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Immunology and Infection

संक्रामक Bursal रोग वायरस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व Vivo चिकन प्राथमिक Bursal-सेल संस्कृति मॉडल रोगजनन

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58489
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1The Pirbright Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम Fabricius के बर्सा से चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन, संस्कृति और संक्रामक bursal रोग वायरस के साथ कोशिकाओं के संक्रमण, और वायरल प्रतिकृति के ठहराव.

Abstract

संक्रामक bursal रोग वायरस (IBDV) पोल्ट्री उद्योग के लिए आर्थिक महत्व का एक birnavirus है । वायरस बी कोशिकाओं को संक्रमित, रुग्णता, मृत्यु दर, और संक्रमित पक्षियों में प्रतिरक्षादमन के कारण । इस अध्ययन में, हम Fabricius के बर्सा से चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन, संस्कृति और IBDV के साथ कोशिकाओं के संक्रमण, और वायरल प्रतिकृति के ठहराव. चिकन CD40 ligand के अलावा काफी संस्कृति के छह दिनों में सेल प्रसार चौगुना वृद्धि हुई है और काफी बढ़ाया सेल व्यवहार्यता । IBDV के दो उपभेदों, एक सेल-संस्कृति अनुकूलित तनाव, D78, और एक बहुत विषमय तनाव, UK661, पूर्व vivo सेल संस्कृतियों में अच्छी तरह से दोहराया । इस मॉडल का निर्धारण कैसे कोशिकाओं IBDV संक्रमण का जवाब और IBDV रोगजनन अध्ययन में इस्तेमाल संक्रमित पक्षियों की संख्या में कमी की अनुमति होगी में उपयोग की जाएगी । मॉडल भी अंय वायरस को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है और पक्षियों की विभिंन प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

वैश्विक कुक्कुट उद्योग के लिए एक मानव आबादी के विस्तार के लिए पर्याप्त भोजन सुरक्षित आवश्यक है । हालांकि, प्रतिरक्षादमन खाद्य सुरक्षा और प्रभावित पक्षियों के कल्याण के लिए खतरा है और उद्योग के लिए एक महत्वपूर्ण आर्थिक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । मुर्गियों में प्रतिरक्षादमन के मामलों के बहुमत immunosuppressive वायरस के साथ संक्रमण की वजह से कर रहे हैं, एक tropism टी और बी लिम्फोसाइटों1के लिए होने का अधिग्रहण प्रतिरक्षा के लिए सबसे अधिक जिंमेदार के साथ । पक्षियों में, बी कोशिकाओं के बहुमत एक Fabricius (BF) के बर्सा के रूप में जाना जाता अंग के भीतर स्थित हैं । बी कोशिकाओं को कई immunosuppressive वायरस के साथ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, उन है कि कारण सहित lysis, जैसे IBDV और ब्रांडों के रोग वायरस (MDV), और उन है कि कारण परिवर्तन, एवियन leukosis वायरस (ALV) और reticuloendotheliosis वायरस के रूप में ( REV) ।

इन संक्रमणों को नियंत्रित करने के लिए बेहतर रणनीतियों का विकास करने के लिए, यह चिकन बी कोशिकाओं के साथ वायरस की बातचीत को चिह्नित करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, जब बी कोशिकाओं को एक पक्षी से हटा रहे हैं, वे अच्छी तरह से पूर्व vivo संस्कृति2में जीवित नहीं है, यह मुश्किल चिकन बी कोशिकाओं के साथ IBDV की बातचीत का एक गहन विश्लेषण करने के लिए, या ALV या REV संक्रमण के बाद जल्दी घटनाओं कर रही है । नतीजतन, कई मेजबान सेल वायरस बातचीत vivo3,4,5,6,7, 8,9, मेंअध्ययन किया गया है 10. हालांकि इन अध्ययनों जानकारीपूर्ण रहे हैं, वे संक्रमित पक्षियों जो रोगों से ग्रस्त है कि गंभीर हो सकता है का उपयोग शामिल है ।

CD40 ligand एक अणु है कि बी सेल प्रसार11लाती है । जीन एंकोडिंग चिकन CD40L (chCD40L), एक घुलनशील फ्यूजन प्रोटीन की पहचान के बाद इंजीनियर है कि, जब संस्कृति मीडिया के लिए कहा, चिकन प्राथमिक बी कोशिकाओं के प्रसार पूर्व vivo12प्रेरित किया गया । २०१५ में, बी इस फैशन में प्रसंस्कृत कोशिकाओं MDV2 की प्रतिकृति और २०१७ में समर्थन पाया गया, हम और दूसरों को पाया कि प्राथमिक bursal chCD40L के साथ उत्तेजित कोशिकाओं IBDV प्रतिकृति13,14के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ, हम अलगाव और संस्कृति का वर्णन चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं, IBDV के साथ कोशिकाओं के संक्रमण, और वायरल प्रतिकृति के ठहराव. यद्यपि हम BF के संदर्भ में विधि का वर्णन है, यह अलग और विभिंन लसीकावत् अंगों से संस्कृति कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है ।

Protocol

पशुओं के साथ सभी प्रक्रियाओं नैतिक रूप से अग्रिम में अनुमोदित किया जाना चाहिए । हमारे संस्थान में, आंतरिक पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा बोर्ड (AWERB) के अनुमोदन के बाद गृह कार्यालय स्थापना, व्यक्तिगत और परियोजना लाइसेंस के तहत UK पशु (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम १९८६ के अनुसार सभी प्रक्रियाएं निष्पादित की जाती हैं ।

1. chCD40L की तैयारी

  1. संस्कृति HEK २९३-msCD8-CD40L कोशिकाओं है कि छुरा एक घुलनशील chCD40L 1x रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान में निर्माण एक्सप्रेस (RPMI) मध्यम 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय (हाय) भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 1 µ g/mL puromycin में ३७ ° c 5% सह युक्त वातावरण में 2.
    नोट: इन कोशिकाओं को उपयुक्त सामग्री हस्तांतरण समझौते के हस्ताक्षर के बाद Pirbright संस्थान से उपलब्ध हैं ।
  2. एक 1:5 घनत्व पर कोशिकाओं भाजित जब धाराप्रवाह । supernatant इकट्ठा (घुलनशील chCD40L निर्माण युक्त) हर बार कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं, यह 5 मिनट के लिए ४०० x g पर बनाने के लिए सेलुलर मलबे को हटाने, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  3. जब supernatant के ५०० मिलीलीटर एकत्र किया गया है, पूल तरल और फिल्टर-यह एक ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से निष्फल ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 10 K के एक आणविक वजन कटऑफ के साथ केंद्रापसारक प्रोटीन संकेंद्रों का उपयोग कर supernatant ध्यान केंद्रित । प्रत्येक कॉलम से केंद्रित supernatant निकालें, यह एक साथ पूल, और फिल्टर-यह एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा निष्फल.
  5. chCD40L समाधान में 1x Iscove के संशोधित Dulbecco के मध् यम (IMDM) (चरण २.४ में वर्णित) और संवर्धन प्राथमिक bursal कोशिकाओं की मौजूदगी में कमजोर द्वारा प्रयोग में लाने के लिए अंतिम एकाग्रता का निर्धारण करते हैं । एक सप्ताह तक के लिए दैनिक कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता का निर्धारण ।
    नोट: कम एकाग्रता जहां सेल प्रसार और व्यवहार्यता पर्याप्त है एकाग्रता के लिए परख में उपयोग है । यह 1:20 और 1:50 के बीच होने की संभावना है ।

2. चिकन प्राथमिक Bursal सेल अलगाव के लिए समाधान की तैयारी

  1. तैयार 1x हैंक्स के साथ ' संतुलित नमक समाधान (HBBS) कैल्शियम (सीए) के साथ 10x HBBS के 10 मिलीलीटर से जोड़कर ९० मिलीलीटर बाँझ एच2ओ और ०.४७ µ एल के ७.५% NaHCO3.
  2. सीए के साथ 1x HBBS में 8 मिलीग्राम/एमएल में collagenase डी स्टॉक समाधान तैयार करें । फ़िल्टर-एक ०.२ µ एम फिल्टर के माध्यम से समाधान निष्फल ।
    नोट: यह 5 मिलीलीटर aliquots तैयार करने और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करने के लिए सलाह दी जाती है ।
  3. 1x RPMI मध्यम तैयार 5% हाय FCS के साथ पूरक । 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
  4. IMDM 8% हाय FCS, 2% हाय चिकन सीरम, ५० mM β-mercaptoethanol, ५० µ एल के साथ पूरक का 1x ५०० मिलीलीटर तैयार इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सोडियम-selenite, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin । 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
    नोट: पहले से उपर्युक्त सभी समाधानों को तैयार करें ।
  5. सीए के साथ 1x HBBS तैयार करें । बर्फ पर समाधान की दुकान ।
  6. सीए के बिना 10 मिलीलीटर HBBS के बाँझ ज2ओ, ०.४७ µ एल के ९० मिलीलीटर के लिए3मिमी, और 10 mM के एक अंतिम एकाग्रता में EDTA के बिना 10x HBBS को जोड़कर ca के लिए तैयार 1x । बर्फ पर समाधान की दुकान ।
  7. collagenase डी शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर के लिए सीए के साथ HBBS के 13 मिलीलीटर को जोड़कर 1x collagenase d समाधान तैयार 18 मिलीलीटर की कुल बनाने के लिए । बर्फ पर समाधान की दुकान ।
    नोट: प्रयोग के दिन पर चरण 2.5 – 2.7 में उल्लिखित समाधानों को तैयार करें ।

3. Fabricius (BF) के बर्सा का निष्कासन

  1. रियर और हैच मुर्गियों में एक उपयुक्त, अनुमोदित सुविधा और humanely उन्हें चुनना में 2 – 3 सप्ताह की उम्र.
    नोट: मुर्गियों के लिए संस्थान-अनुमोदित विधियों का उपयोग करें ।
  2. अपूतित तकनीकों का उपयोग कर प्रत्येक चिकन से BF ले लीजिए ।
    नोट: संस्था में स्थान में प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
    1. पृष्ठीय recumbency में लोथ प्लेस और त्वचा और ७०% इथेनॉल का एक समाधान के साथ पेट और छाती ओवरले पंख, पानी में पतला निष्फल ।
    2. एक निष्फल स्केलपेल या कैंची का उपयोग कर पेट के निचले में एक ventral midline चीरा बनाओ ।
    3. Fabricius के बर्सा का पता लगाएँ, जो बृहदांत्र के caudal अनुभाग से जुड़ा है, क्लोअका को कपाल ।
    4. निष्फल संदंश और कैंची का प्रयोग, Fabricius के बर्सा के बृहदांत्र से मुक्त काट दिया । पेट puncturing से बचने के लिए ध्यान रखना ।
  3. ठंडे पंजाबियों में अंग लगाएं और उसे बर्फ पर प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें ।
    नोट: प्राथमिक कोशिकाओं को अंग फसल के बाद जितनी जल्दी हो सके पृथक किया जाना चाहिए ।

4. चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं का अलगाव

  1. एक सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, BF ठंडा पंजाबियों के 30 मिलीलीटर में कम से 3x धो लो ।
  2. एक पेट्री डिश के लिए ऊतक स्थानांतरण (व्यास में ९२ मिमी, ऊंचाई में 21 मिमी) और 1x collagenase डी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. बाँझ कैंची या एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, BF के टुकड़ों में कट से कम 5 मिमी व्यास में.
  4. 30 मिनट के लिए आवर्ती कोमल आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक मशीन ।
    नोट: collagenase समाधान ऊतक पचाने के लिए शुरू हो जाएगा ।
  5. एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, बार-महाप्राण मिश्रण ऊतक के विघटन को प्रोत्साहित करने के लिए. यदि आवश्यक हो, ऊतक छोटे टुकड़ों में काट ।
  6. ऊतक के लिए 1x collagenase D समाधान के एक और 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक और 30 मिनट के लिए आवर्ती कोमल आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
  7. चरणों को दोहराएँ ४.६ और ४.७ जब तक ऊतक पूरी तरह से पच जाता है.
    नोट: छोटे granules है कि आगे भंग नहीं होगा ।
  8. सीए के बिना 1x HBBS के 20 मिलीलीटर में एक १०० µm सेल छलनी के माध्यम से सेल सस्पेंशन पास ।
  9. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  10. supernatant त्यागें और 5% FCS के साथ 1x RPMI के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  11. या तो polysucrose और सोडियम diatrizoate या बुनियाद 10 एमएल सेल निलंबन के नीचे घनत्व ढाल मीडिया के 5 मिलीलीटर युक्त घनत्व ढाल मीडिया के 5 मिलीलीटर के शीर्ष पर सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर ओवरले । सुनिश्चित करें कि दोनों के बीच एक स्पष्ट इंटरफेस है ।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ९०० x g पर ओवरले केंद्रापसारक । कम या हटाने के केंद्रापसारक तोड़ ।
    नोट: कोशिकाओं सेल मीडिया और घनत्व ढाल मीडिया के बीच अंतरफलक पर एक बैंड फार्म चाहिए ।
  13. एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, कोशिकाओं को हटाने और उन्हें ठंडे पंजाब में जगह. उंहें 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल 3x धो और उंहें ठंडा पंजाब में resuspend ।

5. चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं की संस्कृति

  1. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक और उंहें 1x पूरा IMDM में resuspend ।
  2. सेल निलंबन के एक aliquot ले लो, यह एक Trypan नीले समाधान में जोड़ें और व्यवहार्य कोशिकाओं है कि Trypan नीले बाहर की संख्या गिनती । कक्षों की संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता निर्धारित करें ।
  3. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक और यह पूरा IMDM में resuspend 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल के एक घनत्व पर चिकन CD40L के एक 1:20 कमजोर पड़ने के साथ पूरक । अनुमापन chCD40L से युक्त केंद्रित supernatant को इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करता है, जो 1:10 से 1:50 की सीमा में लेट होने की संभावना है ।
  4. संस्कृति या तो ९६ में कोशिकाओं-या 24 अच्छी तरह से प्लेटें ३७ ° c के लिए 48 – 72 h. U-तली ९६-अच्छी तरह से प्लेटें फ्लैट तली हुई प्लेटों के लिए बेहतर कर रहे हैं ।
    नोट: सेल ४० डिग्री सेल्सियस पर भी कल्चरित किया जा सकता है

6. IBDV के साथ चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं का संक्रमण

  1. 48-72 एच के बाद अलगाव, गल वायरस के एक aliquot, भंवर नमूना, और यह बर्फ पर दुकान ।
  2. प्राथमिक bursal कक्षों को पुनः निलंबित करें, कक्ष निलंबन के 10-µ l aliquot को एक Trypan नीले समाधान के 10 µ l में जोड़ें, और कक्षों और प्रतिशत व्यवहार्यता की संख्या निर्धारित करें ।
  3. वायरस इनोक्युलम और भंवर बनाने के लिए संक्रमण (MOI) की उपयुक्त बहुलता 1x पूरा IMDM में वायरस को पतला करें ।
  4. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  5. supernatant निकालें और वायरस इनोक्युलम में कोशिकाओं resuspend ।
  6. आवर्ती आंदोलन के साथ 1 एच के लिए ३७ ° c पर सेल निलंबन की मशीन ।
  7. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, वायरस इनोक्युलम निकालें, और 1x पूरा IMDM मीडिया में कोशिकाओं धो लो ।
  8. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, supernatant निकालें, और पूरा IMDM मीडिया में कोशिकाओं के एक घनत्व पर चिकन CD40L के साथ पूरक पुनर्स्थगित 1 x 10 एमएल प्रति7 कोशिकाओं ।
  9. संस्कृति या तो ९६ में कोशिकाओं-या 24 अच्छी तरह से ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें ।
    नोट: सेल ४० डिग्री सेल्सियस पर भी कल्चरित किया जा सकता है

7. चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं में IBDV प्रतिकृति के ठहराव

  1. वांछित समय-बिंदु postinfection पर, कोशिकाओं resuspend, उंहें एक उपयुक्त ट्यूब को हस्तांतरण, उंहें 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant वायरस अनुमापन के लिए या तो पट्टिका परख या TCID५० परख के अनुसार के रूप में रीड-Muench विधि15.
  2. पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोने और उन्हें या तो एक IBDV के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunostaining के लिए तैयार है, या एक उपयुक्त किट का उपयोग कर आरएनए निकालने (निर्माता के निर्देशों का पालन) और प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला रिवर्स प्रदर्शन प्रतिक्रिया (RT-qPCR) एक IBDV जीन (फॉरवर्ड, GAGGTGGCCGACCTCAACT के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग; उलट, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). नकली संक्रमित सेल संस्कृतियों एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

Representative Results

चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं चिकन CD40L की उपस्थिति में संस्कृति हो सकता है

जब चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं घुलनशील chCD40L की उपस्थिति में कल्चरित थे, कोशिकाओं की संख्या ९.०२ x 105 से ३.६३ x 106 दिनों की अवधि के दौरान प्रति मिलीलीटर, जब यह अनुपस्थित था के विपरीत में वृद्धि हुई (p < 0.05) ( चित्र 1a) । सेल व्यवहार्यता भी काफी सुधार किया गया था, उदाहरण के लिए 25% से दिन में 3 पद संस्कृति chCD40L के अभाव में ४८% chCD40L (p < 0.05) (चित्र 1b)13की उपस्थिति में ।

चिकन प्राथमिक Bursal कोशिकाओं दोनों सेल की प्रतिकृति का समर्थन कर सकते हैं-संस्कृति अनुकूलित और बहुत IBDV के विषमय उपभेदों

नकली संक्रमित और संक्रमित सेल संस्कृतियों 18 ज postinfection, IBDV VP2 के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और Alexa एंटीबॉडी ४८८ के लिए एक माध्यमिक संयुग्मित Fluor के साथ लेबल तय किया गया, और counterstained के साथ DAPI । संक्रमित कोशिकाओं नाभिक (चित्रा 2a) के आसपास हरे प्रतिदीप्ति का सबूत था, कोशिका द्रव्य में IBDV की उपस्थिति के साथ संगत । यह IBDV के दो उपभेदों, एक सेल के लिए स्पष्ट था संस्कृति तनाव, D78, और एक बहुत विषमय तनाव, UK661 (चित्रा 2a) । 5, 18, 24, और ४८ एच postinfection में, आरएनए संक्रमित संस्कृतियों से निकाला गया था और IBDV VP4 जीन के एक संरक्षित क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ आरटी qPCR के अधीन । VP4 की अभिव्यक्ति पहले घर में सामांय जीन TBP रखने और फिर एक ΔΔCt विश्लेषण में नकली नमूनों के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया गया था । IBDV VP4 अभिव्यक्ति postinfection के साथ ४८ एच UK661 में D78 और ३८,६३२ प्रतियों के साथ ४८ एच postinfection पर १६,६०३ प्रतियां बढ़ गई । एक साथ ले लिया, इन आंकड़ों को प्रदर्शित करता है कि चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं की प्रतिकृति का समर्थन कर सकता सेल-संस्कृति-अनुकूलित और बहुत विषमय IBDV उपभेदों13।

Figure 1
चित्रा 1: चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं चिकन CD40L की उपस्थिति में कल्चरित किया जा सकता है. चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं की उपस्थिति या chCD40L (काली सलाखों और सफेद सलाखों, क्रमशः) की अनुपस्थिति में संस्कृति थे । (क) जीवित कोशिकाओं की संख्या और (ख) व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत का संकेत समय-अंक postinfection पर निर्धारित किया गया. दर्शाया गया डेटा कम से तीन दोहराने वाले प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, त्रुटि पट्टियां माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं, और सांख्यिकीय महत्व प्रत्येक समय-बिंदु पर युग्मित विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, * p < ०.०५. यह आंकड़ा डलिच एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 13.

Figure 2
चित्रा 2: चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं दोनों सेल की प्रतिकृति का समर्थन कर सकते हैं-संस्कृति अनुकूलित और बहुत IBDV के विषमय उपभेदों. (क) चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं नकली संक्रमित या या तो D78 या UK661 और प्रत्येक संस्कृति से एक नमूना के साथ संक्रमित थे, लेबल और imaged: IBDV VP2, ग्रीन; नाभिक, नीला । स्केल बार = 7 µm. (ख) आरएनए संकेत समय पर निकाली गई थी-अंक postinfection, रिवर्स-प्रतिलिखित, और IBDV VP4 जीन के एक संरक्षित क्षेत्र मात्रात्मक पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था । VP4 कॉपी संख्या में प्रवेश10 गुना परिवर्तन TBP गृह व्यवस्था जीन को सामान्यीकृत और 2-ΔΔCT विधि के अनुसार नकली संक्रमित नमूनों के सापेक्ष व्यक्त किया गया था । दिखाए गए डेटा में कम से तीन दोहराने प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, और त्रुटि पट्टियां माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा डलिच एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 13.

Discussion

इस अध्ययन में, हम घुलनशील chCD40L की उपस्थिति में चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं पूर्व vivo की सफल संस्कृति का वर्णन और प्रदर्शित करता है कि इन कोशिकाओं को एक तनु तनाव और IBDV की एक बहुत विषमय तनाव की प्रतिकृति का समर्थन कर सकते हैं । यह पूर्व vivo मॉडल का निर्धारण कैसे कोशिकाओं को एक IBDV संक्रमण13, जो vivo में और इन विट्रो अध्ययनों में विशिष्ट लाभ है पर प्रतिक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जब BF कटाई, यह पेट पंचर नहीं इतना के रूप में अलग bursal कोशिकाओं के जीवाणु संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, अंग फसल कोशिका मृत्यु को सीमित करने के बाद जितनी जल्दी हो सके प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है । chCD40L का उपयोग करने की आवश्यकता तकनीक की एक सीमा है; हालांकि, Soubies एट अल द्वारा किए गए कार्य से पता चलता है कि phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) bursal14 के बजाय chCD40L कोशिका व्यवहार्यता को लम्बा करने के लिए इस मॉडल को प्रयोगशालाओं की अधिक से अधिक संख्या द्वारा अपनाए जाने के लिए सक्षम हो सकता है । ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल chCD40L empirically के इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करता है, संवर्धन प्राथमिक बी कोशिकाओं द्वारा अणु के प्रश्नपत्र पतला सांद्रता में और सेल प्रसार और व्यवहार्यता देख । प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित संशोधन करने के लिए chCD40L अणु शुद्ध और सेल संस्कृति मीडिया के लिए एक विशिष्ट एकाग्रता जोड़ने के लिए बैच से बचने के लिए हो सकता है-बैच परिवर्तनशीलता ।

vivo अध्ययनों में पता चला है कि निंनलिखित IBDV संक्रमण, वहां समर्थक भड़काऊ cytokine प्रतिक्रियाओं में शामिल जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, प्रकार मैं IFN प्रतिक्रियाओं, और apoptosis में BF5,9,10 . हालांकि, संक्रमण के बाद, वहां भड़काऊ कोशिकाओं और BF, जो जीन वे संक्रमित बी सेल जनसंख्या9की तुलना में एक्सप्रेस में अलग में प्रभाव टी कोशिकाओं का एक बाढ़ है । यह है, इसलिए, कैसे संक्रमित कोशिकाओं IBDV का जवाब की व्याख्या करने के लिए मुश्किल है । यह पता करने के लिए, कुछ शोध समूहों में संस्कृति16,17,18,19,20IBDV से संक्रमित कोशिकाओं के transcriptional प्रतिक्रिया विशेषता है । इन विट्रो अध्ययनों में अच्छी तरह से परिभाषित MOIs और समय अंक postinfection का लाभ है । हालांकि, इन विट्रो अध्ययनों में आम तौर पर या तो fibroblast कोशिकाओं16,17,20 या वृक्ष कोशिकाओं18में विशेषता है । जबकि मेजबान सेल-IBDV बातचीत में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान, वर्तमान विश्वास है कि बी कोशिकाओं के संक्रमण IBDV के रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है और, इसलिए, डेटा की प्रासंगिकता की व्याख्या नहीं की जा सकती है । हमारे पूर्व vivo bursal सेल संस्कृति मॉडल करने से पहले, केवल एक अध्ययन IBDV संक्रमण19के लिए बी कोशिकाओं के सेलुलर प्रतिक्रिया विशेषता थी; हालांकि, इस अध्ययन ALV के साथ संक्रमण के कारण बदल गया था कि एक अमर बी सेल लाइन का उपयोग, निष्कर्ष है कि बनाया जा सकता है सीमित. इसके विपरीत, IBDV संक्रमण के पूर्व वीवो मॉडल यहां बताया शोधकर्ताओं के लाभ को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है इन विट्रो अध्ययन, जैसे परिभाषित MOIs और समय अंक, जबकि अपने प्रासंगिक मेजबान सेल के साथ वायरस की बातचीत का अध्ययन । प्राथमिक bursal कोशिकाओं के रूप में संक्रमित BF ऊतक से प्राप्त कर रहे हैं, वहाँ कोई भड़काऊ या टी कोशिकाओं मौजूद हैं, और हम प्रवाह cytometry द्वारा प्रदर्शन किया है (मानक शर्तों का उपयोग करके) कि, chCD40L उत्तेजना के बाद, सेल जनसंख्या का ९७% के लिए सकारात्मक है बी सेल मार्कर बु-1 (डेटा नहीं दिखाया गया है) । यह देखते हुए कि कोशिकाओं के 3% बु-1 नकारात्मक हैं, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इन कोशिकाओं IBDV से संक्रमित हो जाते है और उनके जीन अभिव्यक्ति और रोगजनन के लिए योगदान का पता लगाने दिलचस्प हो जाएगा ।

हमें आशा है कि पूर्व vivo चिकन प्राथमिक bursal सेल संस्कृति मॉडल भी मेजबान सेल का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है-अन्य बी सेल रेखा वायरस के वायरस बातचीत ऐसे ALV या REV के रूप में मुर्गियों, संक्रमण, और भी अन्य एवियन प्रजातियों के लिए विस्तारित किया जा सकता है ( जैसे, बतख या टर्की) । संस्कृति प्राथमिक bursal कोशिकाओं के लिए क्षमता ex विवो भी रोगजनन और प्रतिरक्षादमन पक्षियों को संक्रमित करने की आवश्यकता के बिना इन वायरस के कारण के पहलुओं का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है. के रूप में vivo अध्ययन महत्वपूर्ण रुग्णता के कारण, इस प्रतिस्थापन, शोधन, और अनुसंधान में पशुओं के उपयोग की कमी पर एक बड़ा प्रभाव पड़ेगा ।

सारांश में, पूर्व vivo चिकन प्राथमिक bursal सेल संस्कृति मॉडल यहां वर्णित की समझ का विस्तार करने की क्षमता है कैसे एवियन बी सेल रेखा वायरस उनके मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हुए vivo में इस्तेमाल किया पक्षियों की संख्या को कम करने संक्रमण अध्ययन । तकनीक कई लसीकावत् अंगों के लिए लागू किया जा सकता है, कई वायरस, और, संभावित, पक्षियों की कई प्रजातियों, यह एक आकर्षक मॉडल है कि एवियन वायरोलॉजी और इम्यूनोलॉजी क्षेत्रों में योगदान कर सकते हैं बनाने.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Pirbright में अपनी विशेषज्ञता के लिए पशु सेवा टीम का शुक्रिया अदा करना चाहते है सेने, पालन, और मुर्गियों पक्षियों और बर्सा के Fabricius को हटाने aseptically में कैरोलीन होल्ट की विशेषज्ञता । अटल बिहारी जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) के माध्यम से अनुदान किउ/e/i/00001845 के माध्यम से वित्त पोषित है, K.D. के माध्यम से BBSRC के माध्यम से वित्त पोषित है छात्र किउ/e/i/00002115, और A.A. के लिए राष्ट्रीय केंद्र के माध्यम से वित्त पोषित है प्रतिस्थापन, शोधन और अनुसंधान में पशुओं की कमी (NC3Rs) अनुदान के माध्यम से नेकां/R001138/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Medium Merck R8758-500ML
FBS gibco by Life Technologies 10099-141 heat-inactivate at 56 °C for 1 h
Puromycin Dihydrochloride Thermo Fisher Scientific A1113802
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane Thermo Fisher Scientific 168-0045
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) Thermo Fisher Scientific 88528
0.22 µm Millex-GP Syringe Filter Merck F7648
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 gibco by Life Technologies 14060-040
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 gibco by Life Technologies 14180-046
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) Merck 03690-100ML
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX gibco by Life Technologies 31980-030
Chicken Serum Merck C5405-100ML
2-Mercaptoethanol 50 mM gibco by Life Technologies 31350-010
Insulin-transferrin-sodium-selenite gibco by Life Technologies 41400-045
Collagenase D Roche Diagnostics GmbH 11088882001
100 µm Cell Strainer Corning 431752
Histopaque-1083 Merck 10831-100ML
Trypan Blue solution Merck T8154-20ML
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates Thermo Fisher Scientific 163320
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile Corning 353047
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४० चिकन प्राइमरी सेल बर्सा ऑफ Fabricius बी सेल वायरस संक्रामक bursal डिजीज वायरस IBDV
संक्रामक Bursal रोग वायरस का अध्ययन करने के लिए एक <em>पूर्व Vivo</em> चिकन प्राथमिक Bursal-सेल संस्कृति मॉडल रोगजनन
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Dulwich, K. L., Asfor, A. S., Gray,… More

Dulwich, K. L., Asfor, A. S., Gray, A. G., Nair, V., Broadbent, A. J. An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis. J. Vis. Exp. (140), e58489, doi:10.3791/58489 (2018).

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