygulamalı Mekanik yükleme rejimi nedeniyle alan ölçmek.
- Önce ve sonra uygulama, mekanik ImageJ18seferdeki elde eklem yüzeyi filmler açın.
- Görüntüleri bir yığına birleştirin.
- Görüntü çözünürlüğüne göre görüntü ölçeğini ayarlayın.
- Calcein-negatif (yeşil floresans kaybı) ve PI-pozitif (kırmızı floresans kazanç) hücreleri nerede oldu alanını tanımlamak için Çokgen aracını kullanın. Bu hücreler yaralı ya da ölü olarak kabul edilir.
- Yaralı/ölü hücreleri ölçüm aracını kullanarak alanı belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı farklı yükleme iletişim kuralları uygulanan (statik yükleme: 0,1 N, 0.5 N ve N 5 min; ve etkisi yükleme için 1: 1 mJ, 2 mJ ve 4 mJ) tekrarlanarak yerelleştirilmiş alanlarında ölçülebilir: 8-10-hafta-yaşlı BALB/c fare () elde edilen femur ve humerus kıkırdak hücre yaralanmalara bağlı Şekil 2). Önemlisi, eklem yüzeyi kondrosit yaralanma kayma ölçüde hızlı ve kolay bir ImageJ ölçülmüştür. Mekanik güvenlik açığı artiküler kondrosit, yük büyüklüğü ve etkisi yoğunluğu tarafından etkilendi temsilcisi sonuçlar gösterilmektedir. Özellikle, yüksek yük büyüklükleri ve daha yüksek etkisi yoğunluklarda önemli ölçüde uyluk ve humeri (Şekil 3) hücre yaralanma kayma ölçüde arttığını.
Resim 1 : Özel mekanik test cihazın şematik Gösterim. (bir) monte cihazla uygulamak için kullanılan silindirik Impactor mekanik yükler ve/veya etkisi enerjileri bir numune için reçete. Cihaz bir örnek gösterilir. (b) deneme şematik gösterimi. Kontrollü statik (Örneğin, 0,1 N) ve/veya etkisi (Örneğin, 1 mJ) yükleme yöneticilerini disseke numune üstünde tepe-in öyle ki eklem kıkırdak karşı cam sıkıştırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi test zararlı mekanik yükledikten sonra eklem yüzeyinin. Eklem yüzey üzerinde (bir) distal femur condyles ve (b) zararlı mekanik sonra hümeral kafa yükleme temsilcisi test (etkisi [1 mJ] ve statik yükleme [1 N], sırasıyla). Kırmızı Çekirdeği yaralı hücreler ile permeabilized hücre zarlarında gösterir iken yeşil hücreleri hayati kondrosit sağlam hücre zarlarında ile lekeli. (c) vınlamak içinde yaralı/ölü hücre (sarı kontür) çevrenin humerus başının eklem yüzeyindeki görünümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Alan yaralı/ölü hücre. Yaralı/ölü hücre distal femur condyles (a, b) ve hümeral kafa (c, d) sonra (bir, c) statik eklem yüzeyi alanı (0,1 N, 0.5 N ve 1 N; n = grubu başına 6) ve (b, d) etkisi (1 mJ, 2 mJ ve 4 mJ; n = 6 grup başına) yükleme. Tüm kıkırdak kemik örnekleri kadın BALB/c 8-10 hafta yaşlı fareler elde edilmiştir. Verileri ortalama + standart sapma vardır; köşeli ayraçlar belirtmek istatistiksel anlamlılık, α = 0,05 Tukey post hoc karşılaştırmalar ile varyans analizi (ANOVA) test tarafından belirlenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan yöntemleri başarıyla uygulanabilir ve yaralı/dead situ artiküler kondrosit mekanik yükler veya etkileri reçete sonra fare eklem üzerinden görselleştirmek için istihdam edildi. Özellikle, biz tam olarak sağlam artiküler kıkırdak içinde kondrosit mekanik güvenlik açığına karşı iki farklı synovial eklemlerin analiz etmek başardık: diz eklemi (distal uyluk) ve omuz (humeri). Bizim temsilcisi sonuçlar eklem yüzeyi hücre yaralanma kayma ölçüde hassas yük büyüklüğü ve etkisi yoğunluğu üzerinde (Şekil 3) bağlı olduğunu gösterir. Önemlisi, bu yöntemin kullanılması araştırmalar fizyolojik ilgili koşullar altında mekanik yükleme için hücresel yanıt kolaylaştırır. Diğer bir deyişle, eklem kıkırdak bir olduğu gibi fizyolojik altında ortak üzerinde test sağlar ve supraphysiological yükler (bkz. ek dosya 1: Bölüm 2).
Öğrenme yapılan diseksiyonlarının fare synovial eklemlerin ve zorlukların uygun situ kondrosit taban çizgisi, bazı iletişim kuralı değişiklik, koruma ve sorun giderme işlemlerinde eğrisi verilen gerekli olabilir. Diseksiyon sırasında zararlı artiküler kondrosit en büyük riski adımları 2.3.5 2.3.10 ve 2.4.5 2.4.7 aracılığıyla yoluyla ortaya çıkar. Hücre yaralanma/ölüm diseksiyonu sırasında en aza indirmek için araştırmacı cerrahi araçlar (Örneğin, doku veya kuyumcu 's forseps zaman yumuşak doku çıkarmadan kesme zaman neşter) ve numune eklem yüzeyi arasında herhangi bir temas kaçınmalısınız . Ancak, bir eldiven ile eklem yüzeylere küçük hücre yaralanma/ölümüne neden olmaktadır. Temel hücre canlılık geliştirmek için bu da yumuşak doku eklemi kaldırıldı azaltmak gerekli olabilir. Ayrıca, ince araçlarını kullanarak genellikle diseksiyon indüklenen hücre ölümü azaltacaktır. Sonuçta, titizlikle diseksiyon ilişkili hasar temel, eklem kondrosit yokluğu onaylamak için bu örnekler her iki geçirgenliği boyalar ile leke tavsiye edilir (calcein AM ve PI, yükleme öncesinde) özellikle araştırmacı iken diseksiyon yordamla olmak (bkz. ek dosya 1: Bölüm 3).
Fare genom genetik manipulability ve fare ortak küçük boyutu göz önüne alındığında, fare modelleri artiküler kondrosit açığı mekanik yükleme için çalışmaya büyük hayvan modeller üzerinde birden fazla avantajı sağlar. Ancak, yazarın kadarıyla, hiçbir çalışmalar daha önce yaralanma / situ artiküler kondrosit olduğu gibi fare kıkırdak mekanik yükleme nedeniyle ölümü ölçmek için yapılmıştır. Müfettişler genellikle büyük hayvan modeller eklem kaldırıldı explants ölçüde mekanik yaralanma3,4,5,6,7, nedeniyle hücre ölümü araştırmak için kullanın 8 , 9 , 10 , 11 , 12. Buna ek olarak, fare modelleri 1 kolaylaştırmak) belirli bir kemik; neredeyse tüm eklem yüzeyinde görselleştirme ve 2) sonrası yükleme veya sonrası etki kondrosit canlılık doğal sınır koşulları ödün vermeden sağlam eklemlerde analizleri. Ayrıca, sıkıştırılmış iken fare numuneler büyük hayvan modellerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha küçük temas alanları oluşturmak; Bu nedenle, gerilmeler önemli ölçüde verilen yük büyüklüğü için büyük hayvan modellerinde daha yüksektir. Bu nedenle, hücre yaralanma tarafından daha küçük yük bağlı olmak. Ayrıca, fare modelleri kıkırdak dejenerasyon araştırma kolaylaştırmak ve özellikle, osteoartrit, bu hastalık olarak kolayca farelerde genetik19,20,21, ile indüklenen 22, diyet23,24 veya cerrahi işlemler25,26,27,28. Ayrıca, spontan osteoartrit BALB/c ve C57BL/629,30da dahil olmak üzere birkaç fare suşları oluşur.
Bizim temsilcisi verilerde hücre yaralanma/ölüm 5 dk mekanik yükleme kaldırıldıktan sonra ölçmek için canlılığı (canlı/ölü) lekeleri kullandık. Bu deneyler yaralı hücreleri (hücre geçici olarak rüptüre membran ile) ayrımcılık değil ölü hücreleri (hücre kalıcı olarak yırtığı Membranlar ile) anıyoruz. Bu, calcein negatif olan hücreler ve pozitif-membran zaman içinde onların membranlar ölçekler saniye ile birkaç dakika31arasında daha önce permeabilized Mayıs onarım olduğunu belirten PI. Aslında, deneyler ayrı bir küme, biz mekanik travma hayatta "yaralı" hücreleri kısmını (~ %5) küçük olduğunu ama önemli belirledikten (bkz. ek dosya 1: Bölüm 4). Bu nedenle, canlı/ölü boyama doğrudan her zaman hücre canlılığı göstergesi değildir membran bütünlüğü ölçüsüdür. Özellikle, PI-pozitif ve negatif calcein hücreleri "yaralı, plazma membran bütünlüğü mekanik travma nedeniyle (potansiyel olarak geçici) bir kaybı olarak yaralanma tanımlandığı gibi" en uygun şekilde tanımlanır. Ayrıca bizim temsilcisi veri büyük olasılıkla yalnızca hemen (nekrotik) hücre ölümü yansıtan anıyoruz. Örnekler (Örneğin, yük çıkarıldıktan sonra 48 h) daha sonra zaman noktalarda Imaging miktar nekrotik ikisinin etkinleştirmek ve apoptotik hücre ölümü.
Bu yöntemleri kullanırken bazı sınırlamaları dikkate alınmalıdır. Bu el yazması için bizim deneme deneyler, biz test platformu (Şekil 3) yeteneklerini göstermek için 8-10-hafta-yaşlı kadın BALB/c fare kullanılır. Ancak, büyük fareler kemiklerine hücre yoğunluğu içinde göze çarpan değişiklikler nedeniyle daha olsa (uygulanabilir) zor büyük uyluk yük indüklenen hücre yaralanma değerlendirilmesi olur (başarı oranı % 40 =). Buna ek olarak, hiçbir göze çarpan değişiklikler humeri hücre yoğunluğu içinde 61-81-hafta-yaşlı C57BL/6 farelerde gözlendi (bkz. ek dosya 1: Bölüm 5), böylece test platformu için faydalı hale yaşları 8-81 hafta. Yöntem hümeral kafa ve femur condyles eklem yüzeyinde sadece hücre yaralanma kayma ölçüde çözümlemek için kullanılan başka bir kısıtlamadır. Ancak, yöntem daha fazla derinlik bağımlı kayma ölçüde hücre yaralanma confocal mikroskobu tarama lazer kullanımı yoluyla çözümlemek için uzun olabilir. İkinci yöntem daha pahalı donanımları, görüntü edinme daha uzun ve daha fazla yer ve zaman alıcı analiz kullanımı gerektirecektir dikkat edin. Eklem kıkırdak ve kapak cam arasında iletişim konuma fareler32,33için fizyolojik ilgili olsa da, son olarak, bu konum farklı değil. Femur veya pazı kemiği ile dönen bir armatür kavradı Eğer ancak, bizim test platformu kişi konumunun için verir.
Sonuç olarak, uygulama kontrollü mekanik yükler ve/veya etkileri sağlam artiküler kıkırdak eklem yüzeyinin sağlayan bir vitro fare yaralanma modeli geliştirdik. Bu model gerçek zamanlı ve hızlı tek yansıma tabanlı analiz hücre yaralanma/ölümü fluorescently etiketli artiküler kondrosit görselleştirme sağlar. Önemlisi, etkileri farklı mekanik yükleme rejimleri, farklı çevresel koşullar veya kısa - ve/veya uzun vadeli kondrosit canlılığı üzerinde farklı genetik manipülasyon Bu metodoloji kullanarak test edilebilir. Böylece, bizim platformu temel bilim sorular ve ekran tedavi hedefleri kondrosit mekanik güvenlik açığı için ilgili sorguya için bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Richard Waugh ve Luis Delgadillo onların pH metre ve osmometer cömert kullanımı için teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, yazarlar Andrea Lee mekanik test sistemi ilk gelişimine katkıda bulunduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada NIH P30 AR069655 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
