Summary
Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van bloedmonsters van de rat subclavian ader.
Abstract
Bloedinzameling met genoeg bloed volume is essentieel in dierproeven. Bloedinzameling van de ader van de staart van ratten is populair en minder stressvol vergeleken met andere meer agressieve methoden zoals retro-orbitaal plexus monster collectie. Echter wordt deze bloed collectie methode soms beperkt door een onbevredigende slagingspercentage. Hier introduceren we een methode voor bloedinzameling via de subclavian ader punctie. De subclavian ader ligt net onder het sleutelbeen en deze ader is groot genoeg om te voldoen aan de eisen van het volume van bloed collectie. Onze resultaten tonen aan dat deze methode veilig en die van toepassing zijn voor bloedmonsters van de collectie met het bloed van de vereiste volume is. Bloedinzameling via de subclavian ader punctie kan dienen als een alternatieve bloed collectie methode in het geval van mislukte staart veneuze bloedmonsters bij ratten.
Introduction
Bloedinzameling is essentieel in het dierlijke onderzoek. De aders van de doelgroep voor bloedinzameling omvatten de retro-orbitaal plexus, de halsslagader, de saphenous ader, staart bloedvaten en de halsslagader1,2,3,4. Soms kon bloed worden verkregen van de abdominale aorta, vena cava of zelfs het hart5,6,7. Bij dergelijke gelegenheden, de dieren moeten worden opgeofferd en kunnen niet worden gebruikt voor verdere observatie; Dus, deze methoden worden gebruikt minder in dagelijkse experimenteel werk. Bloedinzameling van de ader van de staart van ratten is populair en minder stressvol ten opzichte van de hierboven genoemde methoden8.
Echter is bloedinzameling van de ader van de staart soms beperkt door een onbevredigende slagingspercentage. Af en toe, is het ook moeilijk om genoeg bloed-volume door deze methode. Zoals de subclavian ader groot genoeg is en net onder het sleutelbeen bot ligt, kunnen subclavian ader punctie een alternatieve methode voor het bloed bemonstering als routine bloed vergaringsmethoden mislukt zijn. Hier introduceren we een methode van bloed collectie door middel van subclavian ader punctie bij ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de centrale Zuid-Universiteit ethisch comité voor onderzoek van het dier uit het tweede Xiangya ziekenhuis (Changsha, China). Het manuscript werd voorbereid volgens aankomen (dier onderzoek: rapportage van In Vivo experimenten) richtsnoeren9.
1. materiaal en dier voorbereiding
- Voorbereiden van benodigde materialen: epileren agent, 75% ethanol, plakband, bloed collectie buis, 2,5 mL spuit verbonden met naald (24 G, 0.6 mm x 25 mm), haar scheerapparaat, elektronische schaal en gauge (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik 20 Sprague-Dawley (SD) ratten, leeftijd 8-10 weken en gewicht 153-200 g (Zie Tabel van materialen). Ratten volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren10te handhaven.
- Huis ratten onder standaardomstandigheden met gratis toegang tot voedsel en drinkwater. Houd ze in 530 cm2 kooien met hout-scheren beddengoed (2 ratten per kooi). Houden van dieren in een temperatuur gecontroleerde kamertemperatuur van ongeveer 25 ° C.
- Narcose induceren (natrium pentobarbital 40 mg/kg) in alle dieren door intraperitoneale injectie vóór de punctie subclavian ader.
- Plaats de rat in een liggende positie. Bevestigen van de achterste ledematen in een comfortabele positie en monteren van bovenste extremiteit evenwijdig aan de aslijn van de lichaam net naast de kofferbak.
Opmerking: Geen mechanische ventilatie is nodig voor deze procedure (Figuur 1). - Reinig beide zijden van de infraclavicular-ruimte te verwijderen bont (met haar scheerapparaat en epileren agent, Zie Tabel van materialen) en zichtbaar vuil. Veeg de nek en borstwervels huid met 75% ethanol. Houd het gebied voor punctie schoon en droog met gaas.
2. bloed verzameling Procedure
Opmerking: Beide zijden van de ader van de subclavian zijn geschikt voor punctie, en hier kiezen we de rechterkant voor punctie. De locatie en richting van het juiste sleutelbeen worden geïdentificeerd door de exploitant van de linker duim (Figuur 2). De suprasternal fossae zijn zachtjes aangeraakt met de wijsvinger, zoals de suprasternal fossae is in de richting van de naald (Figuur 2).
- Spoel een steriele 2,5 mL injectiespuit met heparine oplossing (10 IU/mL).
- Ga naar de site van de punctie 0.5 mm caudal aan de buitenste regio van de 1/3 van de juiste sleutelbeen (Figuur 3). Verplaats de spuit zachtjes in de huid van de punctie-site. Zodra de naald de infraclavicular huid treedt, toepassing onderdruk met de exploitant van de rechterhand (Figuur 4).
Opmerking: Het volume van de gemiddelde en maximale bloed zijn 1,0 mL en 1,4 mL, respectievelijk. De richting van de naald is gepositioneerd richting de suprasternal fossae en moet bijna parallel aan de clavicula gewoon posterieure ernaar. Meestal is de subclavian ader bereikbaar door het invoegen van de naald ongeveer 2 mm in deze richting. Zodra de naald de ader ingaat, treedt bloed de spuit onder negatieve druk.- Onderdruk handhaven totdat voldoende hoeveelheid bloed wordt getekend (Figuur 5).
- Als de subclavian veneuze bloed collectie niet succesvol is, terugtrekken van de naald naar het subcutane gebied en draai de richting van de naald iets interieur aan het borstbeen.
- Als drie pogingen mislukken, Vermijd de subclavian ader vanaf dezelfde kant en gebruik van de contralaterale zijde voor bloedmonsters.
- Na de bloedinzameling, verwijder de naald punctie en druk uitoefenen op de site van de lekke band voor 1-2 minuten om te stoppen met bloeden.
Opmerking: De druk moet zeer zacht om te voorkomen dat verstikking.
3. bloed monster Processing
- Breng het bloedmonster in een antistollingsmiddel beklede vacuüm buis (EDTA) en Centrifugeer gedurende 10 min bij 1600 x g voor het verzamelen van plasma.
- Gecombineerd het supernatant om een schone buis en sla bij-80 ° C (Figuur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een totaal van 20 SD ratten (mannelijke n = 10, vrouwelijke n = 10) hier werden gebruikt. Bloed collectionwas uitgevoerd door ervaren ondernemers, die hebben meer dan 20 bloed bemonsteringen uitgevoerd vanaf de subclavian ader bij ratten, en de exploitanten van de beginner, die hebben geen subclavian ader punctie ervaring in ratten of andere dieren. Voor activiteiten keek beginners ten minste 3 procedures gedaan door bekwame operatoren.
Bloedmonsters erin 17 ratten door middel van de juiste subclavian veneuze toegang. Deze procedure mislukt bij 3 ratten (1 in de geschoolde groep) en 2 in de groep van de beginner, en bloedmonsters was succesvol door de linker subclavian ader toegangen in deze 3 ratten. Het tijd cursus en bloed volume verzameld voor elk afzonderlijk geval worden geïllustreerd in tabel 1. Het slagingspercentage was vergelijkbaar tussen de beginner groep (80%) en de geschoolde groep (90%, p = 0.531). Het slagingspercentage was 100% voor beide groepen wanneer met inbegrip van de extra links subclavian ader toegangen bij de 3 ratten. Twee tailed Student t-test toonde aan dat er geen significant verschil op tijd uitgegeven tussen beginner groep en geschoolde groep was (102.1 ± 14,9 s versus 84.3 ± 9,7 s, p = 0,33, Figuur 7). Er is geen ernstige complicaties opgetreden in alle procedures zoals pneumothorax, hemopneumothorax of grote bloeden tijdens of na de operatie. Alle dieren overleefde en hersteld binnen 30 minuten na de bloedmonsters.
Om aan te tonen de problemen van het leren van de procedure van de punctie, wij verder ten opzichte van het aantal opnames tussen ervaren en beginnende groepen. Zoals blijkt uit tabel 2, het gemiddelde aantal opnames in de geschoolde groep is iets minder dan de beginner groep (1.6 ±0.3 vs. 2.5 ±0.4), maar er is geen statistische betekenis (p = 0.0913).
Figuur 1 : Positie van ratten. De ratten zijn gelegd in een liggende positie, en de bovenste ledematen evenwijdig aan de as van het lichaam, net naast de stam zijn vastgesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Identificeren de oppervlakte symbolen van ratten. (A) de linker duim van de exploitant is op de juiste sleutelbeen te identificeren van de locatie en de array van dit bot; (B) de suprasternal fossae zijn zachtjes aangeraakt met de wijsvinger. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Locatie van punctie. De site van de punctie is gelegen 0.5 mm caudal op de buitenste 1/3-site van het juiste sleutelbeen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vormen van negatieve druk in de injectiespuit. Zodra de naald de infraclavicular huid ingaat, verplaatsen de vingers van de rechterhand te maken van de negatieve druk in de spuit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Intrekking van bloed in de injectiespuit. Wanneer de naald in de ader van de subclavian, treedt bloed de spuit onder negatieve druk. De negatieve druk wordt gehouden, totdat voldoende bloed is verkregen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Plasma extractie na centrifugeren. Na centrifugeren wordt het bloed onderverdeeld in plasma en cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : De tijd cursus en succes tarief tussen verschillende groeperingen. Deze grafiek toont geen significante verschillen in de tijd (linkerdeel) of succes tarief (rechtervenster) tussen de geschoolde groep en de groep van de beginner. De tijd natuurlijk in de Fractie van de beginner en de bekwame 102.1 ± 14,9 s en 84.3 ± 9,7 s, respectievelijk, p = 0,33 tussen groepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : De anatomie van subclavian ader. De subclavian ader ligt gewoon posterior en caudal aan het sleutelbeen. Het sluit zich aan bij de interne halsslagader aan formulier de ader brachiocephalic en watert in super vena cava, net onder de fossae van de suprasternal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| geschoolde groep | Beginner groep | |||||||||
| Geslacht | Lichaamsgewicht (g) | Bloed volume (mL) | Tijdsverloop (S) | Geslacht | Lichaamsgewicht (g) | bloed volume (mL) | Tijdsverloop (S) | |||
| S1 | man | 153 | 1.6 | 70 | B1 | man | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | man | 168 | 1.6 | 60 | B2 | man | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | vrouw | 183 | 1.6 | 75 | B3 | vrouw | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | vrouw | 170 | 1.6 | 74 | B4 | vrouw | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | vrouw | 159 | 1.6 | 65 | B5 | vrouw | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | man | 200 | 1.6 | 83 | B6 | man | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | man | 178 | 1.6 | 86 | B7 | man | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | man | 187 | 1.6 | 168 | B8 | man | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | vrouw | 192 | 1.6 | 83 | B9 | vrouw | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | vrouw | 157 | 1.6 | 79 | B10 | vrouw | 175 | 1.6 | 178 | |
Tabel 1: De bloed omvang en het tijdstip cursus uit lekke band tot een afgewerkt bloedinzameling. S: geschoolde groep; B: beginners.
| Groep | n | Gemiddelde | SE | 95% conf. Interval | |
| B | 10 | 2.5 | 0.4 | 1,59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
Tabel 2: Het aantal opnamen tussen de twee groepen. B: beginners; S: geschoolde groep. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we een alternatieve methode om bloed te onttrekken aan de subclavian ader en we laten zien dat deze methode is van toepassing, haalbaar en veilig voor bloedmonsters bij ratten. Deze methode is afgeleid van de pacemaker-implantatie van de voorsprong voor patiënten11lekke subclavian ader. De subclavian ader ligt gewoon posterior en caudal aan het sleutelbeen en is een voortzetting van de axillaire ader. Het loopt van de buitenste rand van de eerste rib naar de mediale rand van voorste scalene spier12. Vanaf hier, het sluit zich aan bij de interne halsslagader te vormen van de ader van de brachiocephalic en watert in super vena cava, net onder de suprasternal fossae (Figuur 8). De clavicula is gemakkelijk geïdentificeerd en er is een duidelijke anatomische relatie tussen de subclavian ader en het sleutelbeen. Hier, we deze klinische vaardigheid toegepast op dierproeven. Als gevolg van de verschillende oriëntatie van de bovenste extremiteit bij mensen en ratten, bovenste extremiteit ligt net naast de kofferbak tijdens de procedure voor het blootstellen van de ruimte caudal aan het sleutelbeen, die de punctie (Figuur 1 vergemakkelijken zal).
De ader van de subclavian is veel groter dan de staart ader. Daarom is het makkelijker om voldoende bloed uit de ader van de subclavian dan uit de ader van de staart. Het totale monstervolume kan oplopen tot 10% van totale circulerende volume bloed elke keer1. Als conventionele staart veneuze bloedmonsters of een andere route mislukt, kunnen onderzoekers de subclavian ader-punctie overwegen. Narcose is vereist om deze procedure, en dit is een belangrijke beperking van deze procedure. We gebruiken hier, pentobarbital natrium voor narcose. Vergeleken met andere stoffen, pentobarbital natrium is eenvoudig te injecteren, en geen andere speciale instrumenten nodig zijn. Tsukamoto et al. rapporteerde dat inademing Isofluraan had de meest stabiele SpO2 dan andere agenten en korte hersteltijden. In centra met inhalatieapparatuur, kan Isofluraan13worden beschouwd. Bovendien, als de subclavian ader in de buurt van de borstholte ligt, we moeten oppassen om te voorkomen dat strenge procedure-gerelateerde complicaties zoals pneumothorax en hemopneumothorax. De richting van de naald moet zorgvuldig worden gericht om deze complicaties te vermijden. De naald is hier, altijd geplaatst, parallel aan de clavicula en gewoon naar het posterieure en verplaatste zachtjes richting de suprasternal fossae. De resultaten tonen aan dat gebruik van boven techniek mogelijke complicaties kan voorkomen. Vermijd elke neerwaartse richting van de naald naar de borstholte in deze procedure. Ook moet de diepte van de ader van de subclavian altijd worden bewaard ongeveer 2 mm vanaf de punctie-site.
Af en toe, de pogingen van de ene kant kunnen mislukken. Wij stel niet meer dan 3 pogingen vanaf dezelfde kant. Gebruik in dergelijke omstandigheden, de andere kant voor punctie, die het succestarief van bloedmonsters kan verbeteren. Ter verdere illustratie van de haalbaarheid van onze methode, testten we de slagingspercentage en de tijd tussen een beginner groep en een geschoolde groep uitgegeven. Interessant, er waren geen statistische significantie tussen deze groepen (p = 0,33), die bleek de uitvoerbaarheid van deze nieuw ontwikkelde methode.
Zoals hier besproken, is de belangrijkste beperking het slagingspercentage aan de ene kant. Als de procedure mislukt, de andere kant van de ader van de subclavian moet worden beschouwd. Narcose wordt gebruikt in deze procedure en de hersteltijd gemiddeld ongeveer 30 min met pentobarbital natrium. Isofluraan inademing verdoving heeft een veel kortere hersteltijd en de goedkeuring van nieuwe methoden van de verdoving kan nuttig zijn bij het verminderen van de duur van de procedure. We laten zien dat deze methode is van toepassing op de ratten, maar we niet de toepasbaarheid op kleinere dieren zoals muizen getest hebben.
Kortom, blijkt de studieresultaten dat de subclavian ader punctie methode voor bloed monster collectie veilig en haalbaar bij ratten. Deze methode is vooral waardevol wanneer grote hoeveelheden bloed nodig zijn. Deze methode is een optimale alternatief als conventionele bloed bemonsteringsprocedures mislukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd gesteund door de subsidie uit nationale Natural Science Foundation van China nr. 81670269, nr. 81500355 en nr. 81500226.
Acknowledgments
Geen verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
