Summary
Her presenterer vi en protokoll for produksjon og pre-klinisk testing av murine CD19 bil T celler ved retroviral signaltransduksjon og utnyttelse som en behandling mot etablerte syngeneic A20 B-celle lymfom i BALB/c mus med eller uten lymphodepleting pre condition.
Abstract
Forbløffende klinisk suksessen av CD19 chimeric antigen reseptor (bil) T-celle terapi har ført til godkjenning av to andre generasjon chimeric antigen reseptorer (biler) for akutt lymfatisk leukemi (alle) andnon-Hodgkin lymfom (NHL). Fokus for feltet er nå på emulere disse suksessene i andre Hematologisk malignitet der mindre imponerende komplett svarprosenten er observert. Videre prosjektering av bilen T celler eller co administrasjon for andre behandlingsmåter kan med hell overvinne hindringer for vellykket behandling i andre kreft innstillinger.
Derfor presenterer vi en modell der andre kan utføre pre-klinisk testing av CD19 bil T celler. Resultatene i denne godt B-celle lymfom modellen er sannsynlig å være informativ bil T-cellen terapi generelt.
Denne protokollen tillater reproduserbar produksjon av mus bilen T celler gjennom kalsium fosfat transfection Plat-E produsent celler med MP71 retroviral konstruksjoner og pCL-Eco emballasje plasmider etterfulgt av samling av utskilles retroviral partikler og signaltransduksjon rekombinant menneskelige fibronectin fragment og sentrifugering. Validering av retroviral signaltransduksjon, og bekreftelse av at bilen T celler å drepe målet lymfom celler ex vivo, bruk av flowcytometri, luminometry og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA), er også beskrevet.
Protokoller for å teste bilen T celler i vivo i lymphoreplete og lymphodepleted syngeneic mus, bærer etablerte, systemisk lymfom beskrives. Anti-kreft aktivitet overvåkes av i vivo bioluminescens og sykdom progresjon. Vi viser typiske resultater av fjerning av etablerte B-celle lymfom når utnytte 1st eller 2nd generasjon biler i kombinasjon lymphodepleting før og et mindretall av mus oppnår langsiktige remissions når benytter bilen T celler uttrykke IL-12 i lymphoreplete mus.
Disse protokollene kan brukes til å evaluere CD19 bil T-celler med forskjellige ytterligere modifisering, kombinasjoner av bil T celler og andre terapeutiske agenter eller tilpasset for bruk av bil T-celler mot ulike antigener.
Introduction
Chimeric antigen reseptor (bil) T-cellen terapi har vist forbløffende klinisk suksess i behandling av CD19+ malignitet fører til godkjennelse av tisagenlecleucel for tilbakefall akutt lymfatisk leukemi1 og axicabtagene ciloleucel for progressiv stor B-celle non-Hodgkins lymfom2 i 2017.
Betydningen av samspillet mellom kreft og immunsystemet i både sykdomsprogresjon og terapeutiske mekanismer blir stadig mer anerkjent3,4,5. For eksempel, er det godt dokumentert at svulsten microenvironment (TME) er full av faktorer som kan undertrykke funksjoner effektor av immunceller6,7,8. Alternativt kan fylling av endogene immunceller og epitope spre inntaste svulst fjerning og langsiktig motstand mot svulst challenge9,10. Begge disse fenomenene kan ikke evalueres i xenogeneic modeller som mangler en immun system. Likeledes gjenspeiler systemer som utnytter transgene proteiner ikke nøyaktig utfordringen med å bryte immun toleranse som kreves for epitope spre11,12. En syngeneic modell med en fullt fungerende immunsystem er derfor avgjørende for modellering disse viktige aspekter av kreft sykdom progresjon og immun therapeutics.
En viktig påminnelse av bilen T-cellen terapi er at lymphodepleting før condition kreves for terapeutisk suksess13,14. Dette oppnås vanligvis hos pasienter ved å tilsette kjemoterapi før infusjonen bil T celler15,16. Som standard, for å etterligne lymphodepletion brukes i innstillingen pasienten administrere vi 5 Gy hele kroppen bestråling (TBI) å oppnå lymphodepletion før administrasjon av terapeutiske bil T-celler til mus bærer systemiske A20 B-celle lymfom.
Lymphodepleting før condition er ikke et problem for fleste pasienter, betyr toksisitet som følger med chemotherapeutic agenter at pasienter med lav ytelse ikke er kvalifisert for bil T-cellen terapi. Hvis du vil opprette en test som representerer pasientene ikke berettiget til lymphodepletion, etablerte vi en lymphoreplete syngeneic musemodell der vi modell bil T-cellen terapi lymfom. I denne modellen vi viste at utskillelsen av IL-12 fra i bilen T celler kan føre til utryddelse av etablerte lymfom med en suksessrate på ~ 25%17. Videre viste vi at endogene immunceller var involvert i kreft utrydding.
Her beskrive vi i detalj protokollen for produksjon av mus bilen T celler, etablere lymfom i syngeneic mus og behandling av lymfom med bil T-celler med eller uten bruk av lymphodepleting før condition. Dette kan brukes for kombinasjon studier av bilen T-celler med andre agenter, teste bilen T-celler med andre effekter av transgener eller bruk av andre adoptivforeldre cellen terapi eller immunterapi strategier mot lymfom.
Protocol
Alle dyreforsøk ble gjennomført under ledelse av dyr (vitenskapelig prosedyrer) loven 1986 og UK koordinerende komite for kreftforskning retningslinjer. Alle dyrestudier ble gjennomført ved CRUK-Manchester institute og godkjent av lokale dyr velferd og etikk gjennom kroppen (CRUK-MI AWERB).
1. forberedelser
- Maxiprep pMP71 retroviral konstruere plasmider og pCL-Eco retrovirus emballasje plasmider18.
Merk: pMP71 koder mCherry og bilen med en FMDV2A sekvens. Dette er utbyttbare med andre retroviral konstruksjoner. pCL-Eco koder gag, pol og ecotropic konvolutt proteiner. - Forberede komplett T celle medium (TCM) dyrking musen T celler ved hjelp av RPMI 1640 medium, 10% FCS, 1% 100 x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG).
Merk: Løsningen inneholder 100 IU/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 2 mM av L-glutamin), 50 μM β-mercaptoethanol og 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES). - Kultur A20 celler i RPMI 1640, 10% FCS og 0.05 mM β-mercaptoethanol ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur Platinum-E (Plat-E) cellene i hele Dulbecco endret eagle medium (DMEM) (DMEM med 10% fosterets kalv serum (FCS), 2 mM L-glutamin, 1 μg/mL puromycin og 10 μg/mL blasticidin) ved 37 ° C, 5% CO2.
Merk: Plat-E celler er avledet fra 293T celler og uttrykke gag, pol og ecotropic konvolutt retroviral proteiner. - Forberede transfection medieløsninger 1 og 2 umiddelbart før transfection. Forberede løsning 1 (pH 7.9) inneholder DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, løsning 2 (pH 7.1) inneholder DMEM + 25 mM HEPES.
- Klargjør 10 μg/mL rekombinant menneskelige fibronectin fragment løsning ved å fortynne med sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) og lagre på 20 ° C før bruk.
- Sterile filtrere alle medier gjennom 0,2 μm filtre før bruk (unntatt rekombinant menneskelige fibronectin fragment).
2. retroviral signaltransduksjon av T-celler
- Dag 1: Forberedelse til hva
- Frø 7.5 x 106 Platinum-E (Plat-E) celler i 15 cm2 vev kultur retter i 18 mL komplett DMEM og ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.
- Dag 2: Transfection Plat-E retroviral emballasje cellen linje
- Forberede 20,4 μg av pcl-Eco emballasje vektor DNA, 39.6 μg plasmider DNA koding retroviral bil konstruksjon og 150 μL av 1 M CaCl2 siste bind i 3 mL transfection løsning 2 per 15 cm2 rett til å være transfekterte. Vortex for 10 s og hvile i 5 min
- Fjerne DMEM media fra 15 cm2 retter og erstatte med 12 mL transfection 1.
Forsiktig Når du endrer media, kan 15 cm2 retter tørke på center. Dette kan føre til betydelig døden transfekterte Plat-E celler. Jobbe raskt og fjern medier fra bare 1-2 plater samtidig. - Legge 3 mL transfection løsning 2 inneholder DNA og CaCl2 til hver 15 cm2 rett drop-wise, jevnt over hver plate. Forsiktig rock plater med en siden bevegelse for 10 s. Incubate ved 37 ° C, 5% CO2 over natten.
- Dag 3: Utarbeidelse av virus som inneholder supernatant for signaltransduksjon
- Erstatt media transfekterte Plate-E celler med 18 mL fullføre TCM og gå tilbake til inkubator.
Forsiktig Når endre media 15 cm2 retter kan tørke på center. Dette kan føre til betydelig døden transfekterte Plat-E celler. Jobbe raskt og fjern medier fra bare 1-2 plater samtidig.
- Erstatt media transfekterte Plate-E celler med 18 mL fullføre TCM og gå tilbake til inkubator.
- Dag 3: Isolasjon og i vitro aktivisering av musen splenic T-celler
- Fjern spleens fra 6-8-uke-gamle BALB/c mus som tidligere beskrevet av Parkinson et al. 19 og dyppe dem i sterilt, iskalde, PBS i et 50 mL konisk rør.
- Bruke pinsett for å overføre en milt til en 1,5 mL microcentrifuge rør og homogenize med en støter med minimal kraft.
- Bruke en 1000 μL pipette og ~ 800 μL PBS overføre homogenate til en 100 μm pore celle sil festet til en 50 mL tube som inneholder 5 mL PBS å oppnå en enkeltcelle suspensjon. Gjenta trinn 2.4.2 for de ekstra spleens. Ikke overstige 3 spleens per rør.
Forsiktig Splenocytes gikk gjennom filteret kan danne klumper hvis igjen. Manuelt swirl rør midlertidig hvis behandlingen flere spleens for å unngå celle clumping. Gjenværende fragmenter på cellen silen kan være ytterligere potetmos bruker en plunger fra 5 mL sprøyte med minimal kraft. - Topp opptil 20 mL med PBS. Lag 20 mL celle suspensjon forsiktig på 20 mL tetthet gradert medier (Tabell for materiale) i en 50 mL tube. Sentrifuge resulterende overlappet suspensjon 800 x g for 20 min med ingen brems brukes.
- Høste celler på grensesnittet laget med et sterilt Pasteur pipette og overføre til en 50 mL tube. Topp opptil 50 mL med PBS og sentrifuger 800 x g i 10 min å vaske. Forkast nedbryting og å suspendere celler i fullstendig TCM.
- Tell antall celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Kultur cellene på en tetthet på 5 x 106 celler/mL i fullstendig TCM med 30 ng/mL anti-CD3ε antistoff (klone 145-2 C 11), 30 ng/mL anti-CD28 antistoff (klone 37.51), 100 U/mL rekombinant menneskelige IL-2 og 2 ng/mL rekombinant murine IL-7. Bruk et riktig størrelse vev kultur kolbe for volumet av celler høstet.
Merk: -Antigen presentere celler er nødvendig for T celle aktivering av CD3 og CD28 antistoffer, hvis arbeider med renset T celler det er nødvendig å belegge plater med antistoffer, eller bruke magnetiske perler (Tabell for materiale) - Inkuber musen splenocytes ved 37 ° C, 5% CO2 over natten.
- Dag 3: Utarbeidelse av plater for signaltransduksjon
- Pelsen ikke-vev-kultur 6-vel plater med 2 mL 10 μg/mL rekombinant menneskelige fibronectin fragmenter og ruge over natten på 4 ° C.
- Dag 4: Signaltransduksjon musen T celler
- Overføre rekombinant menneskelige fibronectin fragment fra belagt plater til friske ikke-vev-kultur 6-og plater. Inkuber disse platene overnatting på 4 ° C til runde 2 av signaltransduksjon.
- Tilsett 2 mL av TCM hver brønn av opprinnelige rekombinant menneskelige fibronectin fragment-belagt plater og la stå i 30 min ved romtemperatur å blokkere ikke-spesifikk bindende.
- Høste retrovirus inneholder nedbryting fra transfekterte Plat-E celler i 15 cm vev kultur retter og Erstatt med 18 mL komplett TCM.
Forsiktig Arbeide raskt for å unngå tørking av Plat-E celler.
Merk: Suksessen til hva kan kontrolleres på dette stadiet av fluorescens mikroskopi hvis utnytte et fluorescerende markør gen som mCherry (figur 1). - Filtrere retrovirus inneholder nedbryting gjennom 0,45 μm fjerne celle rusk. Fjern TCM fra rekombinant menneskelige fibronectin fragment-belagt 6-vel plater og tilsett 2,5 mL av filtrerte retrovirus inneholder nedbryting eller hver brønn (bruk fullføre TCM for uekte transfection). Label hver brønn som tillegg av retrovirus eller uekte media.
- Sentrifuge platene på 1200 x g i 30 min ved romtemperatur.
- Platene er spinner, samle aktivert T celler og telle ved hjelp av en hemocytometer.
- Signaltransduksjon utføres med 5 x 106 aktivert splenocytes i totalt 5 mL/godt. Pellets antall splenocytes for uekte/signaltransduksjon i separate rør med sentrifugering på 500 x g i 5 min.
- Nytt suspendere splenocytes på en tetthet av 5 x 106 celler per 2,5 mL av filtrerte retrovirus inneholder nedbryting fra trinn 2.6.4 eller TCM som en negativ kontroll. Legge rekombinant menneskelige IL-2 (hIL-2) og rekombinant mus IL-7 (mIL-7) til en siste konsentrasjon av 200 IE/mL og 4 ng/mL henholdsvis.
- Samle 6-og plater fra sentrifuge ferdig trinn 2.6.5 og Legg 2,5 mL/godt nytt suspendert splenocytes i riktige brønner å gjøre en siste volum 5 ml/vel og en siste konsentrasjon av 100 U/mL hIL-2 og 2 ng/mL mIL-7.
- Sentrifuge platene på 1200 x g for 90 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering, ruge platene på 37 ° C, 5% CO2 over natten.
- Dag 5: Runde 2 av signaltransduksjon
- Samle rekombinant menneskelige fibronectin fragmentet fra platene som dette kan brukes på nytt. Gjenta trinn 2.6.2 - 2.6.5.
- Mens plater er spinning, samle celler i 1st rundt av signaltransduksjon bruker en Pasteur pipette. Skyll hver brønn med 2 mL PBS, virvel og samle alle gjenværende celler i hver brønn.
Merk: Pipetter opp og ned for å suspendere sedimented celler. Samle hver kontroll/signaltransduksjon gruppe i separate rør. - Sentrifuger rør på 500 x g for 5 min. re suspendere celler i 2,5 mL per brønn av signaltransduksjon med 200 IE/mL IL-2 og 4 ng/mL IL-7. Gjenta trinn 2.6.7 - 2.6.8.
- Fjerne celler fra sentrifuge og ruge på 37 ° C, 5% CO2 for 4 h. samle transduced celler i trinn 2.7.2-2.7.3.
- Telle celler, sentrifuge 500 x g i 5 min og å avbryte fullført TCM på en tetthet på 1 x 106 celler/mL med 100 U/mL hIL-2 og 2ng/mL mIL-7. Overføre til en passende størrelse kultur kolbe og ruge på 37 ° C, 5% CO2.
- Legge fersk TCM mediet som inneholder 100U/mL hIL-2 og 2ng/mL mIL-7 hver 2 dager, opprettholde en celle tetthet av 1 x 106 celler/mL.
Merk: Høstet splenocytes inneholder en rekke celletyper. Under disse forholdene kultur, ikke T celler dør i løpet av 2-3 dager. Etter ~ 4 dager i cellekultur, antall T celle er vanligvis tilsvarende antall høstet splenocytes dag 0.
3. måling av signaltransduksjon effektivitet
- På dag 4 innlegg transduction, samle transduced eller ikke-transduced T celler (ca 3 x 105 celler). Sentrifuge celle suspensjon på 500 x g i 5 min, forkaste nedbryting, vask pelleted cellene gang med PBS og sentrifuge igjen.
- Forkast nedbryting og tilsett 100 μL av PBS inneholder en egnet Amin reaktive dye (f.eks, live/dead flekken, 1 av 100 fortynning) per brønn. Inkuber i 15 min ved romtemperatur i mørket.
- Vask to ganger med PBS og sentrifuge på 500 x g for 5 min. Forkast nedbryting og ruge med 50 μL FACS bufferen som inneholder anti-musen CD16/CD32 antistoffer for Fc reseptor blokkere (1 av 100 fortynning). Inkuber i 10 min på 4 ° C.
- Legge til 50 μL antistoff flekker master blanding som inneholder anti-musen CD4-BV786 og CD8-BV711 antistoffer (siste konsentrasjon av 1 μL/godt FACS buffer). Inkuber i 30 min på 4 ° C i mørket. Gjenta vask trinnet 3.3. Nytt suspendere cellene i 1% PFA buffer og holde den i mørket på 4 ° C til analyse av flowcytometri.
- Analysere celler med tilsvarende egnet cytometer med BV711, BV785 og mCherry fluorescens som markører av CD4 og CD8 delsett og bil uttrykk henholdsvis gating som (figur 2).
4. in vitro validering av bilen T celle aktivitet
- Frø syngeneic målrette CD19+ kreftceller med eller uten luciferase uttrykk på en tetthet for 1 x 104 celler i 100 μL TCM/godt i en 96-brønns U-bunn vev kultur plate.
- Legge til 1 x 104 CD19 bil T celler/godt i et volum av 100 μL/godt å oppnå en effektor til målet (E:T) forholdet 1:1.
Merk: E:T forhold bør opprettes for hver bil konstruere og målet cellen linje. - Bruk T celler alene og kreftceller alene som negative kontroller og T celler stimulert av phorbol-myristate-acetate (PMA) (50 ng/mL) og ionomycin (1 μg/mL) som positive kontroll for utgivelsen av Interferon-gamma (IFNγ). Co kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 16-24 h.
- Etter co kultur, sentrifuge platene på 500 x g i 5 min og samle nedbryting for videre IFNγ og IL - 12 p 70 ELISA analyse.
Merk: Det kan lagres på-80 ° C. - Nytt avbryte celle pellets 100 μL PBS som inneholder luciferin (siste konsentrasjon på 1,5 mg/mL). Inkuber platene i 10 min på 37 ° C. Deretter måle luminescence fra hver brønn med en passende luminometer.
Merk: Eksponeringstider må optimaliseres for linjer og tetthet. Representant resultater er vist i figur 3a. Ex-vivo cytotoksisitet bil T celler kan endres til å uttrykke luciferin av co kultur med cellelinjer uttrykke målet antigen. Som bilen T celler drepe målet celler, luciferin slippes, derfor en reduksjon i luminometry signalet er korrelert med cellen kill. Non-transduced celler kan ofte har en effekt på målet cellen levedyktighet, spesielt over lang incubation perioder. Måle konsentrasjonen av murine IFNγ og IL - 12p 70 i nedbryting etter produsentens ELISA protokoller. Representant resultatene vises i (figur 3b og 3 c). Ex-vivo aktivering av bilen T celler av co kultur med cellelinjer uttrykke målet antigen kan være assayed ved å analysere supernatant innholdet med ELISA. Forholdet mellom bil T cellen til målcellene og periodelengden co kultur må optimaliseres for hver bil konstruksjon, målet cellen linje og analytt. PMA og ionomycin behandling kan brukes som en positivt bekrefte kvalitet T celler og deres evne til å svare.
5. vurdere anti-kreft aktivitet i mus
-
Protokollen 1
- Utføre 100 mg/kg intravenøs (IV) levering av cyklofosfamid i 6 til 8 uker BALB/c mus. Dette gjør at svulsten engraftment uten betydelig lymphodepletion17 (Figur 4).
Merk: Etablere A20 kan lymphoma ta over 2 måneder med en suboptimal ta rate. Dette kan forbedres ved bruk av cyklofosfamid 1 dag før levering av lymfom celler. For å studere lymphoreplete mus, identifisert vi en dose cyklofosfamid som kan øke effektiviteten av lymfom uten å forårsake lymphodepletion. - Neste dag, injisere 100 µL av 5 x 105 syngeneic A20 B-celle lymfom cellene endres for å uttrykke luciferase og grønn fluorescerende protein (GFP) i mus av intravenøs (IV) injeksjon.
- Tillate at mus til å utvikle systemisk lymfom for ~ 17 dager.
- Påvise systemisk lymfom ved intraperitoneal (IP) injeksjon av 100 μL 30 mg/mL luciferin og bildevisning på en i vivo bioluminescens tenkelig system.
- Bruk skilletegn for å unngå signal ringvirkninger til tilstøtende mus. Utsett mus for 1 min på ventral side en konstant størrelse region av interesse.
- Viser relative lette enheter (RLU) som fotoner per sekund (p/s). Innstillingene må være optimalisert for hver svulst modell; Bruk en eksponering som kan plukke opp tidlig deteksjon av svulster, men ikke føre til metning som svulster nå endepunktene.
- Registrere totale RLU for hver musen med en konstant størrelse områder av interesse. (Figur 5a og b).
- Sette inn en enkelt dose av 1 x 106 bil T-celler ved IV injeksjon i lymphoreplete mus bærer etablert lymfom.
Merk: (viktig) Dosering nivåer må opprettes for hver bil konstruere bruke en dose opptrapping tidsplan for å sikre at alle mulige toksisitet fremkommer fra bilen T celler er preget og kan håndteres. Om anti-musen CD19 bil T celler ikke viser toksisitet, kan bil T celler gi opphav til uventet toksisitet. Der flere bil konstruksjoner og signaltransduksjon effektivitet ikke er identiske, bør antall T celler administrert holdes like ved tilsetning av ikke-transduced T-celler i cellen forberedelsene. - Overvåke sykdomsprogresjon ukentlig gjennom IP injeksjon av 100 μL av 30 mg/mL luciferin og bildevisning på en i vivo bioluminescens tenkelig system (figur 5 c).
- Nøye overvåke mus for tegn på toksisitet og euthanize en mus som viser tidlige tegn på hind lem lammelse (HLP) eller patologisk svulst byrden før noen lider kan oppstå.
Merk: Toksisitet fra A20 lymphoma kan inkludere hind lem lammelse gjennom svulst invasjonen av meninges. Sjekk regelmessig etter tidlig tegn på endrede gangart. Likeledes, store IP svulster kan oppstå som kan føre til ubehag vist av endrede atferd. - Overvåke overlevelse av mus for 60-100 dager (figur 5 d). Utføre euthanasia ved en tidsplan-1-metoden ved eksperimentet.
- Utføre 100 mg/kg intravenøs (IV) levering av cyklofosfamid i 6 til 8 uker BALB/c mus. Dette gjør at svulsten engraftment uten betydelig lymphodepletion17 (Figur 4).
-
Protokollen 2
- Levere 200 mg/kg cyklofosfamid 6 til 8 - uke gamle BALB/c mus ved halen blodåre injeksjon i 100 μL av PBS per musen.
- Dagen, injisere 5 x 105 syngeneic A20 B-celle lymfom celler uttrykke luciferase og GFP i 100 μL PBS via hale blodåre injeksjon.
- Tillate at mus til å utvikle systemisk lymfomer for ~ 7-14 dager
- Bekreft systemisk lymfom ved IP injeksjon av 100 μL 30 mg/mL luciferin og bildevisning på en i vivo bioluminescens tenkelig system.
- Utføre 5 Gy hele kroppen bestråling (TBI) på 0.02 Gy/min for lymphodepletion.
Merk: Pasienter som gjennomgår bil T-celle behandlinger gjennomgå en rekke regimer å oppnå lymphodepletion før administrasjonen av bilen T-celler som øker engraftment av adoptively bil T celler. Dette kan replikeres i mus med hele kroppen bestråling (TBI) (figur 6). - På den neste dagen, injisere 1 x 106 bil T celler i 100 μL PBS via hale blodåre injeksjon i mus bærer etablert svulster.
- Samle blod prøver via hale blodåre utfall etter 7 dager.
- Legge til røde celle lyseringsbuffer hver blodprøve og forberede flowcytometri som beskrevet i del 3. Analysere bil T celle utholdenhet i sirkulasjon av flowcytometri (figur 2).
Merk: Tillegg av telling perler umiddelbart før cytometri kan bestemme antall bil T celler per milliliter blod. - Overvåke sykdommen fremgang som beskrevet i trinnene 5.1.5 - 5.1.8 (figur 7).
Representative Results
For høy effektivitet signaltransduksjon av T-celler er det nødvendig å få frisk retroviral partikler. Hva av Plat-E celle linje med pCL-Eco produsent plasmider og pMP71 retrovirus plasmider gir opphav til utskillelsen av retroviral partikler i celle supernatant. Når en fluorescerende markør genet, som mCherry, er kodet i retrovirus, kan vellykket transfection bli bekreftet av fluorescens mikroskopi (figur 1). Virus inneholder nedbryting fra transfekterte Plat-E celler brukes til å transduce T celler via 2 runder av spin-fection på fibronectin fragment-belagte plater. Effektiviteten av signaltransduksjon kan bestemmes 4 dager legge signaltransduksjon via flowcytometri. Vellykket transduced celler uttrykke markør genet kodet i retrovirus (figur 2). Signaltransduksjon effektiviteten varierer fra ~ 50-90% effektivitet med første generasjon reseptorer til ~ 10-40% med bil konstruerer nær retroviral emballasje kapasitet. Mens markøren genuttrykk viser vellykket retroviral signaltransduksjon, er det viktig å vise funksjonaliteten til bilen T celler ved engasjerende med celler som uttrykker målet enten på overflaten deres. Målet cellelinjer endret å uttrykke luciferase kan brukes i luciferase analyser teste graden av celle-kill av bilen T celler direkte (figur 3A). Utgivelsen av effektor cytokiner fra bilen T-celler på co kultur med målcellene, bestemmes av ELISA, kan også brukes som en indirekte mål på bilen T celle cytotoksisitet (figur 3B og 3 C).
BIL T celler produseres i denne protokollen kan evalueres i lymphoreplete mus ved å etablere systemisk A20 lymfom med en 100 mg/kg dose cyklofosfamid (injiseres intravenøst), 1 dag før IV injeksjon av 5 x 105 A20 celler (Figur 4). IP injeksjon med luciferin og image capture bruker en i vivo bioluminescens imager kan brukes til å overvåke svulst byrden bruke et konstant avkastning og eksponering gjennom (figur 5A-C). BIL T-celler som er endret til express IL-12 er i stand til å utrydde systemisk lymfom med lymphodepleting pre condition gi sykdom-fri overlevelse i ca 25% av mus (figur 5 d). Lymphodepleting preconditioning, forbedrer av 5 Gy TBI 1 dag før IV administrasjon av bilen T-celler, vesentlig engraftment (figur 6). I denne modellen er første generasjon bil T celler i stand til å utrydde systemisk A20 lymfom, vanligvis inducing sykdom-fri overlevelse i 100% av mus (figur 7).
Figur 1. Bekreftelse av vellykket transfection Plat E celler. Plat-E celler transfekterte retroviral bil konstruksjon, pMP71 og pcl-Eco emballasje vektor plasmider DNA. Vellykket transfection vises av uttrykk for mCherry fluorescerende markør genet. A) lyse feltet mikroskopi, B) fluorescens mikroskopi og C) flettede bilder vises. Forstørrelse = 50 X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bestemme signaltransduksjon effektivitet av flowcytometri. Flowcytometri brukes til å bestemme signaltransduksjon effektiviteten av musen T cellene på dag 4 innlegg transduction, bruke Zombie UV live/døde, mCherry, BV711 og BV785 for påvisning av live, bil konstruere, CD4 og CD8 celler, henholdsvis. Representant resultatene av A) ikke-transduced, B) mCherry.αmCD19.mCD3z og C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 vises med gating 1) singleter 2) Live celler 3) CD4 og CD8 4) og 5) vurdering av mCherry positive celler uttrykke bil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Validering av bilen T-celle aktivitet. ΑmCD19 bil T celler ble co kulturperler A20 lymfom cellene endres til express luciferase (1 x 104: 1 x 104) 16 h i en U-bunn 96-brønns plate. Cellene ble pelleted co kultur, og nedbryting ble samlet inn. A) celler var re suspendert i PBS og luminometry ble brukt til å vurdere levedyktigheten til målcellene. Nedbryting fra co kultur ble vurdert for IFNγ (B) og IL-12 (C). Forholdet mellom bil T cellen til målcellene og periodelengden co kultur må være optimalisert for hver bil konstruere og målet cellen linje. PMA og ionomycin behandling kan brukes som en positivt bekrefte kvaliteten på T-cellene og deres evne til å svare. Feilfelt viser SD. statistisk analyse ble utført veis VARIANSANALYSE. p < 0,001). Dette tallet er endret fra17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Etablere A20 lymfom uten lymphodepletion. Cyklofosfamid kan øke effektiviteten av lymfom induksjon uten å forårsake lymphodepletion. A) blod teller 6-8-uke-gamle BALB/c mus etter IV levering av 100 mg/kg av cyklofosfamid. Viser SD B) lymfom byrden av 6-8-uke-gamle BALB/c mus etter IV levering av 100 mg/kg av cyklofosfamid eller saltvann på dag -1 og IV levering av 5 x 105 A20 celler i dag 0 målt ved hjelp av en luminometer. C) overlevelse av mus i B). Feilfelt viser SD. statistisk analyse ble gjennomført med 2-veis VARIANSANALYSE. ** p < 0,01, *** p < 0,001). Dette tallet har blitt endret fra Kueberuwa et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Overvåking lymfom byrden og overlevelse. Mus bærer A20 lymfom uttrykke luciferase får 100 µL intraperitoneal (IP) injeksjoner av 30 mg/mL luciferin og ble fotografert med en i vivo bioluminescens tenkelig system. A) mus ble utsatt for 1 min på ventral side og straks snudd til bilde rygg å plukke opp svulst massene på begge sider av kroppen (B). C) representant resultatene av lymfom byrden av BALB/c mus mottar varierende αmCD19 bil T celler uten lymphodepletion. Viser SEM. D) overlevelse av samme mus. Dette tallet har blitt endret fra Kueberuwa et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Effekter av lymphodepletion. A) blod teller 6-8-uke-gamle BALB/c mus etter mottar 5 Gy TBI frekvensen dose av 0.02 Gy/min; viser SD. statistisk analyse av toveis VARIANSANALYSE. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) overvåking av CD4+ og CD8+ bil T celler i perifert blod mus av flowcytometri for mCherry markør genet 7 dager innlegget administrasjon. Viser SD. Dette tallet har blitt endret fra Kueberuwa et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. BIL T celle aktivitet med lymphodepleting før condition. Typiske resultater viser effekten av 5 Gy TBI dagen før bilen T-celle administrasjon. A) bildebehandling og (B) skjermer av imaging mus etter 100 µL intraperitoneal (IP) injeksjoner av 30 mg/mL luciferin bruker en i vivo bioluminescens tenkelig system. Viser SEM. C) overlevelse av samme mus. Dette tallet har blitt modifisert fromKueberuwa et al. 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Syngeneic musen modeller kan testing av sykdomsprogresjon og terapi samtidig opprettholde et intakt immunforsvar. Dette er viktig når det gjelder behandling som samhandler med immunsystemet og spesielt for immunterapeutisk agenter.
Protokollen beskrevet her har to viktige arbeidsflyter, den første som er genetisk modifisere musen T celle for å uttrykke biler. Dette krever 7 dager fra initiering til validering av signaltransduksjon. Samtidig med produksjon av bilen T celler er etableringen av systemisk lymphoma i mus. Bør bil T celleproduksjon mislykkes eller kvalitet å være utilstrekkelig, det ikke er vanligvis nok tid til å produsere erstatte celler før mus la lymfom. Det er derfor viktig at forskere bruker disse modellene nøyaktig utføre svulst dosering og sykdom progresjon studier for å vellykket tid produksjonen av bilen T celler for terapeutisk administrasjon.
Vanlige årsaker til lav T-celle signaltransduksjon effektivitet inkluderer dårlig transfection effektiviteten av produsent celler, vanligvis forårsaket av dårlig plasmider renhet eller unøyaktig fastsettelse av pH i hva media. Det anbefales å sjekke effektiviteten av produsent celle transfection før du fortsetter med full protokollen som dårlig transfection vil begrense effektiviteten av T-celle signaltransduksjon. Rekombinant menneskelige fibronectin fragmenter kan samles og lagres på 20 ° C for gjenbruk, men flere fryse-thaws resulterer i redusert signaltransduksjon effektivitet. Rask behandling av musen spleens etter collection er også viktig for å oppnå høy gir av levedyktig T-celler.
Det bør bemerkes at protokollen beskrevet her benytter A20 celler uttrykke luciferase. Dette er foretrukket som det gir muligheten til å måle systemisk svulst byrden av bioluminescens tenkelig. Men i nærvær av en funksjonell immunsystemet, kan Svar å luciferase forskyve resultatene. Vi har tidligere testet immunreaksjoner overlevende mus markør effekter av transgener17. Det er nøkkelen å gjenskape nøkkel eksperimenter ved hjelp av A20 celler gratis effekter av transgener til å validere at dette ikke spille en betydelig rolle i svulst fjerning av immunceller.
Mens klinisk agenter kan bare brukes i vivo i immun mangelfull mus, tillater bruk av mus bilen T-celler mot musen kreftceller oss å vurdere bidrag av immunsystemet til terapeutisk effekt eller sykdom progresjon. Denne protokollen kunne brukes for pre-klinisk vurdering av biler målretting B-celle lymfom eller andre biler med ytterligere endringer som utskillelsen av IL-12 som beskrevet her. Det må bemerkes at selv om samspillet mellom immunceller kan evalueres i syngeneic musen modeller, de ikke kan nøyaktig er recapitulate samhandling i mennesker i vivo. Spesielt oppmerksom på menneskelige og mus biler vil variere i strukturen som kan ha nedstrøms konsekvenser; optimale aktivisering og celle kultur forhold for vekst av T-celler er forskjellige20, vev distribusjon av antigen måluttrykk kan variere mellom mennesker og mus og erfarne toksisitet kan være radikalt forskjellige. Derfor er det viktig å benytte ex vivo og xenogeneic modeller for å bekrefte resultatene.
I sammendraget recapitulate syngeneic lymphodepleted og lymphoreplete modell lymfom pasienter med og uten forutgående kjemoterapi/strålebehandling. Dette gir et modellsystem å etterligne de kliniske for å tillate testing av en rekke strategier som vil være viktige med den kommende bølgen av nye immun terapi agenter.
Med bruk av pre condition, vil det bemerkes at alle mus vanligvis fjerner lymfekreft. Med er opptil 90% fullført svarprosenten hos mennesker, dette representant. Men utfordringene for CD19 bil T-celle terapi vil hengslene på forebygging av den høye frekvensen av relapses observert som ofte CD19. Relapses har ikke vært observert i denne modellen til, og ofte utover 100 dager. Modifikasjoner å etterligne relapses sett i klinikken kunne hjelpe med fremtidige utfordringer CD19 bil T-cellen terapi.
Disclosures
David Gilham arbeider for Celyad som er involvert i produksjon av bilen T celler. Resten av forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Bloodwise for denne forskningen (grant 13031) og CRUK Manchester biologiske ressurs enhet, bildebehandling og cytometri og molekylærbiologi kjernen fasiliteter for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
- Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
