Summary
Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni murini intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come osteoartrite, fattori genetici e/o i regimi differenti di carico influenzano la vulnerabilità dei condrociti in situ .
Abstract
Omeostasi della cartilagine articolare dipende la vitalità delle cellule residenti (condrociti). Purtroppo, il trauma meccanico può indurre morte del chondrocyte diffusa, che portano potenzialmente al guasto irreversibile del giunto e l'insorgenza dell'osteoartrite. Inoltre, mantenimento della vitalità dei condrociti è importante nelle procedure di innesto osteocondrali per ottimale risultati chirurgici. Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato in studi comparativi per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche, nonché diversi stadi di degenerazione della cartilagine sul breve - e/o a lungo termine vulnerabilità dei chondrocytes articolari in situ. L'obiettivo del protocollo introdotto nel manoscritto è quello di valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine. Soprattutto, questo metodo consente test su cartilagine completamente intatta, senza compromettere le condizioni al contorno native. Inoltre, consente la visualizzazione in tempo reale dei chondrocytes articolari vitale macchiato e singola analisi basata su immagini di lesione delle cellule indotta dall'applicazione di statica controllata e i regimi di carichi d'urto. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che in espianti di cartilagine sana, l'estensione spaziale della lesione delle cellule dipende sensibilmente intensità di carico di ampiezza e impatto. Il nostro metodo può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche diverse vulnerabilità della meccanica di in situ chondrocytes articolari.
Introduction
Cartilagine articolare (AC) è un tessuto che copre e protegge le ossa nelle articolazioni sinoviali, fornire liscia articolazioni portanti. Omeostasi del tessuto sono dipendente la vitalità dei condrociti, il tipo di suola delle cellule che risiedono in AC. Tuttavia, l'esposizione della cartilagine a forze estreme dovuto il trauma (ad esempio, cadute, lesioni incidente o sport veicolo) o a causa di instabilità articolare post-traumatica può indurre la morte del chondrocyte, che conduce alla rottura irreversibile dell'articolazione (artrosi) 1. Inoltre, in osteochondral procedure che mirano a riparare difetti localizzati in cartilagine danneggiata di innesto, trauma meccanico inserimento-collegata di innesto riduce la vitalità dei condrociti e ha effetti nocivi sui risultati chirurgici2.
Cartilagine explant modelli sono comunemente usati per studiare la suscettibilità dei chondrocytes articolari alla morte delle cellule indotta meccanicamente. Questi modelli utilizzano in genere espianti di grandi animali per studiare gli effetti di caricamento delle condizioni, condizioni ambientali e altri fattori sulla cella vulnerabilità3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Tuttavia, a causa delle grandi dimensioni delle articolazioni native, questi modelli generalmente richiedono la rimozione di una spina dalla superficie articolare di un giunto intatto, quindi compromettere native condizioni al contorno. Inoltre, che in genere richiedono l'applicazione di grandi carichi meccanici per indurre la lesione delle cellule. In alternativa, cartilagine murina explant modelli offrono diversi vantaggi rispetto ai modelli più grandi animali nello studiare la vulnerabilità meccanica dei condrociti in situ . In particolare, per le loro dimensioni più piccole, questi modelli facilitano l'ispezione della cartilagine articolare completamente intatta senza alterare l'integrità del tessuto nativo. Inoltre, caricamento della cartilagine murina si verifica sopra piccole aree di contatto che condrociti morte/lesione può essere indotta con piccoli carichi (< 1 N). Infine, il genoma di topo è facilmente gestibili, prove di impatto come specifico geni la suscettibilità dei condrociti in situ al danno meccanico.
L'obiettivo generale del metodo introdotto in questo manoscritto è quello di quantificare e visualizzare in real-time-il limite spaziale di in situ delle cellule morte/lesioni a causa di carichi meccanici applicati su cartilagine-su--osso del mouse completamente intatto in vitrodi espianti. Questo metodo richiede la dissezione attenta delle articolazioni sinoviali del mouse senza compromettere la vitalità dei condrociti, seguita da prove meccaniche di espianti vitale macchiati utilizzando un microscopio-montato dispositivo simile a una piattaforma di prova che abbiamo recentemente sviluppato per quantificare la cartilagine murina proprietà meccaniche16. Durante le prove meccaniche, una grande porzione della superficie articolare (intatta) dell'osso sezionato è visibile su una microfotografia di fluorescenza singolo, l'attivazione rapida analisi di attuabilità delle cellule dopo è applicato un carico. Una simile analisi di attuabilità delle cellule superficiali in espianti di cartilagine murino è stata eseguita in precedenza, ma senza applicazione simultanea di carico17. Possibili applicazioni del nostro metodo comprendono studi comparativi per studiare la vulnerabilità dei chondrocytes articolari a diverse condizioni ambientali e meccaniche controllate, così come la selezione di trattamenti volti a ridurre la sensibilità dei condrociti a carico meccanico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di Università di Rochester sulle risorse animali.
1. soluzioni
- Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (1 X HBSS) contenenti calcio, magnesio e nessun rosso di fenolo. Aggiustare il pH a 7.4 con l'aggiunta di piccole quantità di HCl o NaOH.
- Regolare l'osmolarità a 303 mOsm aggiungendo NaCl o acqua deionizzata. Utilizzare il buffer durante le dissezioni, preparazione dei campioni e le prove meccaniche.
2. le dissezioni del femore distale e prossimale dell'omero con cartilagine articolare completamente intatta
- Eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali utilizzando una camera di inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale. Seguire asettiche.
Nota: Possono essere utilizzati topi tra 8 e 81 settimane vecchie di qualsiasi ceppo e sesso. - Utilizzare i seguenti strumenti chirurgici per dissezioni: micro-forbici (usate per la fabbricazione di incisioni), forbici per dissezione standard (utilizzate per il taglio dell'osso), bisturi con #11 lama per bisturi (usata per i tessuti molli di taglio), forcipe del gioielliere (utilizzato per la rimozione di soft tessuto) e pinze standard (utilizzate per il peeling la pelle e i tessuti molli).
- Per le dissezioni del femore distale è necessario seguire le istruzioni qui sotto.
- Posizionare il mouse in posizione supina.
- Fare una piccolo (~ 5 mm) incisione della pelle sulla parte anteriore del ginocchio.
- Estendere l'incisione tutto il senso intorno al ginocchio e tirare indietro la pelle per esporre i muscoli della gamba e del giunto di ginocchio.
- A partire dall'estremità prossimale del femore, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità muscolo-tendine del quadricipite e il lato anteriore del pozzo femorale. Estendere il taglio verso e passato la rotula e finitura di taglio attraverso il centro del tendine patellar, eliminando così l'unità muscolo-tendine del quadricipite.
- A partire dall'estremità prossimale del femore, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità del tendine del ginocchio muscolo-tendinee e la parte posteriore del pozzo femorale. Una volta che il taglio si avvicina l'articolazione del ginocchio, iniziare a tagliare attraverso i tessuti molli, evitando il contatto tra il bisturi e la superficie articolare sui condili distali del femore. Finire il taglio passato l'articolazione del ginocchio.
- Tirare indietro il quadricipite e muscoli adduttori per esporre il femore. Tagliare qualsiasi muscolo in eccesso sui lati mediali e laterali del femore.
- Tagliare il muscolo del polpaccio sul lato posteriore della tibia prossimale e capovolgere la gamba per visualizzare la parte posteriore del femore.
- Esporre i condili distali del femore e la superficie posteriore della tibia prossimale rimuovendo il tessuto in eccesso intorno al giunto di ginocchio.
- Tagliare i legamenti crociati anteriori e posteriori usando un bisturi, taglio lontano i condili femorali. Tirare la tibia dal femore e tagliare i legamenti per separare la parte inferiore della gamba dal femore.
- Utilizzando le forbici per dissezione standard, tagliare attraverso il femore all'estremità prossimale dell'osso (8 mm sopra l'articolazione tibio-femorale) dal lato laterale . Dopo aver tagliato l'osso, spazzare via qualsiasi midollo visibile sulla parte esterna dell'osso per evitare possibili contaminazioni da cellule del midollo osseo.
Nota: Il taglio dal lato laterale riduce il rischio di propagazione di crepa lungo l'osso. - Rimuovere circondare i tessuti molli (cioè, legamenti e muscoli in eccesso) dal femore usando il forcipe del gioielliere ed esporre la cartilagine su entrambi condili all'estremità distale del femore. Evitare il contatto tra la cartilagine e il forcipe.
- Per le dissezioni dell'omero è necessario seguire le istruzioni qui sotto.
- Posizionare il mouse in posizione supina.
- Fare un'incisione (~ 5 mm) in pelle sul lato posteriore del gomito utilizzando micro-forbici, estendere l'incisione intorno al gomito e tirare indietro la pelle per esporre i muscoli del braccio e della spalla.
- A partire dall'estremità prossimale dell'omero, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità muscolo-tendine del triceps e del lato posteriore dell'omero. Estendere il taglio verso l'estremità distale dell'omero e finitura di taglio attraverso il tendine del tricipite.
- Quindi tirare indietro il tricipite verso l'estremità prossimale dell'omero fino a quando la testa omerale è esposta.
- Tagliare il tessuto connettivo intorno alla testa omerale usando un bisturi (#11) senza toccare la superficie articolare e togliere l'arto (braccio e spalla) dal corpo. Periodicamente idratare la superficie articolare della testa humeral con HBSS.
- Staccare il braccio Omero rompendo prima l'estremità prossimale dell'ulna sul lato posteriore del braccio usando il forcipe e poi tagliare il tessuto connettivo intorno all'estremità distale dell'omero. Rimuovere tutto il tessuto in eccesso su Omero.
- Tagliare la tuberosità deltoidea sul lato posteriore dell'omero con le forbici per dissezione standard.
- Inserire i campioni sezionati in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente tampone HBSS.
3. dal vivo (calceina) / Dead (ioduro di propidio) protocollo di colorazione
- Macchia con calceina come segue.
- Fai una soluzione stock di calceina aggiungendo 12,5 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) in un flaconcino di 50 µ g di calceina, con una concentrazione stock di 4 mg/mL (4,02 mM).
- Diluire la soluzione di calceina stock 1: 400 in HBSS per raggiungere una concentrazione di 10 µ g/mL (10.05 µM) di calcio AM (ad esempio, aggiungere 1.25 µ l di soluzione madre a 500 µ l di HBSS).
- Centrifugare la soluzione colorante diluita per 5 s a 2.000 x g per garantire che tutti della tintura, che occasionalmente può attaccare alle pareti del tubo, si mescola con il buffer. Non rimuovere il surnatante. La soluzione per garantire la corretta miscelazione di vortice.
- Mettere il campione dissecato in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 µ l di soluzione colorante diluita. Incubare il campione a 37 ° C per 30 min in un thermomixer mentre agitando a 800 giri/min. Assicurarsi che i tubi sono rivestiti in carta stagnola per proteggere dall'esposizione alla luce.
- Trasferire il campione nel buffer di calceina HBSS AM-libero. A questo punto, il campione è pronto per le prove meccaniche.
- Preparate propidio ioduro (PI) macchiando soluzione come segue.
- Preparare la soluzione di colorazione diluendo la soluzione di riserva acquistati (1 mg/mL, 1,5 mM) 01:25 in HBSS raggiungere 40 µ g/mL (60 µM) di PI PI. Ad esempio, aggiungere 40 µ l di soluzione madre a 1000 µ l di HBSS.
- Tenere il PI macchiatura soluzione rivestito in lamina di alluminio per proteggerlo dall'esposizione alla luce. Utilizzare la soluzione colorante immediata dopo il test meccanico per rilevare cellule lese (Vedi sezione 4).
Nota: Si può eseguire la colorazione PI prima del carico nonché per valutare più rigorosamente la qualità delle dissezioni.
4. meccanica protocollo di prova
- Disporre del campione (femore o Omero) su vetrino un dispositivo test meccanico montato microscopio personalizzati in modo tale che la superficie articolare sul posteriore dei condili femorali o testa humeral è seduto sul vetro (Figura 1).
Nota: Fissare un applicatore di legno lunghezza mm 10 (diametro = 2 mm) per lato distale dell' Omero usando la colla del cianoacrilato prima di posizionarlo sul dispositivo al fine di stabilizzare il campione su una superficie piatta. Per una descrizione dettagliata della piattaforma di test meccanica vedere complementare File 1: sezione 1. - Idratare il provino con HBSS e posizionare il dispositivo con il campione su un microscopio a fluorescenza.
- Immagine i chondrocytes articolari macchiato con calceina (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 495/515 nm) prima applicazione (baseline) del carico sotto un microscopio a fluorescenza con un 4 X asciugare la lente (NA = 0.13). Regolare le impostazioni di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine.
- Applicare il carico meccanico in cima l'esemplare tale che la cartilagine articolare è compresso contro il vetro di copertura.
- Per il carico statico, applicare un carico statico prescritto (ad esempio, 0,5 N) in cima l'esemplare (femore o Omero). Tenere il carico per 5 min e poi rimuoverlo.
- Per impatto, applicare un'energia di impatto prescritto (ad es., 1 mJ) sul campione facendo cadere un dispositivo d'urto cilindrica di peso noto (ad es., 0,1 N) da un'altezza prescritta (ad es., 1 cm). Rilasciare il carico 5 s dopo l'impatto.
Nota: Il peso del dispositivo d'urto (mg) e l'altezza prescritta (h) può essere convertito in energia di impatto (E) usando la seguente equazione: E = mgh.
- Incubare il campione in PI macchiatura soluzione per 5 min a temperatura ambiente.
- Immagine i chondrocytes articolari macchiato con calceina e PI (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 535/617 nm) con un microscopio a fluorescenza (Figura 2).
5. analisi dei dati
- Quantificare l'area di celle feriti/morti a causa del regime di carico meccanico applicato.
- Aprire le micrografie della superficie articolare acquisite prima e dopo l'applicazione del carico meccanico in ImageJ18.
- Combinare le immagini in uno stack.
- Impostare la scala delle immagini basato sulla risoluzione dell'immagine.
- Utilizzare lo strumento poligono per definire l'area dove le cellule sono diventato calceina-negativo (perdita di fluorescenza verde) e PI-positivo (guadagno di fluorescenza rossa). Queste cellule sono considerate essere ferito o morto.
- Determinare l'area di celle feriti/morti utilizzando lo strumento di misura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sei diversi applicati protocolli di carico (carico statico: 0,1 N, 0,5 N e 1 N per 5 min; e carico di impatto: 1 mJ, mJ 2 e 4 mJ) riproducibile indotto quantificabili aree localizzate di lesione delle cellule nella cartilagine femorale e humeral ottenuta da 8-10-settimana-vecchio (di topi BALB/c Figura 2). D'importanza, l'estensione spaziale della ferita di condrociti su superficie articolare è stato misurato rapidamente e facilmente in ImageJ. Risultati rappresentativi dimostrano che la vulnerabilità meccanica dei chondrocytes articolari fu influenzata dal carico di ampiezza e impatto di intensità. In particolare, maggiore carico magnitudo e intensità di impatto più elevate significativamente aggravato l'estensione spaziale della lesione delle cellule in entrambi i femori e degli omeri (Figura 3).
Figura 1 : Rappresentazione schematica del dispositivo test meccanico personalizzato. (un) dispositivo assemblato con il dispositivo d'urto cilindrico utilizzato per applicare prescritto carichi meccanici e/o energie di impatto di un esemplare. Il dispositivo viene visualizzato senza un esemplare. (b) rappresentazione schematica dell'esperimento. Controllo statico (ad es., 0,1 N) e/o carico di impatto (ad es., 1 mJ) può essere applicato sopra il campione dissecato tale che la cartilagine articolare è compresso contro il vetro di copertura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rappresentanza Micrografo della superficie articolare dopo carico meccanico pregiudizievole. Micrografo rappresentativo del condili femorali superficiali su (un) distale articolari e carico (b) la testa humeral dopo pregiudizievole meccanica (impatto [1 mJ] e statico caricamento [1 N], rispettivamente). Celle di colore verde vitale sono macchiate chondrocytes con le membrane delle cellule intatte, mentre nuclei rossi indicano le cellule danneggiate con le membrane cellulari permeabilized. (c) Zoomed-in vista della zona delle cellule feriti/morte (contorni gialli) sulla superficie articolare della testa omerale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Area delle cellule feriti/morte. Area delle cellule feriti/morti sulla superficie articolare dei condili femorali distali (a, b) e la testa dell'omero (c, d) dopo (a, c) statica (0,1 N, 0,5 N e 1 N; n = 6 per gruppo) e (b, d) impatto (1 mJ, mJ 2 e 4 mJ; n = 6 per ogni gruppo) di caricamento. Tutti gli esemplari della cartilagine-su-osso sono stati ottenuti da topi BALB/c per 8-10 settimane vecchio femminili. Sono dati media + deviazione standard; parentesi quadre denotano la significatività statistica a α = 0.05 determinato mediante analisi della varianza (ANOVA) prova con i confronti post hoc di Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementari 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I metodi sopra descritti sono stati impiegati con successo visualizzare praticabile e feriti/morti in situ chondrocytes articolari dalle articolazioni del mouse dopo prescritto impatti o carichi meccanici. In particolare, siamo stati in grado di analizzare la vulnerabilità meccanica dei condrociti all'interno della cartilagine articolare completamente intatto da due diverse articolazioni sinoviali: l'articolazione del ginocchio (femore distale) e spalla (Omero). I nostri risultati rappresentativi indicano che l'estensione spaziale della lesione delle cellule sulla superficie articolare dipende sensibilmente intensità di ampiezza e impatto del carico (Figura 3). D'importanza, l'utilizzo di questo metodo facilita le indagini della risposta cellulare a carico meccanico in condizioni fisiologicamente rilevanti. Vale a dire esso consente il test della cartilagine articolare su un intatto congiunta sotto fisiologico e supraphysiological carica (vedere complementare File 1: sezione 2).
Data la curva di apprendimento ripida nell'eseguire le dissezioni delle articolazioni sinoviali murine e sfide nel preservare praticabile in situ condrociti alla linea di base, alcune modifiche di protocollo e risoluzione dei problemi può essere richiesta. Il maggior rischio di dannosi chondrocytes articolari durante la dissezione si verifica durante le fasi 2.3.5 attraverso 2.3.10 e 2.4.5 attraverso 2.4.7. Per ridurre lesioni/morte cellulare durante le dissezioni, il ricercatore dovrebbe evitare il contatto tra strumenti chirurgici (per es., il bisturi per tagliare il tessuto o il forcipe del gioielliere quando si rimuove il tessuto molle) e la superficie articolare del campione . Tuttavia, toccando la superficie articolare con un guanto induce piccolo infortunio/morte cellulare. Al fine di migliorare la vitalità delle cellule della linea di base, potrebbe anche essere necessario ridurre la quantità di tessuto molle rimosso dal giunto. Inoltre, utilizzando gli strumenti più sottili ridurrà generalmente morte cellulare indotta da dissezione. In definitiva, per rigorosamente confermare l'assenza di dissezione-associati danni dei chondrocytes articolari al basale, si consiglia di macchiare gli esemplari con sia coloranti di permeabilità (calceina e PI, prima del carico) specialmente mentre il ricercatore è acquisire familiarità con la procedura di dissezione (vedere Supplemental File 1: sezione 3).
Date le piccole dimensioni del giunto del mouse e la manipolabilità genetica del genoma del topo, modelli murini offrono molteplici vantaggi rispetto ai grandi modelli animali per studiare la vulnerabilità dei chondrocytes articolari a carico meccanico. Tuttavia, alla conoscenza authors', nessuno studio precedentemente è stati condotti per quantificare la lesione/morte di in situ chondrocytes articolari dovute a carichi meccanici di cartilagine murina intatta. Gli investigatori in genere utilizzano espianti rimossi dai giunti di grandi modelli animali per indagare le dimensioni della morte delle cellule a causa di danno meccanico3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. al contrario, modelli murini facilitano 1) visualizzazione di quasi tutta la superficie articolare su un osso dato; e 2) analisi di attuabilità di condrociti post-carico o post-impatto in giunti intatti senza compromettere le condizioni al contorno native. Inoltre, mentre compressi, i campioni del mouse generano sostanzialmente più piccole aree di contatto rispetto ai grandi modelli animali; Pertanto, sottolinea è drammaticamente superiori nei grandi modelli animali per un dato carico grandezza. Quindi, la lesione delle cellule può essere indotta da più piccoli carichi. Inoltre, modelli murini facilitano la ricerca sulla degenerazione della cartilagine e, in particolare, l'osteoartrite, come questa malattia può essere facilmente indotta in topi con genetica19,20,21, 22, dietetico23,24 o manipolazioni chirurgiche25,26,27,28. Inoltre, l'artrosi spontaneo si verifica in diversi ceppi di topi compresi BALB/c e C57BL/629,30.
In nostri dati rappresentativi, abbiamo usato macchie di redditività (live/dead) per quantificare le lesioni/morte cellulare 5 min dopo la rimozione del carico meccanico. Riconosciamo che questi esperimenti non possono discriminare ferite (cellule con membrane rotte temporaneamente) dalle cellule morte (cellule con membrane di rotture permanentemente). Cioè, le cellule che sono calceina negativo e PI positivo-indicando che la membrana era precedentemente permeabilizzate-maggio riparazione loro membrane nel corso del tempo una scala che va da secondi a parecchi minuti31. Infatti, in una serie separata di esperimenti, abbiamo determinato che la frazione di cellule "feriti" che sopravvivono trauma meccanico è piccola (~ 5%) ma significativa (vedere complementare File 1: sezione 4). Di conseguenza, live/dead macchiatura è una misura diretta di integrità della membrana che non è sempre indicativa di attuabilità delle cellule. In particolare, PI-positivo e negativo calceina cellule nel modo più appropriato sono definite come "feriti", dove la ferita è definita come una (potenzialmente temporanea) perdita di integrità della membrana del plasma dovuto il trauma meccanico. Riconosciamo anche che i nostri dati rappresentativi probabili riflettono la morte delle cellule (necrosi) solo immediato. Imaging esemplari ai successivi intervalli di tempo (ad es., 48 ore dopo la rimozione del carico) dovrebbe permettere una quantificazione di entrambi necrotico e morte apoptotica delle cellule.
Diverse limitazioni devono essere considerati quando si utilizzano questi metodi. Nei nostri esperimenti prova per questo manoscritto, abbiamo usato 8-10-settimane-vecchi topi BALB/c femminili per dimostrare le capacità della piattaforma di test (Figura 3). Tuttavia, dovuto le alterazioni evidenti nella densità delle cellule in femori di più vecchi topi, la valutazione della lesione indotta da carico delle cellule diventa più difficile (anche se fattibile) in età superiore femori (tasso di successo = 40%). Al contrario, senza evidenti alterazioni nella densità delle cellule su omeri sono stati osservati in topi C57BL/6 61-81-settimana-vecchio (vedere complementare File 1: sezione 5), quindi rendendo la piattaforma di prova utile per età compresa tra 8-81 settimane. Un'altra limitazione è che il metodo utilizzato per analizzare l'estensione spaziale della lesione delle cellule solo sulla superficie articolare dei condili femorali e testa dell'omero. Tuttavia, il metodo potrebbe essere esteso per analizzare l'estensione spaziale di profondità-dipendente della lesione delle cellule attraverso l'uso di microscopia confocale a scansione laser. Si noti che quest'ultimo metodo richiede l'utilizzo di attrezzature più costose, più lungo tempo di acquisizione immagine e analisi più coinvolto e che richiede tempo. Infine, anche se la posizione di contatto tra la cartilagine articolare e il vetro di copertura era fisiologicamente rilevante per topi32,33, questa posizione non era molto vario. Tuttavia, la nostra piattaforma di test consente variazioni della posizione Contatta se il femore o Omero è afferrato con un'armatura rotante.
In conclusione, abbiamo sviluppato un in vitro murino ferita modello che consente l'applicazione di carichi meccanici controllati e/o impatti sulla superficie articolare della cartilagine articolare intatta. Questo modello permette la visualizzazione dei chondrocytes articolari fluorescente contrassegnati in rapido e in tempo reale unica basata su immagine analisi di lesioni/morte cellulare. D'importanza, gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, condizioni ambientali diverse o diverse manipolazioni genetiche sulla vitalità dei condrociti breve - e/o a lungo termine possono essere testati utilizzando questa metodologia. Così, la nostra piattaforma fornisce uno strumento per interrogare i domande di scienza di base e i bersagli terapeutici schermo relazionati alla vulnerabilità meccanica dei condrociti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Richard Waugh e Luis Delgadillo per l'uso generoso di loro pH-metro e Osmometro. Inoltre, gli autori vorrei ringraziare Andrea Lee per contribuire allo sviluppo iniziale del sistema collaudo meccanico. Questo studio è stato finanziato dal NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
