Summary
在这里, 我们描述了鸡初囊细胞的分离, 从囊中, 感染的文化和感染的囊腔病病毒的细胞, 以及病毒复制的量化。
Abstract
传染性囊内病病毒 (IBDV) 是 birnavirus 对家禽业具有重要经济意义的一种。病毒感染 B 细胞, 导致感染的鸟类发病率、死亡率和免疫抑制。在本研究中, 我们描述了鸡初囊细胞从 IBDV 的分离, 细胞的培养和感染, 以及病毒复制的量化。添加鸡 CD40 配体显著增加细胞增殖四个超过六天的文化和显著增强细胞活力。两株 IBDV, 细胞培养适应菌株, D78, 和一个非常致命的菌株, UK661, 复制良好的前体细胞培养。该模型将用于确定细胞对 IBDV 感染的反应, 并允许减少 IBDV 病机研究中使用的受感染鸟类的数量。该模型还可以扩展到包括其他病毒, 并可应用于不同种类的鸟类。
Introduction
全球家禽业对于为不断扩大的人口获取足够的粮食至关重要。然而, 免疫抑制是对粮食安全和受影响鸟类福利的威胁, 是对该行业的一个重大经济挑战。大多数鸡免疫抑制的病例是由免疫抑制病毒感染引起的, 最负责损害获得性免疫的人对 T 和 B 淋巴细胞有1的取向。在鸟类中, 大多数 B 细胞位于被称为囊腔 (BF) 的器官内。B 细胞易受感染的几种免疫抑制病毒, 包括那些导致裂解, 如 IBDV 和马立克氏病病毒 (MDV), 以及导致转化, 如禽白血病病毒 (ALV) 和 reticuloendotheliosis 病毒 (转速)。
为了制定更好的控制这些感染的策略, 必须对病毒与 B 细胞的相互作用进行表征。然而, 当 B 细胞从鸟类中移除时, 它们在2的体外培养中无法生存, 这使得很难对 IBDV 与鸡 B 细胞的相互作用进行透彻的分析, 或 ALV 或加速感染后的早期事件。因此,在体内3、4、5、6、7、8、9, 研究了许多宿主细胞病毒相互作用, 10。虽然这些研究是有信息的, 他们涉及使用受感染的禽类疾病, 可能是严重的。
CD40 配体是诱导 B 细胞增殖11的分子。通过对鸡 CD40L (chCD40L) 基因编码的鉴定, 设计了一种可溶性融合蛋白, 当添加到培养基中时, 诱导鸡原代 B 细胞增殖12。在 2015年, 以这种方式培养的 B 细胞支持 MDV2的复制, 在 2017年, 我们和其他人发现, 用 chCD40L 刺激的原法氏囊细胞可以作为研究 IBDV 复制13,14的模型。在这里, 我们描述了鸡初囊细胞的分离和培养, IBDV 细胞的感染, 以及病毒复制的量化。虽然我们描述的方法在高炉的情况下, 这可以用于分离和培养细胞从不同的淋巴器官。
Protocol
所有与动物有关的程序必须事先得到伦理上的批准。在我们的机构, 所有程序都按照《英国动物 (科学程序) 法》 (1986) 在内政部设立、个人和项目许可的情况下执行, 经内部动物福利和道德审查委员会 (AWERB) 批准。
1. chCD40L 的制备
- 培养 HEK 293-msCD8-CD40L 细胞, 稳定地表达在1x 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中的可溶性 chCD40L 结构, 辅以10% 热灭活 (hi) 胎小牛血清 (FCS) 和1µg/毫升嘌呤霉素37°c 的大气中含有 5% CO2。
注: 在签署适当的物质转让协议后, Pirbright 研究所可获得这些细胞。 - 汇合时, 将细胞分成1:5 密度。收集上清 (含可溶性 chCD40L 构造) 每次细胞分裂, 离心 400 x g 5 分钟, 以去除细胞碎片, 并存储在4摄氏度。
- 当500毫升的上清已收集, 池的液体和过滤-消毒它通过一个0.2 µm 过滤器。
- 根据制造商的说明, 使用离心蛋白浓缩器将上清液浓缩为 10 K 的分子重量截止。从每一柱上提取浓缩的清液, 将其聚集在一起, 通过0.22 µm 注射器过滤器将其消毒。
- 确定在实验中使用的最终浓度, 通过连续稀释 1x Iscove 修饰 Dulbecco 培养基 (IMDM) 中的 chCD40L 溶液 (在步骤2.4 中描述), 并在稀释存在的情况下培养初级法氏囊细胞。确定每个单元的数量和百分比, 每天最多一周。
注意: 细胞增殖和生存能力足够的最低浓度是在化验中使用的浓度。这可能是介于1:20 和1:50 之间。
2. 鸡初囊室分离液的制备
- 用钙 (ca) 加入10毫升的 10x HBBS, 在90毫升的不育 H2O 和0.47 µL 7.5% NaHCO3的情况下, 制备1x 汉克斯的平衡盐溶液 (HBBS)。
- 用8毫克/毫升在 1x HBBS 中制备胶原酶, 用 Ca 过滤-通过0.2 µM 过滤器消毒溶液。
注: 最好准备5毫升整除数, 并将其冻结在-20 摄氏度。 - 准备 1x RPMI 培养基辅以5% 喜 FCS。将介质存储在摄氏4摄氏度。
- 准备 1x 500 毫升的 IMDM 补充与 8% hi FCS, 2% 喜鸡血清, 50 毫米β巯基乙醇, 50 µL 胰岛素转铁蛋白-亚硒酸钠, 1% 青霉素/链霉素。将介质存储在摄氏4摄氏度。
注: 事先准备好上述解决方案。 - 准备 1x HBBS 与 Ca. 在冰上储存溶液。
- 在不含钙的情况下, 加入10毫升 10x HBBS, 不含 ca 到90毫升的无菌 H2O, 0.47 µL 7.5% NaHCO3, HBBS, 并在最终浓度为10毫米的 EDTA 上制备1x。把溶液储存在冰上。
- 将5毫升胶原酶的溶液添加到13毫升的 HBBS 中, 用 Ca 制备1x 胶原酶溶液, 共18毫升。把溶液储存在冰上。
注: 在实验当天准备步骤2.5–2.7 中提到的解决方案。
3. 清除 (BF) 囊
- 后方和孵化鸡在一个适当的, 批准的设施和人道地剔除他们在2–3周的年龄。
注: 使用研究所批准的剔除方法。 -
使用无菌技术收集每只鸡的 BF。
注: 使用机构中的协议。- 将胴体置于背卧床, 并对腹部和胸腔覆盖的皮肤和羽毛进行消毒, 溶液中有70% 乙醇, 稀释在水中。
- 用灭菌的手术刀或剪刀在下腹部做腹中线切口。
- 定位的囊腔, 这是连接到骶部的结肠, 颅骨到泄殖腔。
- 使用灭菌的镊子和剪刀, 切开无结肠的法氏囊。注意避免刺穿内脏。
- 把风琴放在冷 PBS 里, 把它转移到实验室冰上。
注意: 在器官收割后应尽快隔离原细胞。
4. 鸡初囊细胞的分离
- 在微生物安全柜中工作, 在30毫升的冷 PBS 中至少清洗高炉3x。
- 将组织转移到培养皿 (直径92毫米, 高度21毫米), 并加入5毫升的1x 胶原酶 D 溶液。
- 使用无菌剪刀或手术刀刀片, 将 BF 切成直径小于5毫米的碎片。
- 以周期性温和搅拌30分钟的37摄氏度孵育组织。
注: 胶原酶溶液将开始消化组织。 - 使用无菌的巴斯德吸管, 反复吸入混合物, 以鼓励组织的解体。如有必要, 将组织切成小块。
- 添加另5毫升的1x 胶原酶 D 溶液的组织和孵化它在37°c 与周期性的温和搅拌, 另30分钟。
- 重复步骤4.6 和 4.7, 直到组织完全消化。
注: 将有小颗粒, 不会进一步溶解。 - 通过细胞悬浮通过100µm 细胞过滤器到20毫升 1x HBBS 没有钙。
- 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。
- 在10毫升的 1x RPMI 与5% 的 FCS 中, 丢弃上清和并用重悬颗粒。
- 要么覆盖10毫升的细胞悬浮在5毫升的密度梯度介质上含有聚蔗糖和钠葡或衬底5毫升密度梯度介质10毫升细胞悬浮。确保两者之间有明确的接口。
- 离心机覆盖在 900 x g 20 分钟在4摄氏度。降低或拆卸离心机断裂。
注: 细胞应在细胞介质与密度梯度介质之间的界面形成一个波段。 - 使用无菌的巴斯德吸管, 取出细胞并放置在寒冷的 PBS。通过离心 400 x g 5 分钟, 并 resuspending 在冷 PBS 中, 洗涤细胞3x。
5. 鸡初囊细胞培养
- 离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 并并用重悬他们在1x 完整的 IMDM。
- 整除细胞悬浮液, 将其加入到台盼蓝溶液中, 并计算排除台盼蓝的可行细胞数。确定单元格数和生存率百分比。
- 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟和并用重悬它在完全 IMDM 补充以1:20 稀释鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞/毫升。滴定含有 chCD40L 的浓缩清液, 以确定最佳稀释度, 这很可能位于1:10 到1:50 的范围内。
- 培养 96-或24井板的细胞在37°c 为 48–72 h. U 底96井板比平底板材优选。
注: 细胞也可以培养在40°c
6. IBDV 鸡初囊细胞感染
- 48–72 h 后隔离, 解冻整除的病毒, 漩涡的样本, 并储存在冰上。
- 并用重悬主要的法氏囊细胞, 采取10µL 整除的细胞悬浮, 添加到10µL 的台盼蓝溶液, 并确定细胞数量和百分比的可行性。
- 稀释病毒在1x 完全 IMDM 到适当的感染多样性 (语言), 使病毒接种和漩涡。
- 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。
- 取出上清, 并用重悬病毒接种中的细胞。
- 将细胞悬浮在37摄氏度时孵育为1小时, 周期性搅拌。
- 离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 删除病毒接种, 并清洗细胞在1x 完整的 IMDM 媒体。
- 离心细胞悬浮在 400 x g为5分钟, 去除上清, 并且并用重悬细胞在完全 IMDM 媒介补充与鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞每毫升。
- 培养细胞在96或24井板在37°c。
注: 细胞也可以培养在40°c
7. 鸡初囊细胞 IBDV 复制的量化研究
- 在需要的时间点感染后, 并用重悬细胞, 转移他们到适当的管, 离心他们在 400 x g为5分钟和收获上清为病毒滴定法由斑块化验或 TCID50化验作为每芦苇-明奇方法15。
- 清洗1毫升 PBS 中的细胞, 并准备他们为染色与特定的抗体 IBDV, 或提取 RNA 使用适当的试剂盒 (按照制造商的指示) 和执行反向转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 用底漆特异的 IBDV 基因 (向前, GAGGTGGCCGACCTCAACT;反转, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)。模拟感染的细胞培养应作为一种控制。
Representative Results
鸡 CD40L 在鸡初囊细胞中的培养
当鸡初囊细胞在可溶性 chCD40L 的存在下培养时, 细胞数量从 9.02 x 105增加到 3.63 x 10 6, 每毫升6天, 与缺席时相比 (p < 0.05) (图 1A)。细胞活力也得到了显著改善, 例如从25% 天3后的文化, 在没有 chCD40L 到48% 的存在 chCD40L (p < 0.05) (图 1B)13。
鸡初囊细胞可以支持复制的细胞培养适应和非常毒株的 IBDV
模拟感染和受感染的细胞培养是固定的18小时感染后, 标记为抗 IBDV VP2 单克隆抗体和共轭488的二级抗体, 复染 DAPI。感染细胞在细胞核周围有绿色荧光的证据 (图 2A), 与细胞质中的 IBDV 存在一致。这是明显的两个菌株的 IBDV, 细胞培养适应菌株, D78, 和一个非常致命的应变, UK661 (图 2A)。在5、18、24和 48 h 感染后中, RNA 是从受感染的培养物中提取出来的, 并受 qPCR 与 IBDV VP4 基因的一个保守区域的底漆特异。VP4 的表达首先归一化为保留基因 TBP, 然后在ΔΔCt 分析中表达为相对于模拟样本的折变。IBDV VP4 表达式增加到16603个拷贝在 48 h 感染后与 D78 和38632拷贝在 48 h 感染后与 UK661。同时, 这些数据表明, 鸡初囊细胞可以支持复制细胞培养适应和非常毒 IBDV 菌株13。
图 1: 鸡 CD40L 的存在可以培养鸡肉的初级囊室细胞.鸡初囊细胞在 chCD40L 的存在或缺失 (分别为黑条和白条) 培养。(a) 活细胞的数量和 (B) 在指定的时间点感染后确定可行细胞的百分比。所显示的数据至少代表了三次复制实验, 误差线代表了平均值的标准偏差, 并且在每个时间点使用配对学生的t检验来确定统计意义, * p <0.05. 该数字已在达利奇等人的许可下修改。13。
图 2: 鸡初囊细胞可以支持复制的细胞培养适应和非常毒株的 IBDV.(A) 鸡初级囊室细胞被模拟感染或感染 D78 或 UK661, 每种文化的样本是固定的, 标记和成像: IBDV VP2, 绿色;原子核蓝色缩放条 = 7 µm. (B) 在指示的时间点感染后提取 RNA, 反向转录, 并通过定量 PCR 扩增 IBDV VP4 基因的保守区域。VP4 拷贝数的对数10倍的变化被规范化为 TBP 的管家基因, 并表达相对于模拟感染的样本, 根据 2-ΔΔCT方法。所示数据至少代表三个复制实验, 误差线表示平均值的标准偏差。这一数字已在达利奇等的许可下修改。13。
Discussion
在本研究中, 我们描述了鸡初囊细胞在可溶性 chCD40L 存在下的成功培养, 证明这些细胞能够支持减毒菌株的复制和 IBDV 的剧毒菌株。这个前体模型可以用来确定细胞对 IBDV 感染13的反应, 它在体内和体外研究中具有明显的优势。
在收割 BF 时, 不穿刺肠道是至关重要的, 以避免孤立的囊室细胞的细菌污染。此外, 重要的是要尽快隔离的主要细胞后, 器官的收获, 以限制细胞死亡。使用 chCD40L 的需要是技术的局限;然而, Soubies等人所做的工作表明, 使用佛波 12-酯 13-醋酸酯 (PMA) 延长法氏囊细胞的生存能力, 而不是 chCD40L14可能使该模型被更多的实验室采用。上面概述的协议确定了 chCD40L 的最佳浓度, 通过培养的主要 B 细胞在连续稀释的分子浓度和观察细胞的增殖和生存能力。对该协议的一个潜在的修改可能是净化 chCD40L 分子, 并添加特定浓度的细胞培养基, 以避免分批到批次的变化。
在活体研究表明, 继 IBDV 感染后, 参与炎症细胞因子反应的基因表达增加, I 型干扰素反应, 和凋亡在 BF5,9,10.然而, 继感染后, 有炎症细胞和效应 T 细胞涌入 BF, 与被感染的 B 细胞群体相比, 其表达的基因差异9。因此, 很难解释感染细胞对 IBDV 的反应。为了解决这一问题, 一些研究小组的特点是在文化16、17、18、19、20中感染 IBDV 细胞的转录反应。这些体外研究具有定义良好的 mois 》杂志和时间点感染后的优点。然而,体外研究通常是以成纤维细胞16、17、20或树突状细胞18为特征的。虽然对宿主细胞 IBDV 相互作用提供了一些见解, 但目前的看法是, B 细胞的感染对 IBDV 的发病机制至关重要, 因此数据的相关性不能 overinterpreted。在我们的前体囊细胞培养模型之前, 只有一项研究表明 B 细胞对 IBDV 感染的细胞反应为19;然而, 这项研究利用了一个永生化的 B 细胞系, 因感染 ALV 而改变, 限制了可以做出的结论。相比之下, 这里描述的 IBDV 感染的体内模型允许研究人员保留体外研究的优点, 如定义的 mois 》杂志和时间点, 同时研究病毒与其相关宿主细胞的相互作用。由于主要的法氏囊细胞是从未感染的 BF 组织获得, 没有炎症或 T 细胞存在, 我们已经证明了流式细胞术 (使用标准条件), 在 chCD40L 刺激后, 97% 的细胞人口是积极的B 单元格标记 Bu-1 (未显示数据)。鉴于3% 的细胞是 Bu-1 阴性, 这将是有趣的, 以确定这些细胞是否会感染 IBDV 和探索他们的基因表达和对发病机制的贡献。
我们预计,前体鸡原囊细胞培养模型也可以扩大, 以研究宿主细胞-病毒相互作用的其他 B 细胞热带病毒感染鸡, 如 ALV 或转速, 也可以扩大到其他禽类 (例如, 鸭子或火鸡)。培养原法氏囊细胞的能力, 也为研究这些病毒引起的发病机制和免疫抑制的可能性开辟了可能, 而不需要感染鸟类。正如在体内研究导致严重的发病率, 这将有重大影响的替代, 改良和减少使用动物的研究。
总之, 在这里描述的前体鸡原发囊细胞培养模型有可能扩大对鸟类 B 细胞热带病毒如何与宿主细胞相互作用的理解, 同时减少在体内使用的鸟类数量感染研究。这些技术可以应用于多种淋巴器官, 多种病毒, 以及潜在的多种鸟类, 使它成为一个有吸引力的模型, 可以促进鸟类病毒学和免疫学领域。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Pirbright 研究所的动物服务小组, 他们在孵化、饲养和扑杀鸟类方面的专长, 以及卡罗琳·霍尔特在灌装的专门知识, 除去了该囊。该基金通过生物技术和生物科学研究理事会 (BBSRC) 通过赠款 BBS/E/I/00001845 提供资金, 成交由 BBSRC通过奖学金 BBS/E/I/00002115 提供资金, 而戒酒基金通过国家中心为通过赠款 NC/R001138/1 替代、提炼 & 减少研究中的动物 (NC3Rs)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
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