Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

doi: 10.3791/58503 Published: June 28, 2019

Summary

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية حاسمة للخلايا. في الدماغ، وهو مطلوب للتغيرات التكيفية. قياس معدلات تخليق البروتين في الدماغ سليمة يتطلب اعتبارات منهجية متأنية. هنا نقدم L-[1-14C]-leucine طريقة أوتوراديوغرافية كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي.

Abstract

مطلوب تخليق البروتين لتطوير وصيانة وظيفة الخلايا العصبية وتشارك في التغيرات التكيفية في الجهاز العصبي. وعلاوة على ذلك، يعتقد أن خلل تنظيم تخليق البروتين في الجهاز العصبي قد يكون النمط الظاهري الأساسي في بعض اضطرابات النمو. قياس دقيق لمعدلات تخليق البروتين الدماغي في النماذج الحيوانية مهم لفهم هذه الاضطرابات. تم تصميم الطريقة التي قمنا بتطويرها ليتم تطبيقها على دراسة الحيوانات مستيقظا، تتصرف. بل هو طريقة أوتوراديوغرافيا كمية، لذلك يمكن أن تسفر عن معدلات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد. ويستند الأسلوب على استخدام الأحماض الأمينية التتبع، L-[1-14C] -ليوسين، ونموذج حركي لسلوك L-ليوسين في الدماغ. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كما التتبع لأنه لا يؤدي إلى المنتجات الأيضية خارج المسمى. يتم دمجها إما في البروتين أو استقلاب بسرعة لإنتاج 14CO2 الذي يتم تخفيفه في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ. كما تسمح الطريقة والنموذج بمساهمة ليوسين غير المسمى المستمد من الانُسِّال الأنسجة يُستمد من الانُسِّما الأنسجة في مجمع السلائف للأنسجة من أجل تخليق البروتين. هذه الطريقة لديها القرار المكاني لتحديد معدلات تخليق البروتين في الخلايا وطبقات neuropil، فضلا عن النوى العصبية تحت المهاد واليورانيوم. وللحصول على بيانات كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ، من المهم التقيد بالتفاصيل الإجرائية. هنا نقدم الإجراءات التفصيلية للطريقة الكمية الأوتوراديوغرافية L-[1-14C]-leucine لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين في الجسم الحي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية هامة مطلوبة للتغيير التكيفي على المدى الطويل في الجهاز العصبي1. تثبيط تخليق البروتين كتل تخزين الذاكرة على المدى الطويل في كل من اللافقاريات والفقاريات2. تخليق البروتين ضروري للحفاظ على المراحل المتأخرة من بعض أشكال التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب على المدى الطويل (LTD)3، بقاء الخلايا العصبية أثناء التنمية4، وللصيانة العامة للخلية العصبية ولها اتصالات متشابك5. قد يكون قياس معدلات تخليق بروتين الدماغ أداة هامة لدراسة التغيرات التكيفية وكذلك اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات المتعلقة بالتعلم والذاكرة.

لقد قمنا بتطوير طريقة لتحديد معدلات تخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي في الحيوان مستيقظا الذي يقدم مزايامتأصلة على التقنيات الأخرى التي تقدر معدلات في الجسم الحي السابق أو في المختبر الاستعدادات من أنسجة الدماغ 6. قبل كل شيء هو التطبيق على القياسات في الدماغ سليمة في الحيوان مستيقظا. هذا هو الاعتبار الرئيسي لأنه يسمح القياسات مع بنية متشابك وظيفة في مكان ودون مخاوف حول آثار ما بعد الوفاة. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الكمّي الذي نستخدمه يحقق درجة عالية من التعريب المكاني. في حين أن الطاقة من 14C هو من هذا القبيل أننا لا يمكن توطين التتبع على المستوى دون الخلوي أو الخلوي، يمكننا قياس معدلات في طبقات الخلايا ومناطق الدماغ الصغيرة مثل النوى تحت المهاد، مع ما يقرب من 25 ميكرومتر القرار7.

أحد التحديات في قياسات الجسم الحي مع radiotracers هو التأكد من أن تسمية الراديو تقاس هو في نتاج رد فعل الفائدة بدلا من غير رد فعل المسمى السلائف أو غيرها من المنتجات الأيضية الخارجية المسمى6. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كحمض أميني التتبع لأنه إما دمجها في البروتين أو استقلاب بسرعة إلى 14COوالتي يتم تخفيفها في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ الناجمة عن ارتفاع معدل استقلاب الطاقة8. وعلاوة على ذلك، أي 14C غير المدرجة في البروتين موجود في المقام الأول كما الحرة [14C] -ليوسين، والتي على مدى 60 دقيقة الفترة التجريبية، يتم تطهيرها تماما تقريبا من الأنسجة6. ثم يتم تثبيت البروتينات على الأنسجة مع الفورمالين وشطفها في وقت لاحق مع الماء لإزالة أي حر [14C] -ليوسين قبل التصوير الشعاعي.

وثمة اعتبار هام آخر هو مسألة تخفيف النشاط المحدد لتجمع الأحماض الأمينية السليفة بواسطة الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدة من البروتيوليسيا الأنسجة. لقد أظهرنا أنه في الفئران والفئران الكبار، حوالي 40٪ من تجمع ليوسين السلائف لتخليق البروتين في الدماغ يأتي من الأحماض الأمينية المستمدة من انهيار البروتين6. يجب أن يتم تضمين ذلك في حساب المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) ويجب تأكيده في الدراسات التي قد تتغير فيها هذه العلاقة. وقد عُرض الأساس النظري وافتراضات الطريقة بالتفصيل في أماكن أخرى6. وفي هذه الورقة، نركز على المسائل الإجرائية لتطبيق هذه المنهجية.

وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد rCPS في السناجب الأرض9، الأغنام10، الفئران الركيس11، الفئران12،13،14،15،16 , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21، نموذج الماوس من التصلب الدرني مجمع22، نموذج الماوس من متلازمة X الهشة23،24،25،26، الهشة X الفئران premutation27، و نموذج الماوس من فينيلكيتونيوريا28. في هذه المخطوطة، نقدم إجراءات قياس rCPS مع طريقة L-[1-14C]-leucine في الجسم الحي. نحن نقدم rCPS في مناطق الدماغ من فأر التحكم مستيقظا. كما نثبت أنه في إدارة الجسم الحي للإيزوميسين، وهو مثبط للترجمة، يلغي تخليق البروتين في الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة المعهد الوطني لرعاية الحيوانات واستخدامها في مجال الصحة العقلية، وتم تنفيذها وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية الحيوانات واستخدامها.

ويرد في الشكل 1عرض عام للبروتوكول.

1. زرع القسطرة جراحيا في الوريد الفخذي والشريان لإدارة التتبع وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب، على التوالي. جراحة كاملة على الأقل 22 ساعة قبل إدارة التتبع. تتطلب الجراحة حوالي ساعة واحدة لإكمالها.

  1. جمع المواد اللازمة: الأدوات الجراحية المعقمة (مقص الجراحية، مقص صغير، ملقط، ثلاثة السنانير الجلد الجراحية)، والمعدات اللازمة للتخدير isoflurane (مرذاذ isoflurane، الزبال الغاز النشط، غرفة التخدير مختومة، التخدير مخروط الأنف)، مرحلة جراحة معقمة، كليبرز الفراء، 70٪ الإيثانول، بيتادين، شاش معقمة، الشريط الجراحي، تدفئة اليد التجارية، المجهر الجراحي، معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة)، الهيبارين المعقمة 100 وحدات USP / مل في 0.9٪ كلوريد الصوديوم (heparinized ملحي)، معقمة خمسة شرائط 20 سم من 6-0 خياطة قابلة للامتصاص، معقمة 25 سم خيوط من PE-8و PE-10 البولي ايثيلين القسطرة مع قطع نهاية واحدة في 45 س، معقمة 1 المحاقن سم مكعب، معقمة 32 الإبر قياس، معدات الكي، معقمة 15-20 سم غير القابل للصدأ جوفاء قضيب فولاذي (قطر داخلي 2.5 مم، قطر خارجي 3 مم)، مخدر موضعي (مرهم بوبيفاكاين وليدوكاين)، وحاوية حيوانية مع إعداد ملحق دوار (30 سم زر حبل الربيع، دوار، جبل دوار وذراع، 20 × 13 سم أسطواني واضح حاوية).
  2. إعداد الحيوان للجراحة.
  3. تأكد من استخدام التقنيات المعقمة والمعقمة المناسبة كما هو مطلوب من قبل مؤسستك.
    1. وزن الحيوان. يجب أن يكون الحيوان على الأقل 25 غرام لعملية جراحية ناجحة.
    2. ضع الحيوان داخل غرفة زجاج شبكي مغلق وربط الغرفة بجهاز التخدير isoflurane. تعيين معدل التدفق إلى 2.5 لتر / دقيقة للذكور و 3.0 لتر / دقيقة للإناث من 1.5٪ isoflurane في O2. بعد ما يقرب من 2 دقيقة، تأكد من أن الماوس مخدر بشكل مناسب بسبب عدم وجود رد فعل الانسحاب مع قرصة اصبع القدم.
    3. مرة واحدة مخدر، وإزالة الماوس من الغرفة ووضعها في موقف عرضة مع وجهه داخل مخروط الأنف التخدير. إعداد مخروط الأنف لتلقي الغاز من المرذاذ وإعادة الغاز إلى الزبال الغاز. الزبال سوف يلتقط isoflurane في مرشح الفحم.
    4. استخدام كليبرز لالحلاقة الفراء بين شفرات الكتف. تأكد من تعقيم المنطقة الحليقة بشكل صحيح، بالتناوب ثلاث مرات بين البيتادين والدعك الإيثانول.
    5. الوجه الماوس أكثر في موقف supine الحفاظ على الوجه في مخروط الأنف. الشريط أسفل الساق اليسرى على مرحلة الجراحة واستخدام كليبرز لالحلاقة الفراء من الفخذ الداخلي الأيسر إلى أسفل البطن الأيسر. تأكد من تعقيم المنطقة الحليقة بشكل صحيح، بالتناوب ثلاث مرات بين البيتادين والدعك الإيثانول.
    6. حرك تدفئة يدوية متوفرة تجارياً، ملفوفة بالشاش، تحت الفأرة. الصق يأسفل الساق اليمنى على مرحلة الجراحة
  4. أدخل القسطرة في الوريد الفخذي الأيسر.
    1. مع مساعدة من المجهر الجراحي، واستخدام مقص الجراحية لجعل شق 1 سم من الجزء الأوسط العلوي من rostrally الفخذ الأيسر نحو خط الوسط، وكشف عن الشريان الفخذي والوريد.
    2. سحب الجلد فضفاضة مع السنانير الجلد الجراحية لمزيد من فضح الحويصلات.
    3. تطبيق معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى المنطقة المعرضة للحفاظ على الرطوبة الكافية.
    4. استخدام ملقط لتشريح حادة، وفصل النسيج الضام حول قسم صغير من الشريان الفخذي والوريد. بعناية، فصل الشريان والوريد(الشكل 2).
    5. استخدام ملقط لخيط حبلا واحدا من خياطة قابلة للامتصاص (ستراند A) تحت كل من الوريد الفخذي والشريان في النقطة الجانبية الأكثر من الشق. سحب خياطة في منتصف الطريق من خلال ذلك ينتهي حتى.
    6. عند نقطة أكثر شبهًا إلى الفخذ، استخدم الملقط لخيط خياطة ثانية (Strand B) تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة نصف التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم.
    7. عند نقطة بين ستراند A وستراند B، استخدم الملقط لخيط خياطة ثالثة (ستراند C) تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة كاملة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم. يجب الحرص على عدم تمزيق الوريد.
    8. الساحبة بلطف على ستراند B لتقييد تدفق الدم. استخدم hemostat لسحب Strand B برفق للحفاظ على تدفق الدم المقيد.
    9. قطع حفرة صغيرة في المنطقة المحظورة من الوريد الفخذمع مقص صغير وإدراج بعناية نهاية الزاوية من الأنابيب PE-8 (مسح سابقا مع الهيبارين المالحة) نحو ستراند B. بمجرد إدخالها، حرر التوتر في Strand B وإرشاد القسطرة إلى أعلى الوريد. تشديد ستراند B حول الوريد الذي يحتوي على القسطرة.
    10. باستخدام Strand C، اربط عقدة إضافية حول القسطرة. تأكد من أن هذه العقدة لا تلتقط الشريان الفخذي.
    11. سحب بلطف على برميل حقنة لملء جزئيا الأنابيب مع الدم لضمان أن القسطرة قد تم زرعها بشكل صحيح.
  5. بعد نفس الإجراء، أدخل قسطرة PE-10 في الشريان الفخذي الأيسر.
  6. إجراء جراحي كامل.
    1. بمجرد تأمين كل من وين الفخذ وقسطرة الشريان، ربط ستراند A في عقدة حول كل من القسطرة.
    2. قطع جميع الغرز الزائدة وإزالة السنانير الجلد. اغسل القسطرة الشريانية بمحلول ملحي مُقَدَّم لمنع التخثر. قم بكوي نهايات كل من القسطرة لإنشاء ختم.
    3. ضع الماوس في وضع عرضة وإجراء شق صغير في قاعدة الرقبة وتطبيق المالحة على المنطقة المكشوفة.
    4. أدخل قضيب معدني مجوف من شق الرقبة إلى شق الفخذ. ثعبان القسطرة من خلال قضيب جوفاء والخروج من شق الرقبة. إزالة قضيب جوفاء. سيؤدي زرع القسطرة تحت الجلد إلى منع الفئران من إتلاف القسطرة.
    5. تطبيق bupivacaine على جانبي الجرح. أغلق الشق الفخذي بخياطة. إضافة مرهم ليدوكائين على الجرح المغلق، خياطة.
    6. ثعبان القسطرة من خلال أنبوب جوفاء مرنة 30 سم (حبل الربيع) وخياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد. تطبيق bupivacaine على جانبي الجرح. خياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد. إضافة مرهم ليدوكائين على الجرح المغلق، خياطة.
    7. حرك الماوس إلى حاوية أسطوانية واضحة (ارتفاع 20 سم وقطرها 13 سم) مع جبل دوار وذراع لإيواء الحيوان خلال فترة التعافي. وضع يد أكثر دفئا تحت الحاوية للحفاظ على الحيوان دافئا.
    8. المسمار الجزء العلوي من الحبل الربيع إلى دوار وتأمين دوار إلى ذراع دوارتعلق على حاوية أسطواني. تأكد من أن الماوس لديه مجموعة كاملة من الحركة ويمكن الوصول إلى القسطرة.
    9. ضع غطاء مشقوق لا يتداخل مع آلية الدوران فوق الضميمة الحيوانية. راجع الشكل 3 للإعداد الكامل.
    10. السماح للماوس لاسترداد. ينصح على الأقل 22 ساعة.

2. إعداد L-[1-14C] محلول ليوسين للحقن و 16٪ (ث / ف) 5-سلفوساليسيليك حمض (SSA) حل ثنائي الهيدرات لعينات البلازما إزالة البروتين. في حل SSA، وتشمل أيضا 0.04 m norleucine و 1 μCi/mL [H3] ليوسين كمعايير داخلية لتحليل الأحماض الأمينية وتحليل تركيز التتبع في كسور البلازما القابلة للذوبان في الأحماض، على التوالي. تخزين SSA تصل إلى شهرين في 4 درجة مئوية.

  1. شراء L-1-14C]c] leucine (50-60 mCi/mmol)، الذي يباع كحل في 2٪ الإيثانول أو 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. حتى تركيز 100 درجة مئوية /مل.

3. إدارة L-[1-14C] ليوسين عن طريق الوريد وجمع عينات الدم الشرياني.

  1. جمع المواد اللازمة: 18 1.5 مل microtubes لعينات البلازما deproteinizing (إضافة 70 مل من المياه منزوعة الأيونات إلى كل أنبوب)، 17 250مل إدراج قارورة زجاجية (15 إدراج لجمع عينات الدم الشرياني و2 إدراج لجمع الدم الفضاء الميت ليكون إعادة حقنها. للحد من جمع الدم الإضافي وغير الضروري، والصغيرة، ورقيقة إدراج قارورة الزجاج مع قيعان مدبب التي تسمح لأنابيب يمكن الوصول إليها من البلازما الفائقة ينصح)، 2 أنابيب microcapillary (32 × 0.8mm، لقياس الهيماتوكريت)، 1 الهيبارين و أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلفة بفلوريد الليثيوم (لمنع التخثر والتحلل، على التوالي)، وhemostats (تغطية النصائح مع أنابيب tygon بحيث المشابك لن تضر أنابيب PE)، ومراقبة الجلوكوز في الدم، محول ضغط الدم، 1 مل المحاقن المعقمة (ل الهبات المالحة)، ومحلول القتل الرحيم المتاح تجارياً (المخفف 1:1 في الماء منزوع الأيونات (للفئران)).
  2. تأكد من أن الحيوان في حالة فسيولوجية طبيعية في بداية التجربة.
    1. المشبك الأنابيب الشريانية حوالي 2 سم من النهاية وقطع غيض، وخلق فتحة للدم لتدفق. ثم فك المشبك الأنابيب وجمع الدم الفضاء الميت ((c. 30 مل) لجمع أي المالحة المتبقية و / أو الدم من السحوبات السابقة)، وفي أنبوب منفصل، وجمع عينة التحكم (حوالي 30 درجة مئوية)، عينات الهيماتوكريت (حوالي نصف حجم الأنبوب الشعري)، والجلوكوز عينة (حوالي 20 درجة مئوية).
    2. قياس الهيماتوكريت عن طريق توصيل نهاية واحدة مع المعجون مانع التسرب والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 4500 × ز. قياس نسبة حجم الخلايا الحمراء إلى حجم الدم الكلي. إذا كان الحيوان لديه الهيماتوكريت أقل من 30٪، لا تستمر في الدراسة.
    3. استخدم جهاز مراقبة جلوكوز الدم المتوفر تجاريًا لقياس مستوى الجلوكوز في قطرة من الدم.
    4. عينة التحكم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 18،000 × ز لفصل البلازما. إزالة البروتين عينات البلازما على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من البلازما إلى 70 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في ميكروتوب 1.5 مل، إضافة 25 ميكرول من محلول SSA 16٪ ودوامة. توضع على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل أن تتجمد على الجليد الجاف.
    5. إعادة الدم الفضائي الميت إلى الحيوان من خلال خط وريدي، تليها تدفق ملحي مملح مُسَنَعَد لمنع فقدان الدم الزائد.
    6. ربط الخط الشرياني إلى محول ضغط الدم لقياس متوسط ضغط الدم الشرياني.
    7. بعد أخذ العينات تأكد من إعادة المشبك الخط الشرياني ودافق الخط مع حجم صغير (50 مل) من المالحة الهيبارين.
  3. إعطاء التتبع عن طريق الوريد وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب.
    1. استخدم موصل Y لإرفاق حقنة واحدة مع التتبع (100μCi/kg) وحقنة واحدة مع محلول ملحي معقم 50 مل لطرد الخط الوريدي بعد حقن التتبع. قم بتوصيل موصل Y بالخط الوريدي.
    2. بدء الدراسة من خلال البدء في وقت واحد ساعة توقف وحقن التتبع. مسح الخط الوريدي مع المالحة (c. 100mL) مباشرة بعد الحقن.
    3. جمع عينات الدم 1-7 باستمرار طوال أول 2 دقيقة من التجربة بنفس الطريقة. بعد جمع العينة السابعة، جمع 30 ميكرولتر الدم الميت الفضاء قبل كل عينة المتبقية. يتم جمع العينات 8-14 في 3 و 5 و 10 و 15 و 30 و 45 و 60 دقيقة على التوالي.
    4. معالجة عينات الدم مباشرة بعد جمعها، كما هو موضح لعينة التحكم. إذا كان هناك تأخير، ضع العينات على الجليد. إعادة حقن الدم الفضائي الميت بعناية في الشريان عن طريق القسطرة الشريانية وتدفق مع ملح الهيبارين.
    5. في مرحلة ما أثناء التجربة، معالجة ثلاثة معايير داخلية عن طريق إضافة 25 μL 16٪ SSA، 0.04 mM norleucine، و 1 mCi/mL [3H] ليوسين إلى 75 ميكرولتر الماء، دوامة ومكان على الجليد.
    6. بعد جمع العينة الرابعة عشرة في 60 دقيقة، حقن ما يقرب من 0.2 مل من B-القتل الرحيم-D في خط وريدي لقتل الحيوان. سجل وقت الوفاة
    7. فك الحيوان من جبل دوار وإزالة من الضميمة الحيوانية. إزالة الدماغ بعناية، ووضع على رقائق الألومنيوم، وتجميد على الجليد الجاف. لا تجمد العقول مع النيتروجين السائل كما قد تصدع العقول. تخزين الدماغ والعينات والمعايير الداخلية في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للمعالجة. يمكن إجراء المعالجة في أي وقت بعد ذلك.

4. تحليل تركيزات ليوسين و L-[1-14C]ليوسين في عينات البلازما.

  1. ذوبان العينات والمعايير الداخلية على الجليد، دوامة، والطرد المركزي 18،000 × ز لمدة 5 دقائق في 2 درجة مئوية. سوف تحتوي على كسر supernatant الحر المسمى وغير المسمى ليوسين.
  2. نقل 40 ميكرولتر من supernatant إلى قارورة التلألؤ السائل وإضافة كوكتيل التلألؤ. قياس التفكك في الدقيقة (DPM) من 3H و 14C عن طريق العد التلألؤ السائل ومنحنى التبريد مصممة لفي وقت واحد مزدوج التسمية (3 H و 14C) العد.
  3. لتحديد تركيزات اللوسين البلازما، استخدم نظام HPLC مع عمود تبادل الكاتيون الصوديوم واشتقاق ما بعد العمود مع الكشف عن العيون الفثالديهايد والفلورومتري.
    1. تعيين HPLC إلى المواصفات التالية: الإثارة الفلورمتر من 330 نانومتر وانبعاث 465 نانومتر. المرحلة المتنقلة تتكون من إلورات الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 7.40، وإلورات الصوديوم + 5٪ سلفولاني، الرقم الهيدروجيني 3.15. تعيين معدل تدفق المخزن المؤقت من 0.400 مل / دقيقة ومعدل تدفق أداة الاشتقاق إلى 0.300 مل / دقيقة.
    2. معايرة النظام مع مجموعة من تركيزات الأحماض الأمينية (بما في ذلك نورليوسين) بين 30 و 500 بمول / 10مل. منحنى المعايرة خطي. تركيزات الأحماض الأمينية من عينات حقن 10 مل اختبار تقع ضمن نطاقات منحنى المعايرة هذا.

5. إجراء التصوير الشعاعي التلقائي الكمي.

  1. إعداد أقسام الدماغ 20 ميكرومتر في سمك للتصوير الشعاعي التلقائي. قسم الدماغ عن طريق cryostat في -20 درجة مئوية.
  2. إذابة جبل أقسام الدماغ التسلسلي على الشرائح المغلفة الجيلاتين. الهواء جاف.
  3. اغسل الشرائح في خمسة تغييرات من 10٪ فورمالين لمدة 30 دقيقة لكل تغيير، تليها تدفق مستمر من المياه منزوعة الأيونات لمدة 1 ساعة.
  4. ترتيب الشرائح في كاسيت فيلم الأشعة السينية (الكاسيت اتّصال تتناسب مع أفلام تصوير الثدي بالأشعة السينية 20X25 سم) جنبا إلى جنب مع مجموعة من [14C] methylmethacrylate المعايير، والتي تم معايرة سابقا ضد الأنسجة من تركيزات 14C المعروفة كما وصف29. المعايير يمكن شراؤها تجاريا ولكن ضمان أنها تغطي مجموعة من 2-300 mCi / غرام من الأنسجة ويتم معايرة ضد 20 درجة مئوية سمك الأنسجة. تحت ضوء الأمان الأحمر، ضع قطعة من فيلم التصوير الشعاعي للثدي، مستحلب الجانب إلى أسفل، على رأس الأقسام.
  5. ختم الكاسيت ووضعها في كيس تغيير أسود وتخزينها في خزانة لمدة 40-45 يوما.
  6. تطوير الأفلام وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. ملاحظة: لا ينصح بتطوير الفيلم الآلي لأن الخلفية قد تكون غير متساوية ويمكن أن تؤثر على القياس الكمي.

6. تحليل الصور.

ملاحظة: يوصى ببرنامج متاح تجاريا لتحليل الصور إلى جانب كاميرا CCD ومربع ضوء الفلورسنت مع إضاءة حتى. يتم الكشف عن الكثافات البصرية النسبية في الفيلم مضيئة من قبل كاميرا CCD.

  1. إنشاء منحنى معايرة الكثافة البصرية (OD) ضد تركيز الأنسجة 14C استناداً إلى ODs من مجموعة من المعايير المعايرة على الفيلم. احتواء هذه البيانات (بما في ذلك الفراغ أو الخلفية) مع معادلة متعددة الحدود. إما معادلة متعددة الحدود من الدرجة الثانية أو الثالثة تناسب بشكل جيد جداً.
  2. لتحليل مناطق الدماغ المحددة، حدد موقع المنطقة ذات الأهمية (ROI) في ستة إلى ثمانية أقسام بالمقارنة مع أطلس الدماغ. تسجيل ODs من بكسل داخل عائد الاستثمار في جميع المقاطع، واستنادا إلى منحنى المعايرة، وحساب تركيز الأنسجة 14C في كل بكسل. حساب متوسط تركيز الأنسجة 14C في عائد الاستثمار.

7. حساب rCPS. حساب rCPS في كل عائد استثمار عن طريق المعادلة التالية:

Equation

حيث P * (T) هو تركيز الأنسجة المتوسط المرجح من 14C في عائد الاستثمار،C p(t) و C*p(t) هي تركيزات البلازما الشريانية للليوسين غير المسمى والمسمى في الوقت، t، T هو الوقت الذي مات الحيوان ( حوالي 60 دقيقة)، وهو جزء من ليوسين في تجمع السلائف الأنسجة التي تأتي من البلازما. يتم تقييم في تجربة منفصلة 6. وقد تم تقييم في WT, Fmr1 بالضربة القاضية, Tsc+/-, وPKU الفئران 6,22,25,28. إذا كانت التجربة تنطوي إما على تغييرات وراثية أو دوائية قد تؤثر على معدلات تخليق البروتين أو التحلل أو التمثيل الغذائي للليوسين، فينبغي تقييم الليوسين في ظل الظروف الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا نعرض تجربة تمثيلية تبين آثار الإدارة المسبقة لمثبط تخليق البروتين على rCPS. وقد أُعطي الأنيسومايسين في محلول ملحي عادي لفأر من النوع البري C57/BL6 للذكور البالغين تحت الجلد (100 ملغم/كغم) 30 دقيقة قبل بدء تحديد الـ rCPS. آثار العلاج الأنيومايسين مقارنة مع الحيوانات التحكم المعالجة بالمركبات تظهر أن rCPS غير قابل للكشفتقريبا في الماوس معالجة الأنسوميسين (الشكل 4). يمثّل هذا معطيات تصديق أنّ ال في [فيفو] [أوتورديوغرفيك] [ل]-[1-14[ك]-[ليوسين] طريقة يقيس معدلات من بروتين تخليق في دماغ.

نقدم رقماً لـ L-[1-14C]-leucine autoradiograms على أربعة مستويات منالدماغ لإثبات دقة الأسلوب (الشكل 5). موضحة هي طبقات الخلايا في لمبة الشم (الشكل5A و B)، والحصين (الشكل5C)،والمخيخ (الشكل5G). النوى في تحت المهاد (الشكل5D)،والبون (الشكل5E و F)،وجذع الدماغ (الشكل5H)وينظر أيضا بوضوح في التصوير التلقائي. كما نبين المعدلات الإقليمية الكمية لتخليق البروتين في القشرة الأمامية (5.88 نمول/غرام/دقيقة) (الشكل6A)والحصين الظهري (5.35 نمول/ز/دقيقة) (الشكل6B)لحيواني التحكم النموذجي.

Figure 1
الشكل 1: مخطط يمثل خطوات بروتوكول rCPS بأكمله. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة الشريان الفخذي المكشوف والوريد الفخذي. وضع موازية مع بعضها البعض، ويظهر الشريان الفخذي فوق الوريد الفخذي. وريد الفخذ أيضا لون أحمر أعمق من الشريان الفخذي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صورة لإعداد الضميمة الحيوانية الموصى بها لتجربة rCPS. ويستخدم الضميمة الحيوانية أسطواني واضحة مع ملحق دوار متصل ة حبل الربيع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور تمثيلية من الحيوان المعالج بالمركبات (ألف) مقارنة بالحيوان المعالج بالإيزوميسين (100 ملغم/كغم، تحت الجلد) 30 دقيقة قبل إدارة التتبع (باء). معدلات تخليق البروتين تتناسب مع مستوى الظلام في الصورة. الأنيسومايسين يقلل بشكل كبير من معدلات قياس تخليق البروتين مما يدل على خصوصية هذه الطريقة. يمثل شريط المقياس الموجود في أعلى يمين A 1 مم وينطبق على كلتا الصورتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التصوير التلقائي الرقمي من فأر ة يتصرف مستيقظا على مستوى لمبة الشم (A، B)، تحت المهاد (C، D)، البون (E، F)، المخيخ (G)، وجذع الدماغ (G، H). المناطق الأكثر قتامة لديها rCPS أعلى. ينطبق شريط المقياس في اللوحة G على اللوحات A وC وE وG. Autoradiograms على اليمين (B و D و F و H) هي صور مكبرة من المناطق المعينة على الصور على اليسار وشريط المقياس في اللوحة H ينطبق على اللوحات B ، D، F، و H. اختصارات هي كما يلي: FrA، القشرة جمعية أمامية؛ OB، لمبة الشم؛ AO، نواة حاسة الشم الأمامية. GL، طبقة الكبيبي. EPl، طبقة plexiform الخارجية؛ BLA, amygdala الباسولترالية; py، طبقة الخلية الهرمية. dHi، الحصين الرغور. المدير العام، دينتات سايروس؛ MHb, الهابينولا الوسيطة; Rt، نواة الشبكية الثالياميك. VMH، نواة نقص تثالات الديمنية البطنية. قوس، نواة قوسية؛ EW, [إدنجر-وستفل] نواة; R، نواة حمراء. PN، نواة بونتين. ML، الطبقة الجزيئية؛ GL، طبقة الحبيبية؛ PC، طبقة الخلية Purkinje؛ Cu، نواة الكنات. AP, منطقة postrema; 10، نواة المحرك الدروسال من المتشرد. 12، نواة نقص اللمعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التصوير التلقائي الرقمي من فأر التحكم في التصرف اليقظ على مستوى القشرة الأمامية (A) والحصين الظهري (B). معدلات تخليق البروتين الدماغي هي اللون مشفرة في الصور وفقا لشريط اللون هو مبين على اليمين. يمثل شريط المقياس في أسفل يسار A 1 مم وينطبق على كلتا الصورتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نقدم طريقة كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) في الجسم الحي في الحيوانات التجريبية. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة على الأساليب القائمة: 1. يتم إجراء القياسات في الحيوان مستيقظا يتصرف، بحيث تعكس العمليات الجارية في الدماغ يعمل. 2 - وتُبذل القياسات عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي الكمي الذي يتيح القدرة على تحديد الـ rCPS في جميع المناطق والمناطق دون الإقليمية في الدماغ في آن واحد. 3. النموذج الحركي للطريقة يأخذ في الاعتبار إمكانية إعادة تدوير الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدةمن تدهور بروتين الأنسجة وتأثيرها على تجمع السلائف لتخليق البروتين 6.

الحد الأساسي لهذه الطريقة هو أنه يستغرق وقتا طويلا ويتطلب. وفي حين أنه من المغري استخدام أساليب أبسط وأعلى للزيادة الإنتاجية، يجب الاعتراف بمحدودية البيانات التي يتم الحصول عليها.

بسبب تعقيد قياس rCPS في ماوس سليمة، قد تواجه مشاكل مع الحفاظ على الحالة الفسيولوجية الطبيعية، وجمع عينات الدم الكافية، وتجنب الظروف التي يحتمل أن تتداخل. زرع الجراحية للقسطرة الوريدية والشريانية أمر صعب. كما هو الحال مع أي إجراء جراحي ، وخاصة مع التعامل مع الأوعية الدموية الحساسة ، هناك خطر متأصل لوفيات الحيوان. بالنسبة لنا، فمن النادر (حوالي 1٪). خلال فترة الانتعاش 22 ساعة التي تلت ذلك، في بعض الأحيان (حوالي 4٪) سوف الحيوان سحب القسطرة خارج. خلال القياس، من المهم أن تكون القسطرة براءة اختراع وأن الحيوانات في حالة فسيولوجية طبيعية. في تجربتنا الأخيرة، لا يمكن جمع الدم الشرياني في حوالي 2٪ من الحيوانات وحوالي 1٪ من الحيوانات كان الهيماتوكريت منخفضة (< 40٪) أو انخفاض ضغط الدم الشرياني (< 85 مم زئبق)، مما يشير إلى فقدان الدم أثناء الجراحة و/أو التعافي.

في إعداد أقسام الدماغ للتصوير الشعاعي التلقائي، من المهم التأكد من أن سمك القسم هو 20 ميكرومتر لأن هذا هو سمك القسم الذي[14C]methylmethacrylate المعايير قد تم معايرة. استخدام الرعاية لضمان أقسام ذات نوعية جيدة، أي من دون دموع، طيات، أو فقاعات لأن هذه العيوب سوف تتداخل مع التحليل autoradiographic. نقوم بتطوير الأفلام الأوتوراديوغرافية باليد وليس في معالج الأفلام الآلي لأننا نجد أن الكثافة البصرية الخلفية يمكن أن تكون متفاوتة بعد المعالجة الآلية، وهذا يمكن أن يؤثر على القياس الكمي.

في المعادلة لrCPS، ونحن تشمل عامل، لامدا (، وهذا هو جزء من ليوسين التي تأتي من البلازما الشريانية، والباقي يأتي من إعادة تدوير الأحماض الأمينية المستمدة من تدهور بروتين الأنسجة6. لقد قمنا بتقييم في تجارب منفصلة في WT و Fmr1 KO (نموذج X الهشة) C57Bl/6J الفئران وأظهرت أن قيمتها 0.603. قد تختلف قيمة الـ 10 حسب الأنواع أو الخلفية الوراثية أو وجود طفرة جينية. لذلك، إذا كان تصميم تجارب تخليق البروتين لنماذج أخرى، واحد سوف تحتاج إلى تقييم قبل أن يمكن الحصول على قياس دقيق.

عملنا في نماذج الماوس الوراثية من اضطرابات النمو العصبي يدل على أن هذه المنهجية تكشف عن تغييرات في rCPS في هذه النماذج وفي بعض الحالات الاستجابات للعلاجات الدوائية22،23،25 , 26.ومن المتصور أيضا أن قياس rCPS قد أيضا رصد التغيرات التنكسية في الدماغ في ظروف مثل نماذج من مرض الزهايمر, مرض باركنسون, الهشة X متلازمة الهزة ترنح, إصابات الدماغ الصادمة, إلخ. هذه النماذج، قد يكون من الممكن تتبع التغيرات التنكسية في وقت مبكر وربما أيضا الاستجابات للتدخلات المبكرة. طريقة rCPS يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية في أقسام موازية لمزيد من دراسة تغييرات الدماغ محددة25. وباختصار، فإن طريقة اللوسيني الأوتوراديوغرافية الكمية L-[1-14C]-leucine مثالية لتحديد دقيق لقيم rCPS في الجسم الحي. وهو يوفر مزايا كبيرة من حيث الدقة والتطبيق في ظروف الجسم الحي على الأساليب القائمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يعترفوا بـ Zengyan Xia لكتابة الفئران، وتوم بيرلين لمعالجة الأحماض الأمينية والأفلام، وMei Qin لأداء بعض التجارب rCPS. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من NIMH، ZIA MH00889. كما تم دعم RMS من قبل التوحد يتحدث زمالة ما بعد الدكتوراه 8679 وزمالة FRAXA ما بعد الدكتوراه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory 003024 Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin Tocris Bioscience 1290
Microhematocrit Tubes Drummond Scientific 1-000-3200-H capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant Leica Microsystems 39215003 sealant putty
Glass vial inserts Agilent 5183-2089 used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer Micro-Med Inc. BPA-400 blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System Bayer Breeze 9570A glucose meter
Gastight syringe Hamilton Co. 1710 tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers HeatMax Model HH2 warming pads
Heparin Lock Flush Solution Fresenius Kabi USA, LLC 504505 heparin saline
Clear animal container Instech MTANK/W animal enclosure
Spring tether Instech PS62 catheter tube/rodent attachment
Swivel Instech 375/25 hooks to spring tether
Swivel arm and mount Instech SMCLA hooks to swivel and animal enclosure
Tether button Instech VAB62BS/22 attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube Made in-house N/A used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000 Matrx 91305430 isoflurane vaporizer
Isoflurane Stoelting Co. 50207 isoflurane/halothane adsorber
Clippers Oster Finisher Model 59
Surgical skin hooks Made in-house (??) N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline APP Pharmaceuticals LLC 918610
Forceps Fine Science Tools 11274-20
Surgical scissors Fine Science Tools 14058-11
Microscissors Fine Science Tools 15000-00
UNIFY silk surgical sutures AD Surgical #S-S618R13 6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing SAI Infusion Technologies PE-8-25
Syringe Becton Dickinson and Co. 309659 1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing Clay Adams 427400
MCID Analysis Imaging Research Inc. Version 7.0 optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm) FD Neurotechnologies PO101
Cryostat Leica CM1850
Super RX-N medical x-ray film Fuji 47410-19291
Hypercassettes (8x10 in) Amersham Pharmacia Biotech 11649
[1-14C]leucine Moravek MC404E
Microcentrifuge tube Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. 72.692.005 used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette Wheaton 357335
Glass wool Sigma-Aldrich 18421
Nitrogen NIH Supply Center 6830009737285
Scintillation fluid CytoScint 882453
Liquid scintilllation counter Packard Tri-Carb 2250CA
Amino acid analyzer Pickering Laboratories Pinnacle PCX
HPLC unit Agilent Technologies 1260 Infinity include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope Wild Heerbrugg M650
Sulfosalicylic acid Sigma-Aldrich MKBS1634V 5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine Sigma N8513
1.0 N HCl Sigma-Aldrich H9892
[H3]leucine Moraevk MC672
Falcon tube Thermo Scientific 339652 50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch Heuer Microsplit Model 1000 1/100 min
Euthanasia Solution Vet One H6438
Northern Light Precision Illuminator Imaging Research Inc. Model B95 fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 Nikon 1442 CDD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
  2. Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
  3. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
  4. Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
  5. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
  6. Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
  7. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
  8. Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
  9. Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
  10. Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
  11. Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
  12. Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
  13. Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
  14. Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
  15. Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
  16. Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
  17. Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
  18. Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
  19. Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
  20. Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
  21. Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
  22. Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
  23. Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
  24. Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
  25. Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
  26. Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
  27. Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
  28. Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
  29. Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).More

Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter