Summary
Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer comment l’arthrose, les facteurs génétiques et/ou chargement différents schémas thérapeutiques affectent la vulnérabilité des chondrocytes de in situ .
Abstract
Homéostasie du cartilage articulaire dépend de la viabilité des cellules résidentes (chondrocytes). Malheureusement, traumatisme mécanique peut induire la mort de chondrocytes généralisée, pouvant déboucher sur une dégradation irréversible de l’articulation et l’apparition de l’arthrose. En outre, maintien de la viabilité de chondrocyte est important dans les procédures de greffe ostéo pour des résultats optimaux de chirurgie. Nous présentons une méthode pour évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines intactes après l’application de contraintes mécaniques contrôlées ou les impacts. Cette méthode peut être utilisée dans des études comparatives pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques, ainsi que les différentes étapes de la dégénérescence du cartilage à court et/ou à long terme vulnérabilité des chondrocytes articulaires in situs. L’objectif du protocole introduit dans le manuscrit est d’évaluer l’étendue spatiale de blessure/mort cellulaire sur la surface articulaire des articulations synoviales murines. Ce qui est important, cette méthode permet l’essai sur le cartilage intact sans compromettre les conditions aux limites natives. En outre, il permet une visualisation en temps réel des chondrocytes articulaires vitale tachées et seule analyse axée sur l’image de lésion cellulaire induite par l’application de statique contrôlé et chargement des schémas d’impact. Nos résultats représentatifs démontrent que des explants de cartilage sain, l’étendue spatiale des lésions des cellules dépend sensiblement intensité ampleur et l’impact de charge. Notre méthode peut être facilement adapté pour étudier les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou des manipulations génétiques différentes sur la vulnérabilité de la mécanique des in situ des chondrocytes articulaires.
Introduction
Le cartilage articulaire (AC) est une tissu qui recouvre et protège les os dans des articulations synoviales, fournissant une articulation commune lisse de charge. L’homéostasie tissulaire est tributaire de la viabilité des chondrocytes, le type de cellule unique demeurant à AC. Cependant, exposition du cartilage aux forces extrêmes due à un traumatisme (p. ex., chutes, blessures attribuables aux accidents ou sports véhicules) ou en raison de l’instabilité post-traumatique conjointe peut induire des chondrocytes mort, conduisant à une dégradation irréversible de l’articulation (arthrose) 1. en outre, en autogreffe greffe des procédures qui visent à réparer les défauts les de cartilage endommagé, greffe associée à insertion mécanique un traumatisme réduit la viabilité des chondrocytes et a des effets préjudiciables sur les résultats chirurgicaux2.
Cartilage explant modèles sont couramment utilisés pour étudier la susceptibilité des chondrocytes articulaires à la mort cellulaire induite par mécaniquement. Ces modèles utilisent généralement des explants de grands animaux pour étudier les effets du chargement des conditions, des conditions environnementales et autres facteurs sur cellule vulnérabilité3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Toutefois, en raison de la grande taille des articulations indigènes, ces modèles exigent généralement la suppression d’une fiche de la surface articulaire d’une articulation intacte, ainsi compromettre native des conditions aux limites. En outre, ils exigent généralement demande d’importantes charges mécaniques pour induire des lésions des cellules. Alternativement, cartilage murine explant modèles offrent plusieurs avantages par rapport à des modèles animaux plus gros dans l’étude de la vulnérabilité mécanique des chondrocytes de in situ . En particulier, en raison de leurs dimensions réduites, ces modèles facilitent les tests du cartilage articulaire intact sans altérer l’intégrité des tissus natifs. En outre, chargement du cartilage murin se produit sur de petites surfaces de contact tels que chondrocyte mort ou blessure peut être induite avec petites charges (< 1 N). Enfin, le génome de la souris est facilement manipulé, permettant aux essais d’impact de gènes spécifiques comment la susceptibilité des in situ les chondrocytes à une lésion mécanique.
L’objectif global de la méthode introduite dans ce manuscrit est de quantifier et de visualiser-dans-temps réel-l’étendue spatiale de in situ cellule décès et de blessures en raison des charges mécaniques appliquées sur souris entièrement intacte du cartilage-sur-OS des explants in vitro. Cette méthode nécessite une dissection minutieuse des articulations synoviales souris sans compromettre la viabilité des chondrocytes, suivie d’essais mécaniques des explants vitale colorées en utilisant un dispositif monté sur microscope semblable à une plate-forme de test que nous avons récemment développé pour quantifier le cartilage murine propriétés mécaniques16. Au cours des essais mécaniques, une grande partie de la surface articulaire (intacte) de l’OS disséqué est visible sur une micrographie de fluorescence unique, permettant une analyse rapide de la viabilité cellulaire après qu’une charge est appliquée. Une analyse similaire de la viabilité des cellules de surface des explants de cartilage murine a effectué précédemment, mais sans application simultanée d’une charge de17. Les applications potentielles de notre méthode comprennent des études comparatives pour étudier la vulnérabilité des chondrocytes articulaires à différentes conditions environnementales et mécaniques contrôlées, ainsi que la projection de traitements visant à réduire la sensibilité des chondrocytes à une charge mécanique.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux a été approuvé par le Comité de University of Rochester sur les ressources animales.
1. les solutions
- Préparer la Solution saline équilibrée de Hank (1 X HBSS) contenant du calcium, magnésium et sans rouge de phénol. Ajuster le pH à 7,4 en ajoutant de petites quantités de HCl ou NaOH.
- Ajuster l’osmolarité à 303 mOsm en ajoutant l’eau déionisée ou NaCl. Utiliser le tampon pendant la dissection, préparation des échantillons et les essais mécaniques.
2. les dissections du fémur Distal et humérus Proximal avec Cartilage articulaire Intact
- Euthanasier la souris selon les directives institutionnelles en utilisant une chambre d’inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale. Suivre une technique aseptique dans l’ensemble.
Remarque : Les souris entre 8 et 81 semaines de toute souche et sexe puisse être utilisée. - Utilisez les outils chirurgicaux suivants pour les dissections : micro-ciseaux (utilisé pour faire des incisions), ciseaux de dissection standard (utilisé pour couper l’OS), scalpel avec #11 lame de bistouri Swann-Morton (utilisé pour couper des tissus mous), pince de bijoutier (utilisés pour l’élimination du soft les tissus) et pince standard (utilisé pour le gommage de la peau et des tissus mous).
- Pour les dissections du fémur distal , suivez les instructions ci-dessous.
- Positionnez la souris en position couchée.
- Faire une incision minuscule (environ 5 mm) dans la peau sur la partie antérieure du genou.
- Prolonger l’incision tout autour du genou et tirer la peau pour exposer les muscles du genou articulation et de la jambe vers l’arrière.
- À partir de l’extrémité proximale du fémur, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de muscle-tendon du quadriceps et la face antérieure de la tige fémorale. Étendre la coupe vers et au-delà de la patella et terminer par une coupe par le milieu du tendon rotulien, supprimant ainsi l’unité de muscle-tendon du quadriceps.
- À partir de l’extrémité proximale du fémur, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de tendon-muscle ischio-jambiers et le côté postérieur de la tige fémorale. Une fois la coupe s’approche de l’articulation du genou, commencer à couper à travers les tissus mous, en évitant tout contact entre le bistouri et la surface articulaire sur les condyles distales du fémur. Terminer la coupe au-delà de l’articulation du genou.
- Tirer sur les quadriceps et les muscles ischio-jambiers pour exposer le fémur. Coupez tout muscle en excès sur les faces latérales et médiales du fémur.
- Couper le muscle du mollet sur le côté postérieur du tibia proximal puis faites basculer la jambe pour visualiser la partie postérieure du fémur.
- Exposer les condyles distales du fémur et de la surface postérieure du tibia proximal en enlevant l’excès de tissu autour de l’articulation du genou.
- Couper les ligaments croisés antérieurs et postérieurs à l’aide d’un scalpel, coupant loin les condyles fémoraux. Tirer sur le tibia de fémur et couper tous les ligaments pour séparer du fémur de la jambe.
- À l’aide de ciseaux de dissection standard, traversent le fémur à l’extrémité proximale de l’OS (8 mm au-dessus de l’articulation tibio-fémorale) du côté latéral . Après avoir coupé l’os, essuyez toute moelle visible à l’extérieur de l’OS pour éviter la contamination possible des cellules de la moelle osseuse.
Remarque : Coupe du côté latéral réduit le risque de propagation de la fissure le long de l’os. - Enlever entourant les tissus mous (c'est-à-dire, des ligaments et muscles excès) du fémur à l’aide de la pince de bijoutier et exposer le cartilage sur les deux condyles à l’extrémité distale du fémur. Éviter tout contact entre le cartilage et les forceps.
- Pour les dissections de l’humérus , suivez les instructions ci-dessous.
- Positionnez la souris en position couchée.
- Faire une incision (~ 5 mm) dans la peau sur le côté postérieur du coude à l’aide de micro-ciseaux, prolonger l’incision autour du coude et tirer la peau pour exposer les muscles du bras et épaules vers l’arrière.
- À partir de l’extrémité proximale de l’humérus, utilisez une lame de bistouri Swann-Morton (#11) pour couper le long de la direction distale. Positionner la lame entre l’unité de muscle-tendon du triceps et le côté postérieur de l’humérus. Étendre la coupe vers l’extrémité distale de l’humérus et terminer en sectionnant le tendon du triceps.
- Puis tirez le triceps vers l’extrémité proximale de l’humérus jusqu'à ce que la tête humérale est exposée.
- Couper le tissu conjonctif autour de la tête humérale à l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton (#11) sans toucher la surface articulaire et retirez la branche (bras et épaules) du corps. Périodiquement hydrate la surface articulaire de la tête humérale avec HBSS.
- Débranchez l’humérus du bras de la première rupture de l’extrémité proximale du cubitus sur le côté postérieur du bras à l’aide de pinces et puis couper le tissu conjonctif autour de l’extrémité distale de l’humérus. Enlever tout excès de tissu sur l’humérus.
- Couper la tubérosité deltoïde sur le côté postérieur de l’humérus à l’aide de ciseaux de dissection standard.
- Placer le spécimen (s) découpé dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant un tampon HBSS.
3. live (Calcéine AM) / morts (iodure de Propidium) protocole de coloration
- Tache à l’aide de calcéine AM comme suit.
- Préparer une solution stock de calcéine AM en ajoutant 12,5 µL du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un flacon de 50 µg de calcéine AM, ce qui entraîne une concentration stock de 4 mg/mL (4,02 mM).
- Diluer le stock calcéine solution 1 : 400 à HBSS pour atteindre une concentration de 10 µg/mL (10,05 µM) de calcium AM (par exemple, ajouter 1,25 ml de solution mère à 500 µL de HBSS).
- Centrifuger la solution colorante diluée pendant 5 s à 2 000 x g pour s’assurer que tout le colorant, qui peut parfois s’en tenir aux parois du tube, se mélange avec le tampon. Ne pas enlever le surnageant. Vortex la solution pour assurer un bon mélange.
- Mettre l’échantillon découpé dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 500 µL de la solution de coloration. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min dans un thermomixer tout en agitant à 800 tr/min. Assurez-vous que les tubes sont couverts en papier d’aluminium pour protéger contre l’exposition à la lumière.
- Transférer le spécimen dans tampon HBSS AM libres de calcéine. À ce stade, l’échantillon est prêt pour les essais mécaniques.
- Préparer l’iodure de propidium (PI) solution de coloration comme suit.
- Préparer la solution de coloration en diluant la solution-mère achetés (1 mg/mL, 1,5 mM) 01:25 dans HBSS pour atteindre 40 µg/mL (60 µM) de PI PI. Par exemple, ajouter 40 µL de solution mère à 1000 µL de HBSS.
- Garder la PI coloration solution couverte de papier d’aluminium pour le protéger contre l’exposition à la lumière. Utiliser la solution colorante immédiatement après l’essai mécanique pour détecter les cellules endommagées (voir section 4).
Remarque : On peut effectuer la coloration PI avant le chargement, ainsi qu’à évaluer plus rigoureusement la qualité de la dissection.
4. mécanique protocole d’essai
- Placer l’éprouvette (fémur ou humérus) sur la lame de verre d’un personnalisé microscope monté test appareil mécanique telle que la surface articulaire sur les condyles fémoraux postérieurs ou de la tête humérale est assis sur le verre (Figure 1).
NOTE : Fixer un applicateur en bois de 10 mm de long (diamètre = 2 mm) à la partie distale de l' humérus à l’aide de colle cyanoacrylate avant de le placer sur l’appareil afin de stabiliser l’échantillon sur la surface plane. Pour une description détaillée de la plate-forme d’essai mécanique voir dossier supplémentaire de 1: 1 de l’article. - Hydrater le spécimen avec HBSS et placez l’appareil avec l’échantillon sur un microscope à fluorescence.
- Image les chondrocytes articulaires tachés de calcéine AM (longueurs d’onde d’excitation/émission = 495/515 nm) avant l’application (de base) de la charge sous un microscope à fluorescence avec un 4 X sec lentille (NA = 0,13). Ajustez les réglages d’acquisition afin d’optimiser la qualité d’image.
- Appliquer le chargement mécanique sur le dessus de l’échantillon telle que le cartilage articulaire est comprimé contre la lamelle couvre-objet.
- Pour le chargement statique, appliquer une charge statique prescrite (par exemple, 0,5 N) sur le dessus de l’éprouvette (fémur ou humérus). Maintenir la charge pendant 5 min et puis l’enlever.
- Pour l' impact, appliquez une énergie d’impact réglementaire (par exemple, 1 mJ) sur l’échantillon en laissant tomber un impacteur cylindrique de poids connu (p. ex., 0,1 N) d’une hauteur réglementaire (par exemple, 1 cm). Libérer la charge 5 s après l’impact.
Remarque : Le poids de l’élément de frappe (mg) et la hauteur prescrite (h) peut être converti en énergie d’impact (E) à l’aide de l’équation suivante : E = mgh.
- Incuber le spécimen en PI coloration solution pendant 5 min à température ambiante.
- Image les chondrocytes articulaires tachés de calcéine AM et PI (longueurs d’onde d’excitation/émission = 535/617 nm) sous un microscope de fluorescence (Figure 2).
5. analyse
- Quantifier la zone des cellules de blessés/morts en raison de la régime de charge mécanique appliquée.
- Ouvrez les micrographies de la surface articulaire acquit avant et après application d’une charge mécanique dans ImageJ18.
- Combiner les images dans une pile.
- Définissez l’échelle des images basé sur la résolution de l’image.
- Utilisez l’outil polygone pour définir la zone où les cellules deviennent calcéine négatif (perte de fluorescence verte) et PI positif (gain de fluorescence rouge). Ces cellules sont considérées comme blessés ou morts.
- Déterminer la surface des cellules de blessés/morts à l’aide de l’outil de mesure .
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Representative Results
Six différents appliqués des protocoles de chargement (chargement statique : 0,1 N, 0,5 N et 1 N pour 5 min ; et le chargement de l’impact : 1 mJ, mJ 2 et 4 mJ) façon reproductible induites par des zones localisées quantifiables des lésions des cellules du cartilage fémorale et humérale, obtenu à partir de 8-10-week-old (de souris BALB/c La figure 2). Ce qui est important, l’étendue spatiale de chondrocytes dommage sur la surface articulaire a été mesuré rapidement et facilement dans ImageJ. Résultats représentatifs démontrent que la vulnérabilité mécanique des chondrocytes articulaires était affectée par l’intensité de charge ampleur et l’incidence. En particulier, amplitudes de charge plus élevées et des intensités plus élevées de l’impact considérablement aggravé l’étendue spatiale des lésions des cellules dans les fémurs et des humérus (Figure 3).
Figure 1 : Représentation schématique de l’appareil d’essai mécanique personnalisé. (un) dispositif assemblé avec l’impacteur cylindrique permet d’appliquer un prescrit des charges mécaniques et/ou les énergies d’impact d’un spécimen. Le dispositif est montré sans un spécimen. (b) représentation schématique de l’expérience. Statique contrôlé (p. ex., 0,1 N) et/ou chargement d’impact (p. ex., 1 mJ) peut être appliqué sur le dessus de l’échantillon découpé tel que le cartilage articulaire est comprimé contre la lamelle couvre-objet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Micrographie représentative de la surface articulaire après le chargement mécanique préjudiciable. Micrographie représentant des condyles fémoraux surfaces sur (un) le distal articulaires et chargement (b), la tête humérale après préjudiciable mécanique (statique et impact [1 mJ] chargement [1, N], respectivement). Cellules vertes sont souillées vitale chondrocytes avec des membranes de cellules intactes, tandis que les noyaux rouges indiquent les cellules endommagées avec des membranes de cellules perméabilisées. (c) Zoomed-en vue de la zone des cellules de blessés/morts (contours jaunes) sur la surface articulaire de la tête humérale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Zone de cellules de blessés/morts. Zone de blessés/morts les cellules sur la surface articulaire des condyles fémoraux distales (a, b) et de la tête humérale (c, d) après (a, c) statique (0,1 N, 0,5 N et 1 N ; n = 6 par groupe) et (b, d) impact (1 mJ, mJ 2 et 4 mJ ; n = 6 par groupe) chargement. Cartilage-OS sur tous les spécimens ont été obtenus des souris âgées de 8 à 10 semaines de femelles BALB/c. Les données sont moyenne + écart type ; équerres dénotent une signification statistique à α = 0,05, déterminée par l’analyse de variance (ANOVA) test post hoc de Tukey comparaisons avec. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier complémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les méthodes décrites ci-dessus ont été utilisés avec succès pour visualiser viable blessés/morts et in situ des chondrocytes articulaires de joints de souris après prescrit des charges mécaniques ou les impacts. En particulier, nous avons été en mesure d’analyser la vulnérabilité mécanique des chondrocytes dans le cartilage articulaire intact de deux différentes articulations synoviales : l’articulation du genou (fémur distal) et l’épaule (humérus). Nos résultats représentatifs montrent que l’étendue spatiale des lésions des cellules sur la surface articulaire dépend sensiblement d’intensité d’ampleur et l’impact de charge (Figure 3). Ce qui est important, l’utilisation de cette méthode facilite les enquêtes de la réponse cellulaire à une charge mécanique dans des conditions physiologiques pertinentes. Autrement dit, il permet l’essai du cartilage articulaire sur un intact mixte sous physiologiques et supra-physiologiques des charges (voir dossier supplémentaire de 1: 2 de l’article).
Compte tenu de la courbe d’apprentissage abrupte en effectuant des dissections des articulations synoviales murines et défis en préservant les chondrocytes viables sur place au départ, certaines modifications de protocole et de dépannage peut être exigée. Le plus grand risque de dommageables chondrocytes articulaires au cours de la dissection se produit au cours d’étapes 2.3.5 2.3.10 et 2.4.5 par 2.4.7. Pour minimiser les blessures/mort cellulaire au cours de la dissection, le chercheur devrait éviter tout contact entre les instruments chirurgicaux (p. ex., le scalpel pour couper le tissu ou une pince de bijoutier en enlevant les tissus mous) et la surface articulaire de l’échantillon . Cependant, toucher la surface articulaire avec un gant induit la petite blessure/mort cellulaire. Afin d’améliorer la viabilité cellulaire de base, il peut également être nécessaire de réduire la quantité de tissus mous retiré de l’articulation. En outre, à l’aide d’outils plus fines réduira généralement la mort cellulaire induite par la dissection. En fin de compte, pour rigoureusement confirmer l’absence de dommages liés à la dissection des chondrocytes articulaires au départ, il est conseillé de colorer les spécimens dont les deux colorants de perméabilité (calcéine AM et PI, avant l’embarquement) en particulier, tandis que le chercheur est se familiariser avec la procédure de dissection (voir dossier supplémentaire de 1: 3 de l’article).
Étant donné la petite taille de l’articulation de la souris et la manipulation génétique du génome de la souris, les modèles murins offrent plusieurs avantages par rapport aux grands modèles animaux pour étudier la vulnérabilité des chondrocytes articulaires à une charge mécanique. Toutefois, à la connaissance des auteurs, aucune étude précédemment n’ont été menées pour quantifier la blessure/mort de in situ des chondrocytes articulaires en raison de la charge mécanique du cartilage murine intact. Les enquêteurs utilisent généralement des explants retirés des articulations de grands modèles animaux pour enquêter sur l’étendue de la mort cellulaire en raison d’une lésion mécanique3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. en revanche, les modèles murins facilitent 1) visualisation de la presque totalité de la surface articulaire sur un os donné ; et 2) des analyses de viabilité de chondrocytes après chargement ou après l’impact dans les articulations intactes sans compromettre les conditions aux limites natives. En outre, compressé, spécimens de souris génèrent des zones de contact considérablement plus petits par rapport aux grands modèles animaux ; par conséquent, les contraintes sont considérablement plus élevés que dans les grands modèles animaux pour une charge donnée magnitude. Par conséquent, lésions des cellules peuvent être induite par des charges plus petites. En outre, les modèles murins facilitent la recherche sur la dégénérescence du cartilage et, en particulier, l’arthrose, cette maladie peut être facilement induite chez la souris par le biais de génétique19,20,21, 22, diététique23,24 ou manipulations chirurgicales25,26,27,28. En outre, l’arthrose spontanée se produit dans plusieurs souches de souris dont BALB/c et C57BL/629,30.
Dans nos données représentatives, nous avons utilisé les taches de viabilité (live/dead) pour quantifier la blessure/mort cellulaire 5 min après l’enlèvement du chargement mécanique. Nous reconnaissons que ces expériences sont appliqués sans discrimination blessés (cellules avec temporairement rupture des membranes) des cellules mortes (cellules avec en permanence des membranes de ruptures). C’est, les cellules qui sont négatifs de calcéine et PI positif-ce qui indique que la membrane a été précédemment perméabilisées-mai réparation leurs membranes au fil du temps les échelles allant de secondes à plusieurs minutes31. En effet, dans un ensemble distinct d’expériences, nous avons déterminé que la fraction des cellules « lésé » qui survivent à un traumatisme mécanique est faible (environ 5 %) mais significative (voir dossier supplémentaire de 1: 4 de l’article). Live/dead coloration est donc une mesure directe de l’intégrité de la membrane qui n’est pas toujours révélateur de la viabilité des cellules. En particulier, PI-positifs et négatifs calcéine cellules sont mieux définies comme « lésé », où la lésion est définie comme une perte d’intégrité de la membrane de plasma en raison de traumatismes mécaniques (potentiellement temporaire). Nous reconnaissons également que nos données représentatives susceptibles reflètent la mort des cellules (nécrose) seulement immédiate. Imagerie des spécimens aux périodes ultérieures (p. ex., 48 h après l’enlèvement de la charge) devrait permettre de quantification des deux nécrotiques et mort cellulaire par apoptose.
Plusieurs limitations doivent être considérées lors de l’utilisation de ces méthodes. Dans nos expériences du procès pour ce manuscrit, nous avons utilisé des souris BALB/c femelles âgés de 8-10 semaines pour démontrer les capacités de la plate-forme d’essai (Figure 3). Toutefois, en raison de modifications notables dans la densité des cellules dans les fémurs des souris âgées, l’évaluation du préjudice cellulaire induite par la charge devient plus difficile (même si c’est possible) dans les fémurs plus âgés (taux de réussite = 40 %). En revanche, aucun changement notable dans la densité des cellules sur l’humérus ont été observés chez les souris C57BL/6 61-81-week-old (voir dossier supplémentaire de 1: 5 de l’article), ce qui rendre la plate-forme d’essai utile pour ages 8-81 semaines. Une autre limitation est que la méthode a été utilisée pour analyser l’étendue spatiale des lésions des cellules uniquement sur la surface articulaire des condyles fémoraux et la tête humérale. Toutefois, la méthode pourrait être prolongée pour analyser l’étendue spatiale dépendant de la profondeur des lésions des cellules grâce à l’utilisation de la microscopie confocale à balayage laser. Notez que cette dernière méthode nécessiterait l’utilisation d’équipements plus coûteux, plus longue durée d’acquisition d’image et une analyse plus impliquée et chronophage. Enfin, bien que le lieu de contact entre le cartilage articulaire et le couvercle en verre a été physiologiquement pertinent pour souris32,33, cet emplacement ne variait pas. Cependant, notre plate-forme de test permet la variation de la position de contact si le fémur ou humérus est saisi avec une armature tournante.
En conclusion, nous avons développé un modèle de blessure murins in vitro qui permet à l’application de contraintes mécaniques contrôlées et/ou d’impacts sur la surface articulaire du cartilage articulaire intact. Ce modèle permet la visualisation des fluorescent étiquetés chondrocytes articulaires en temps réel et rapide seule imageur analyse de blessure/mort cellulaire. Ce qui est important, les effets d’une charge mécanique différents schémas thérapeutiques, différentes conditions environnementales ou différentes manipulations génétiques sur la viabilité des chondrocytes court et/ou à long terme peuvent être testés à l’aide de cette méthodologie. Ainsi, notre plateforme fournit un outil pour interroger les questions de sciences fondamentales et cibles thérapeutiques d’écran connexes la vulnérabilité mécanique des chondrocytes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Waugh et Luis Delgadillo pour l’utilisation généreuse de leur pH-metre et l’osmomètre. En outre, les auteurs voudrais remercier Andrea Lee d’avoir contribué à l’élaboration initiale du système de test mécanique. Cette étude a été financée par les NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
