Summary
Vi præsenterer her, en protokol for produktion og præ-klinisk afprøvning af murine CD19 bil T celler af retroviral transduktion og udnyttelse som en terapi mod etablerede syngeneic A20 B-celle lymfom i BALB/c mus med eller uden lymphodepleting forudgående konditionering.
Abstract
CD19 kimære antigen receptor (bil) T-celle terapi forbløffende kliniske succes har ført til godkendelse af to anden generation kimære antigen receptorer (biler) for akut lymfoblastær leukæmi (alle) og Hodgkin lymfom (NHL). Fokus for feltet er nu på at efterligne disse succeser i andre hematological maligniteter hvor mindre imponerende komplet responsrater overholdes. Yderligere engineering bil T-celler eller fælles administration af andre behandlingsmodaliteter kan med held overvinde hindringer for vellykkede terapi i andre kræft indstillinger.
Derfor præsenterer vi en model, som andre kan foretage præ-klinisk afprøvning af CD19 bil T-celler. Resultaterne i denne gennemtestede B-celle lymfom model er tilbøjelige til at være informative bil T-celle terapi i almindelighed.
Denne protokol giver reproducerbare produktion af musen bil T celler gennem calciumphosphat Transfektion af Plat-E producent celler med MP71 retroviral konstruktioner og pCL-Eco emballage plasmid efterfulgt af indsamling af udskilles retroviral partikler og transduktion ved hjælp af Rekombinante humane fibronektin fragment og centrifugering. Validering af retroviral transduktion, og bekræftelsen af evne til bil T-celler til at dræbe target lymfom celler ex vivo, ved hjælp af flowcytometri, luminometry og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA), er også beskrevet.
Protokoller for at teste bilen T-celler i vivo i lymphoreplete og lymphodepleted syngeneic mus, forsynet med etablerede, systemisk lymfom er beskrevet. Anticancer aktivitet er overvåget af i vivo bioluminescens og sygdom progression. Vi viser typiske resultater af udryddelse af etablerede B-celle lymfom, når udnytte 1st eller 2nd generation biler i kombination med lymphodepleting før conditioning og et mindretal af mus at opnå langsigtet remissioner når udnytte bil T celler, der udtrykker IL-12 i lymphoreplete mus.
Disse protokoller kan bruges til at evaluere CD19 bil T celler med forskellige yderligere ændring, kombinationer af bil T-celler og andre terapeutiske agenter eller tilpasset til brug for bil T celler mod forskellige mål antigener.
Introduction
Kimære antigen receptor (bil) T-celle terapi har vist forbløffende kliniske succes i behandlingen af CD19+ maligne sygdomme fører til godkendelse af tisagenlecleucel for recidiverende akut lymfoblastær leukæmi1 og axicabtagene ciloleucel for progressive store B-celle ikke Hodgkin lymfom2 i 2017.
Betydningen af samspillet mellem kræft og immunsystem i både sygdomsprogression og terapeutiske mekanismer bliver i stigende grad anerkendt3,4,5. For eksempel, er det veldokumenteret at tumor mikromiljø (TME) er oversvømmet med faktorer der kan undertrykke effektor funktion af immunceller6,7,8. Alternativt kan priming af endogene immunceller og epitop spredning være nøglen i tumor udryddelse og lang sigt modstand mod tumor udfordring9,10. Begge disse fænomener kan ikke evalueres i xenogene modeller, der mangler et immunsystem. Ligeledes afspejler systemer udnytter transgene proteiner ikke præcist udfordringen at bryde immuntolerance, hvilket er nødvendigt for epitop sprede11,12. En syngeneic model med et fuldt funktionelt immunsystem er derfor altafgørende for modellering disse vigtige aspekter af kræft sygdom progression og immun therapeutics.
En vigtig advarsel af bil T-celle terapi er, at lymphodepleting før conditioning er nødvendig for terapeutiske succes13,14. Dette opnås typisk i patienter ved administration af kemoterapi før infusion af bil T celler15,16. Som en standardmetode for at efterligne lymphodepletion anvendes i patient-indstillingen kan administrere vi 5 Gy kroppens samlede bestråling (TBI) at opnå lymphodepletion forud for dets indgift af terapeutiske bil T celler til mus forsynet med systemisk A20 B-celle lymfom.
Mens lymphodepleting pre conditioning ikke er et problem for fleste patienter, betyder toksicitet, der kommer med kemoterapeutika, at patienter med lav ydeevne status ikke er berettiget til bil T-celle terapi. For at skabe et testsystem, der repræsenterer patienter udelukket fra lymphodepletion, etablerede vi en lymphoreplete syngeneic musemodel, hvor vi model bil T-celle terapi af lymfom. I denne model, vi viste at sekretion af IL-12 fra inden for bil T celler kan føre til udryddelse af etablerede lymfom med en succesrate på ~ 25%17. Endvidere viste vi, at endogene immunceller var involveret i kræft udryddelse.
Her beskriver vi i detaljer af protokollen til produktion af musen bil T celler, oprettelse af lymfom i syngeneic mus, og behandling af lymfom med bil T celler med eller uden brug af lymphodepleting pre conditioning. Dette kan bruges til kombination undersøgelser af bil T celler med andre agenter, test bilen T celler med andre transgener eller andre adoptivforældre celle terapi eller immunterapi strategier mod lymfom.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført i regi af dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 og under UK Samordningsudvalget for kræftforskning retningslinjer. Alle dyreforsøg blev gennemført på CRUK-Manchester institute og godkendt af de lokale dyrevelfærd og etik anmeld krop (CRUK-MI AWERB).
1. præparater
- Maxiprep pMP71 retroviral konstruere plasmid og pCL-Eco retrovirus emballage plasmider18.
Bemærk: pMP71 koder mCherry og bilen adskilt af en FMDV2A sekvens. Dette er udskiftelige med andre retroviral konstruktioner. pCL-Eco koder gag, pol og ecotropic kuvert proteiner. - Forberede komplet T celle medium (TCM) dyrkning musen T celler ved hjælp af RPMI 1640 medium, 10% FCS, 1% 100 x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG).
Bemærk: Løsningen indeholder 100 IE/mL penicillin, 100 µg/mL af streptomycin og 2 mM L-glutamin), 50 μM β-mercaptoethanol og 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES). - Kultur A20 celler i RPMI 1640, 10% FCS og 0,05 mM β-mercaptoethanol ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur Platinum-E (Plat-E) celler i komplet Dulbecco modificerede eagle medium (DMEM) (DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 1 μg/mL puromycin og 10 μg/mL blasticidin) ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: Plat-E celler er afledt af 293T celler og express gag, pol og ecotropic kuvert retroviral proteiner. - Forberede Transfektion medieløsninger 1 og 2 umiddelbart før Transfektion. Forberede løsning 1 (pH 7,9) indeholder DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, opløsning 2 (pH 7.1) skal indeholde DMEM + 25 mM HEPES.
- Forberede 10 μg/mL rekombinant humant fibronektin fragment løsning ved fortynding med steril fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og opbevares ved-20 ° C indtil brug.
- Sterilt filtrere alle medier gennem 0,2 μm filtre før brug (undtagen rekombinant humant fibronektin fragment).
2. retroviral transduktion af T-celler
- Dag 1: Forberedelse til Transfektion
- Frø 7,5 x 106 platin-E (Plat-E) celler i 15 cm2 vævskultur retter i 18 mL af komplet DMEM og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
- Dag 2: Transfektion af Plat-E retroviral pakkelinie celle
- Forberede 20,4 μg af pcl-Eco emballage vektor DNA, 39.6 μg plasmid DNA kodning retroviral bil konstruktion og 150 μl 1 M CaCl2 endelige mængden af 3 mL Transfektion løsning 2 pr. 15 cm2 parabol til at være transfekteret. Vortex for 10 s og resten i 5 min
- Fjern DMEM medier fra 15 cm2 retter og erstatte med 12 mL Transfektion løsning 1.
Forsigtighed Når du ændrer medierne, kan 15 cm2 retter tørre på center. Dette kan medføre betydelige død af transfekteret Plat-E celler. Arbejde hurtigt og fjerne medier fra bare 1-2 plader ad gangen. - Tilføj 3 mL Transfektion løsning 2 indeholder DNA og CaCl2 til hver 15 cm2 fad Dråbevist, jævnt på tværs af hver plade. Forsigtigt rock plader med en side til side bevægelse for 10 s. Incubate ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
- Dag 3: Forberedelse af virus-holdige supernatanten for transduktion
- Erstat media transfekteret plade-E celler med 18 mL komplet TCM og vende tilbage til rugemaskine.
Forsigtighed Hvornår ændre media 15 cm2 retter kan tørre på center. Dette kan medføre betydelige død af transfekteret Plat-E celler. Arbejde hurtigt og fjerne medier fra bare 1-2 plader ad gangen.
- Erstat media transfekteret plade-E celler med 18 mL komplet TCM og vende tilbage til rugemaskine.
- Dag 3: Isolation og in vitro- aktivering af musen milt T celler
- Fjerne milt fra 6-8 uge gamle BALB/c mus som tidligere beskrevet af Parkinsons et al. 19 og Fordyb dem i sterile, iskold, PBS i en 50 mL konisk slange.
- Bruge pincet til at overføre en milt til et 1,5 mL microcentrifuge og omrystes med en pistil med minimal kraft.
- Bruge 1000 μL pipette og ~ 800 μL PBS kan overføre homogenatet til en 100 μm pore celle si fastgjort til en 50 mL tube der indeholder 5 mL PBS til at opnå en enkelt cellesuspension. Gentag trin 2.4.2 for de yderligere milt. Ikke overstige 3 milt pr tube.
Forsigtighed Splenocytes passeret gennem filteret kan danne klumper, hvis de blev efterladt stående. Swirl manuelt rør periodisk, hvis forarbejdning flere milt for at undgå celle sammenklumpning. Resterende fragmenter på celle sien kan være yderligere mosede ved hjælp af et stempel fra en 5 mL sprøjte ved hjælp af minimal kraft. - Top op til 20 mL med PBS. Lag 20 mL cellesuspension forsigtigt på 20 mL af tæthed gradient medier (Table of Materials) i en 50 mL tube. Der centrifugeres den resulterende overlejres suspension på 800 x g i 20 min. med ingen bremse anvendes.
- Høste celler på grænseflade lag ved hjælp af en steril Pasteur pipette og overførsel til en 50 mL tube. Top op til 50 mL med PBS og centrifugeres ved 800 x g i 10 min at vaske. Supernatanten og genopslæmmes celler i komplet TCM.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Kultur celler med en tæthed på 5 x 106 celler/mL i komplet TCM med 30 ng/mL anti-CD3ε antistof (klon 145-2 C 11), 30 ng/mL anti-CD28 antistof (klon 37.51), 100 U/mL rekombinant humant IL-2 og 2 ng/mL rekombinant murine IL-7. Brug en passende størrelse vævskultur kolbe for mængden af celler høstet.
Bemærk: -Antigen præsentere celler er nødvendige for T-celle aktivering af CD3 og CD28 antistoffer, hvis arbejder med renset T celler det er nødvendigt at pelsen plader med antistoffer, eller bruge magnetiske perler (Tabel af materialer) - Inkuber mus splenocytes ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
- Dag 3: Fremstilling af plader til transduktion
- Pelsen ikke vævskultur 6-godt plader med 2 mL af 10 μg/mL rekombinant humant fibronektin fragmentere og inkuberes natten over ved 4 ° C.
- Dag 4: Transduktion af musen T celler
- Overføre rekombinant humant fibronektin fragment fra overtrukne plader til frisk ikke vævskultur 6-godt plader. Ruger disse plader natten over ved 4 ° C i runde 2 af transduktion.
- Tilsættes 2 mL TCM til hver brønd af oprindelige rekombinant humant fibronektin fragment-belagte plader og henstår i 30 min. ved stuetemperatur til at blokere ikke-specifik binding.
- Høste retrovirus-holdige supernatanten fra transfekteret Plat-E celler i 15 cm vævskultur retter og erstatte med 18 mL af komplet TCM.
Forsigtighed Arbejde hurtigt for at undgå udtørring af Plat-E celler.
Bemærk: Succes af Transfektion kan kontrolleres i denne fase af Fluorescens mikroskopi hvis udnytter en fluorescerende markørgen som mCherry (figur 1). - Retrovirus-holdige supernatanten filtreres på 0,45 μm filter til at fjerne celle debris. Fjern TCM fra Rekombinante humane fibronektin fragment-belagt 6-godt plader og tilsættes 2,5 mL af filtrerede retrovirus-holdige centrifugatet eller til hver brønd (brug komplet TCM til mock Transfektion). Label hver brønd, tilsætning af retrovirus eller mock medier.
- Der centrifugeres plader på 1200 x g i 30 min. ved stuetemperatur.
- Mens plader er spinning, indsamle aktiverede T-celler og tælle ved hjælp af en hemocytometer.
- Transduktion udføres med 5 x 106 aktiveret splenocytes i alt 5 mL/godt. Pellet det nødvendige antal splenocytes for mock/transduktion i separate rør ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
- Genopslæmmes splenocytes med en tæthed på 5 x 106 celler pr. 2,5 mL filtreret retrovirus-holdige supernatanten fra trin 2.6.4 eller TCM som en negativ kontrol. Tilføje rekombinant humant IL-2 (hIL-2) og rekombinant mus IL-7 (mIL-7) til en endelig koncentration på 200 IU/mL og 4 ng/mL.
- Indsamle 6-godt plader fra centrifugeres ved afslutningen af trin 2.6.5 og tilføje 2,5 mL/hul igen suspenderede splenocytes i passende wells til at gøre en endelige mængden af 5 mL/godt og en endelig koncentration på 100 U/mL hIL-2 og 2 ng/mL mIL-7.
- Der centrifugeres plader ved 1200 x g i 90 min ved stuetemperatur. Efter centrifugering, Ruger plader ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
- Dag 5: Runde 2 af transduktion
- Indsamle rekombinant humant fibronektin fragment fra pladerne, som dette kan genbruges. Gentag trin 2.6.2 - 2.6.5.
- Mens plader er spinning, indsamle celler fra 1st runde af transduktion ved hjælp af Pasteurs pipette. Skyl hver brønd med 2 mL PBS, swirl og indsamle de resterende celler i hver brønd.
Bemærk: Pipetteres op og ned for at genopslæmmes aflejret celler. Indsamle hver kontrol/transduktion gruppe i separate rør. - Centrifugeglas på 500 x g for 5 min. genopslæmmes celler i 2,5 mL pr. brønd af transduktion med 200 IU/mL IL-2 og 4 ng/mL IL-7. Gentag trin 2.6.7 - 2.6.8.
- Fjerne celler fra centrifugen og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 til 4 h. indsamle transduced celler som trin 2.7.2-2.7.3.
- Tælle celler, der centrifugeres ved 500 x g i 5 min og genopslæmmes i komplet TCM med en tæthed på 1 x 106 celler/mL med 100 U/mL hIL-2 og 2ng/mL mIL-7. Overføres til en passende størrelse kultur kolbe og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
- Tilføj frisk TCM medier indeholdende 100U/mL hIL-2 og 2ng/mL mIL-7 hver 2 dage, fastholde en celle på 1 x 106 celler/mL.
Bemærk: Høstede splenocytes indeholder en lang række celletyper. På disse betingelser, kultur, ikke T-celler dør i løbet af 2-3 dage. Efter ~ 4 dage i cellekultur, antallet af T-celle er typisk svarende til det samlede antal høstede splenocytes på dag 0.
3. måling af transduktion effektivitet
- På dag 4 indlæg transduktion, indsamle en prøve af transduced eller ikke-transduced T-celler (ca 3 x 105 celler). Centrifugeres cellesuspension ved 500 x g i 5 min, supernatanten, pelleted cellerne vaskes en gang med PBS og centrifugeres igen.
- Supernatanten og tilsæt 100 μL af PBS, som indeholder en egnet Amin reaktive farvestof (fx, live/døde pletter, 1 ud af 100 fortynding) pr. brønd. Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Vaskes to gange med PBS og centrifugeres ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og inkuberes med 50 μL af FACS buffer der indeholder anti-mus CD16/CD32 antistoffer for Fc receptor blokerende (1 ud af 100 fortynding). Der inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
- Direkte tilsættes 50 μl antistof farvning master mix der indeholder anti-mus CD4-BV786 og CD8-BV711 antistoffer (endelig koncentration på 1 μL/brønd i FACS buffer). Inkuber i 30 min. ved 4 ° C i mørke. Gentag trinnet vask 3.3. Cellerne i 1% PFA buffer genopslæmmes og holde den i mørke ved 4 ° C indtil analyse ved flowcytometri.
- Analysere celler med tilsvarende passende Flowcytometret ved hjælp af BV711, BV785 og mCherry fluorescens som markører af CD4 og CD8 delmængde og bil udtryk henholdsvis gating (figur 2).
4. in vitro validering af bil T celle aktivitet
- Seed syngeneic målrette CD19+ tumorceller med eller uden luciferase udtryk med en tæthed af 1 x 104 celler i 100 μL TCM/godt i en 96-brønd U-bund vævskultur plade.
- Tilføj 1 x 104 CD19 bil T celler/brønd i et volumen på 100 μL/brønd til at opnå en effektor mål (E:T) forhold på 1:1.
Bemærk: E:T nøgletal bør fastsættes for hver bil konstruere og målrette cellelinie. - Brug T celler alene og tumorceller alene som negative kontroller og T celler stimuleret af phorbol-myristate-acetat (PMA) (50 ng/mL) og ionomycin (1 μg/mL) som positiv kontrol for Interferon gamma (IFNγ) release. Fælles kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 til 16-24 timer.
- Efter fælles kultur, centrifugeres plader på 500 x g i 5 min og indsamle supernatanten for yderligere IFNγ og IL - 12 p 70 ELISA analyse.
Bemærk: Dette kan opbevares ved-80 ° C. - Genopslæmmes celle pellets i 100 μL af PBS, som indeholder luciferin (endelig koncentration på 1,5 mg/mL). Inkuber plader i 10 minutter ved 37 ° C. Derefter mål luminescence fra hver brønd med en egnet luminometrisk.
Bemærk: Eksponering gange skal være optimeret til cellelinjer og tæthed. Repræsentative resultater er vist i figur 3a. Ex-vivo cytotoksicitet af bil T-celler kan ændres at udtrykke luciferin ved co kultur med cellelinjer udtrykker target antigen. Som bil T-celler dræbe target-cellerne, luciferin er frigivet, derfor en reduktion i luminometry signal er korreleret med celle kill. Non-transduced celler kan ofte have en effekt på målet cellernes levedygtighed, især over lang inkubationstid perioder. Mål koncentrationen af murine IFNγ og IL - 12p 70 i supernatanten ifølge producentens ELISA protokoller. Repræsentative resultater er vist i (figur 3b og 3 c). Ex-vivo aktivering af bil T celler ved fælles kultur med cellelinjer udtrykker target antigen kan analyseres ved at analysere supernatanten indholdet ved hjælp af ELISA. Forholdet mellem bil T celle til target-cellerne og fælles kultur varighed skal optimeres for hver bil konstruktion, mål cellelinje og analysand. PMA og ionomycin behandling kan bruges som positiv kontrol for at bekræfte kvaliteten af T-celler og deres evne til at reagere.
5. vurdere anticancer aktivitet i mus
-
Protokol 1
- Udføre 100 mg/kg intravenøs (IV) levering af cyclophosphamid i 6-8 - uge BALB/c mus. Dette giver mulighed for tumor engraftment uden betydelige lymphodepletion17 (figur 4).
Bemærk: Lymfom kan tage mere end 2 måneder med en suboptimal tage oprette A20. Dette kan forbedres ved brug af cyclophosphamid 1 dag før leveringen af lymfom celler. For at studere lymphoreplete mus, identificeret vi en dosis af cyclophosphamid, der kan øge effektiviteten af lymfom uden at forårsage lymphodepletion. - Den næste dag, indsprøjtes 100 µL af 5 x 105 syngeneic A20 B-celle lymfom celler modificeret til at udtrykke luciferase og grønt fluorescerende proteiner (NGL) ind i musene ved intravenøs (IV) injektion.
- Tillad mus at udvikle systemiske lymfom for ~ 17 dage.
- Bekræfte tilstedeværelsen af systemisk lymfom ved intraperitoneal (IP) injektion af 100 μL af 30 mg/mL luciferin og billeddannelse ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system.
- Bruge separatorer til at undgå signal spillover til tilstødende mus. Udsætte mus for 1 min på den ventrale side med en konstant størrelse region af interesse.
- Vise relative lette enheder (RLU) som fotoner pr. sekund (p/s). Indstillingerne skal være optimeret til hver tumor model; bruge en eksponering, der kan afhente tidlig påvisning af tumorer, men ikke fører til mætning som tumorer nå slutpunkter.
- Optag samlede RLU for hver mus med en konstant størrelse region af interesse. (Figur 5a og b).
- Injiceres en enkelt dosis af 1 x 106 bil T celler ved IV injektion i lymphoreplete mus forsynet med nedsat lymfom.
Bemærk: (vigtigt) Dosering niveauer skal fastsættes for hver bil konstruere ved hjælp af en dosis eskalering tidsplan til at sikre, at enhver mulig toksicitet som følge af bil T-celler er karakteriseret og kan løses. Selvom anti-mus CD19 bil T celler ikke vise toksiciteter, kan bil T celler give anledning til uventede toksiciteter. Hvor flere bil konstruktioner og transduktion effektivitet ikke er identiske, bør det samlede antal T-celler administreres holdes lige ved tilsætning af ikke-transduced T-celler i celle præparater. - Overvåge sygdomsprogression ugentligt gennem IP injektion af 100 μL af 30 mg/mL luciferin og billeddannelse ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system (figur 5 c).
- Nøje overvåge mus for tegn på toksicitet og aflive en mus, der viser tidlige tegn på hind lemmer lammelse (HLP) eller patologiske tumor byrde før enhver lidelse kan opstå.
Bemærk: Toksicitet fra A20 lymfom kan omfatte hind lemmer lammelse gennem tumor invasion af meninges. Kontroller regelmæssigt for tidlige tegn på ændret gangart. Ligeledes kan store IP tumorer opstår, som kan føre til ubehag vist ved ændret adfærd. - Overvåge overlevelse af mus til 60-100 dage (fig. 5 d). Udføre eutanasi af en tidsplan-1 metode ved afslutningen af forsøget.
- Udføre 100 mg/kg intravenøs (IV) levering af cyclophosphamid i 6-8 - uge BALB/c mus. Dette giver mulighed for tumor engraftment uden betydelige lymphodepletion17 (figur 4).
-
Protokol 2
- Levere 200 mg/kg cyclophosphamid til 6 til 8 - uger gammel BALB/c mus ved halen vene injektion i 100 μL af PBS pr. mus.
- Den følgende dag, indsprøjtes 5 x 105 syngeneic A20 B-celle lymfom celler udtrykker luciferase og normal god landbrugspraksis i 100 μL PBS via hale vene injektion.
- Tillad mus at udvikle systemiske lymfomer for ~ 7-14 dage
- Bekræfte systemisk lymfom ved IP injektion af 100 μL af 30 mg/mL luciferin og billeddannelse ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system.
- Udføre 5 Gy kroppens samlede bestråling (TBI) 0,02 Gy/min. for lymphodepletion.
Bemærk: Patienter, der gennemgår bilen T-celle behandlinger underkastes en række regimer at opnå lymphodepletion, før administration af bil T-celler, hvilket øger engraftment af adoptively overført bil T-celler. Dette kan replikeres i mus med kroppens samlede bestråling (TBI) (figur 6). - Den næste dag, indsprøjte 1 x 106 bil T celler i 100 μL af PBS via hale vene indsprøjtning ind i musene forsynet med etableret tumorer.
- Indsamle blod prøver via hale vene blødninger efter 7 dage.
- Føje roede blodlegemer lysisbuffer til hver blodprøve og derefter forberede flowcytometri, som beskrevet i afsnit 3. Analysere bil T celle persistens i omløb ved flowcytometri (figur 2).
Bemærk: Tilsætning af tælle perler umiddelbart før flowcytometri tillader bestemmelse af antallet af bil T celler pr. milliliter blod. - Overvåge sygdom fremskridt, som beskrevet i trin 5.1.5 - 5.1.8 (figur 7).
Representative Results
For højeffektiv transduktion af T-celler er det nødvendigt at få friske retroviral partikler. Transfektion af Plat-E cellelinie med pCL-Eco producent plasmid og pMP71 retrovirus plasmid giver anledning til sekretion af retroviral partikler ind i cellen supernatanten. Når en fluorescerende markørgen, såsom mCherry, er kodet i retrovirus, kan vellykket Transfektion bekræftes ved Fluorescens mikroskopi (figur 1). Virus-holdige supernatanten fra transfekteret Plat-E celler der bruges til at transduce T-celler via 2 runder af spin-fection på fibronektin fragment-belagte plader. Effektiviteten af transduktion kan bestemmes 4 dage efter transduktion via flowcytometri. Med held transduced celler express markørgen kodet i retrovirus (figur 2). Transduktion effektivitetsgevinster spænder fra ~ 50-90% effektivitet med første generation receptorer til ~ 10-40% med bil konstruerer tæt på retroviral emballage kapacitet. Mens markør genekspression viser vellykket retroviral transduktion, er det altafgørende at vise funktionaliteten af bil T celler efter engagerende med celler at udtrykkelige mål antigen på deres overflade. Target cellelinjer modificeret til at udtrykke luciferase kan bruges i luciferase assays for at afprøve graden af celle-kill af bil T celler direkte (figur 3A). Frigivelsen af effektor cytokiner fra bil T celler ved fælles kultur med target-cellerne, bestemmes af ELISA, kan også bruges som et indirekte mål for bil T celle cytotoksicitet (figur 3B og 3 C).
BIL T celler fremstillet i denne protokol kan evalueres i lymphoreplete mus ved at etablere systemisk A20 lymfom med en 100 mg/kg dosis af cyclophosphamid (injiceres intravenøst), 1 dag før IV injektion af 5 x 105 A20 celler (figur 4). IP injektion med luciferin og image capture ved hjælp af en i vivo bioluminescens imager kan bruges til at overvåge tumoren byrde ved hjælp af en konstant ROI og eksponering tid hele (figur 5A-C). BIL T celler ændret til udtrykkelige IL-12 er i stand til at udrydde systemisk lymfom med lymphodepleting forudgående konditionering giver sygdomsfri overlevelse i omkring 25% af mus (fig. 5 d). Lymphodepleting forkonditionering, forbedrer opnået ved 5 Gy TBI 1 dag før IV administration af bil T celler, væsentligt engraftment (figur 6). I denne model er første generation bil T celler i stand til at udrydde systemisk A20 lymfom, typisk inducerende sygdomsfri overlevelse i 100% af mus (figur 7).
Figur 1. Bekræftelse af vellykket Transfektion af Plat E celler. Plat-E celler transfekteret med retroviral bil konstruktion og pMP71 og pcl-Eco emballage vektor plasmid DNA. Vellykket Transfektion er vist ved ekspression af mCherry fluorescerende markørgen. A) lysfelt mikroskopi, B) Fluorescens mikroskopi og C) flettede billeder vises. Forstørrelse = 50 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bestemmelse transduktion effektiviteten ved flowcytometri. Flowcytometri bruges til at bestemme transduktion effektiviteten af musen T celler på dag 4 indlæg transduktion, ved hjælp af Zombie UV live/døde, mCherry, BV711 og BV785 til påvisning af den levende, bil konstruere, CD4 og CD8-celler, henholdsvis. Repræsentative resultater af A) ikke-transduced, B) mCherry.αmCD19.mCD3z og C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 er vist med gating 1) slåbrokker 2) levende celler 3) CD4 og CD8 4) og 5) vurderingen af mCherry positive celler udtrykker bil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Validering af bil T-celle aktivitet. ΑmCD19 bil T celler var Co kulturperler med A20 lymfom celler modificeret til at udtrykke luciferase (1 x 104: 1 x 104) til 16 h i en U-bunden 96-brønd plade. Efter fælles kultur, cellerne var pelleted, og supernatanten blev indsamlet. A) celler blev igen suspenderet i PBS og luminometry blev brugt til at vurdere levedygtigheden af target-cellerne. Supernatanten fra Co kultur blev vurderet for tilstedeværelse af IFNγ (B) og IL-12 (C). Forholdet mellem bil T celle til target-cellerne og fælles kultur varighed skal optimeres for hver bil konstruere og målrette cellelinie. PMA og ionomycin behandling kan bruges som positiv kontrol for at bekræfte kvaliteten af T-celler og deres evne celler til at reagere. Fejllinjer Vis SD. statistisk analyse blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA. p < 0,001). Dette tal er blevet ændret fra17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Oprettelse af A20 lymfom uden lymphodepletion. Cyclophosphamid kan øge effektiviteten af lymfom induktion uden at forårsage lymphodepletion. A) blodtal af 6-8 uge gamle BALB/c mus efter IV levering af 100 mg/kg af cyclophosphamid. Fejllinjer Vis SD B) lymfom byrde af 6-8 uge gamle BALB/c mus efter IV levering af 100 mg/kg af cyclophosphamid eller saltvand på dag -1 og IV levering af 5 x 105 A20 celler på dag 0 målt ved hjælp af en luminometrisk. C) overlevelse af mus i B). Fejllinjer Vis SD. statistisk analyse blev udført ved hjælp af 2-vejs ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001). Dette tal er blevet ændret fra Kueberuwa et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Overvågning af lymfom byrde og overlevelse. Mus forsynet med A20 lymfom udtrykker luciferase modtage 100 µL intraperitoneal (IP) injektioner af 30 mg/mL luciferin og blev afbildet ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system. A) mus blev udsat for 1 min på den ventrale side og straks vendt billedet dorsal til afhente tumor masserne på begge sider af organer (B). C) repræsentative resultater af lymfom byrde af BALB/c mus modtage varierende αmCD19 bil T celler uden lymphodepletion. Fejllinjer Vis SEM. D) overlevelsesraten for de samme mus. Dette tal er blevet ændret fra Kueberuwa et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Effekter af lymphodepletion. A) blodtal af 6-8 uge gamle BALB/c mus efter at have modtaget 5 Gy TBI ved en dosering på 0,02 Gy/min; fejllinjer Vis SD. statistisk analyse af to-vejs ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) overvågning af CD4+ og CD8+ bil T celler i det perifere blod af mus ved flowcytometri for mCherry markør gen 7 dage post administration. Fejllinjer Vis SD. Dette tal er blevet ændret fra Kueberuwa et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. BIL T-celleaktivitet med lymphodepleting før conditioning. Typiske resultater viser effekten af 5 Gy TBI dagen før bil T-celle administration. A) Imaging og (B) grafiske displays af billeddannelse af mus efter 100 µL intraperitoneal (IP) injektioner af 30 mg/mL luciferin ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system. Fejllinjer Vis SEM. C) overlevelse af de samme mus. Dette tal er blevet modificeret fromKueberuwa et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Syngeneic musemodeller giver mulighed for afprøvning af sygdomsprogression og terapi samtidig opretholde en intakt immunsystemet. Det er altafgørende, når det kommer til behandlingsformer, der interagerer med immunsystemet og i særdeleshed for immunterapeutisk agenter.
Protokollen beskrevet her har to kritiske arbejdsstrømme, den ene er genetisk ændring af mus T celle for at udtrykke biler. Dette kræver 7 dage fra indledningen til validering af transduktion. Samtidig med produktion af bil T celler er oprettelsen af systemisk lymfom hos mus. Skal bilen T celle produktion mislykkes, eller kvalitet at være utilstrækkelig, der ikke er typisk nok tid til at producere udskiftning celler før mus bukke under for lymfom. Derfor er det afgørende, at forskere bruger disse modeller præcist udføre tumor dosering og sygdom progression undersøgelser for at med held tid produktion af bil T-celler til terapeutiske administration.
Typiske årsager til lav T-celle transduktion effektivitet omfatter dårlig Transfektion effektivitet af producent celler, typisk forårsaget af dårlig plasmid renhed eller unøjagtige bestemmelse af pH-værdien af Transfektion medier. Det anbefales at kontrollere effektiviteten af producent celle Transfektion inden vi går videre med den fulde protokol som fattige Transfektion vil begrænse effektiviteten af T-celle transduktion. Rekombinante humane fibronektin fragmenter kan indsamles og opbevares ved-20 ° C til genbrug, men flere fryse-smelter resultere i reducerede transduktion effektivitet. Hurtig behandling af musen milt efter samling er også vigtige for at opnå høje udbytter af levedygtige T celler.
Det skal bemærkes, at protokollen beskrevet her udnytter A20 celler udtrykker luciferase. Det foretrækkes, da det giver mulighed for at måle systemisk tumor byrde af bioluminescens billeddannelse. Men i nærværelse af en funktionel immunsystemet, svar til luciferase kunne skew resultaterne. Vi har tidligere testet immun reaktioner af overlevende mus markør transgener17. Det er nøglen til at replikere centrale eksperimenter ved hjælp af A20 celler gratis af transgener til at validere som disse ikke spiller en væsentlig rolle i tumor udryddelse af immunceller.
Mens kliniske agenter kan kun være brugt i vivo i immun-mangelfuld mus, tillader brug af mus bil T celler mod mus kræftceller os at vurdere bidragene fra immunsystemet til terapeutisk virkning eller sygdom progression. Denne protokol kunne udnyttes til præ-klinisk evaluering af biler målretning B-celle lymfom eller andre biler med yderligere ændringer såsom sekretion af IL-12 som beskrevet her. Det skal bemærkes, at selv om samspillet mellem immunceller kan evalueres i syngeneic musemodeller, ikke kan de præcist sammenfatte interaktion i mennesker i vivo. Især bemærke, menneskelige og mus biler vil variere i den struktur, der kan få downstream konsekvenser; optimal aktivering og celle kultur betingelser for vækst af T-celler er forskellige20, væv distribution af target antigen udtryk kan variere mellem mennesker og mus og erfarne toksicitet kan være radikalt anderledes. Det er derfor vigtigt at udnytte ex vivo og xenogene modeller til at underbygge resultater.
I Resumé sammenfatte syngeneic lymphodepleted og lymphoreplete model af lymfom patienter med og uden forudgående kemo/strålebehandling. Dette giver et modelsystem til at efterligne de kliniske indstillinger for at tillade afprøvning af en række terapeutiske strategier, der vil være vigtigt med den kommende bølge af nye immun terapi agenter.
Med brugen af forudgående konditionering, vil det bemærkes, at alle mus typisk klare lymfom. Med er op til 90% komplet svarprocenter i mennesker, dette repræsentativt. Dog udfordringer for CD19 bil T-celle terapi vil afhænge af, at forebygge den høje frekvens af tilbagefald observeret, der ofte CD19. Tilbagefald er ikke blevet observeret i denne model op til, og ofte mere end 100 dage. Ændringer til at efterligne tilbagefald ses i klinikken kunne hjælpe med de fremtidige udfordringer i CD19 bil T-celle terapi.
Disclosures
David Gilham virker for Celyad, som er involveret i fremstilling af bil T-celler. Resten af forfatterne har intet at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Bloodwise for finansieringen af denne forskning (grant 13031) og de CRUK Manchester biologiske resource enhed, billedbehandling og flowcytometri og molekylærbiologi core faciliteter til støtte for dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
- Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
