A síntese proteica é um processo biológico crítico para as células. No cérebro, é necessário para mudanças adaptativas. A mensuração das taxas de síntese proteica no cérebro intacto requer considerações metodológicas cuidadosas. Aqui nós apresentamos o L-[1-14C]-método Bakersfield quantitativo da leucina para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral in vivo.
A síntese protéica é necessária para o desenvolvimento e manutenção da função neuronal e está envolvida em mudanças adaptativas no sistema nervoso. Além disso, pensa-se que o desregulação da síntese da proteína no sistema nervoso pode ser um phenotype do núcleo em algumas desordens desenvolventes. A medida exata das taxas da síntese da proteína cerebral em modelos animais é importante para compreender estas desordens. O método que desenvolvemos foi projetado para ser aplicado ao estudo de animais acordados e comportados. É um método autoradiográfico quantitativo, de modo que pode render taxas em todas as regiões do cérebro simultaneamente. O método é baseado no uso de um aminoácido traçador, L-[1-14C]-leucina, e um modelo cinético do comportamento da L-leucina no cérebro. Nós escolhemos L-[1-14C]-leucina como o Tracer porque não conduz aos produtos metabólicos etiquetados estranhos. É incorporado na proteína ou metabolizado ràpida para render 14co2 que é diluído em uma grande associação de co2 sem rótulo no cérebro. O método e o modelo também permitem a contribuição da leucina sem rótulo derivada da proteólise tecidual para a associação precursora do tecido para síntese proteica. O método tem a resolução espacial para determinar as taxas de síntese protéica em camadas de células e neurópilo, bem como núcleos hipotalâmicos e do nervo craniano. Para obter dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis, é importante aderir aos detalhes processuais. Aqui apresentamos os procedimentos detalhados do método quantitativo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina para a determinação das taxas regionais de síntese protéica in vivo.
A síntese proteica é um importante processo biológico necessário para a mudança adaptativa de longo prazo no sistema nervoso1. A inibição da síntese proteica bloqueia o armazenamento de memória de longo prazo em invertebrados e vertebrados2. A síntese proteica é essencial para a manutenção das fases tardias de algumas formas de potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (Ltd)3, sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento4, e para a manutenção geral do neurônio e sua conexões sinápticas5. A mensuração das taxas de síntese de proteínas cerebrais pode ser uma ferramenta importante para o estudo de alterações adaptativas, bem como distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios relacionados à aprendizagem e à memória.
Desenvolvemos um método para quantificar as taxas de síntese protéica cerebral in vivo em um animal acordado que oferece vantagens inerentes a outras técnicas que estimam taxas em preparações ex vivo ou in vitro de tecido cerebral6. Acima de tudo é a aplicabilidade para medições no cérebro intacto em um animal acordado. Esta é uma consideração chave porque permite medições com estrutura sináptica e função no lugar e sem preocupações sobre efeitos post mortem. Além disso, a abordagem autoradiográfica quantitativa que empregamos atinge um alto grau de localização espacial. Considerando que a energia de 14C é tal que não podemos localizar o traçador no nível subcelular ou celular, podemos medir as taxas em camadas celulares e pequenas regiões cerebrais, como núcleos hipotalâmicos, com aproximadamente uma resolução de 25 μm7.
Um desafio de medições in vivo com radiofármacos é garantir que o radiomarcar medido está no produto da reação de interesse, em vez de precursor rotulado não reagido ou outros produtos metabólicos rotulados estranhos6. Nós escolhemos L-[1-14C]-leucina como o aminoácido Tracer porque é incorporado na proteína ou metabolizado ràpida a 14co2, que é diluído na grande associação de co2 sem rótulo no cérebro resultando da taxa elevada de metabolismo energético8. Além disso, qualquer 14c não incorporado em proteínas existe principalmente como livre [14c]-leucina, que durante o período experimental de 60 min, é quase totalmente eliminada do tecido6. As proteínas são então fixadas ao tecido com formalina e posteriormente enxaguadas com darágua remover qualquer livre [14C]-leucina antes da autoradiografia.
Outra consideração importante é a questão da diluição da atividade específica da Associação de aminoácidos precursores por aminoácidos não rotulados derivados da proteólise tecidual. Nós mostramos que no rato e no rato adultos, aproximadamente 40% do pool da leucina do precursor para a síntese da proteína no cérebro vem dos ácidos aminados derivados da avaria6da proteína. Isso deve ser incluído no cálculo das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais (rCPS) e deve ser confirmado em estudos em que essa relação pode mudar. A base teórica e os pressupostos do método foram apresentados em detalhes em outros lugares6. Neste artigo, focamos as questões processuais da aplicação desta metodologia.
Este método tem sido empregado para a determinação de RCPS em esquilos terrestres9, ovinos10, macacos rhesus11, ratos12,13,14,15,16 , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21, um modelo do rato do complexo de esclerose tuberosa22, um modelo do rato da síndrome frágil de x23,24,25,26, ratos frágeis da pré-mutação de x27, e um modelo do rato do fenilcetonúria28. Neste manuscrito, apresentamos os procedimentos de mensuração de rCPS com o método in vivo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina. Nós apresentamos rCPS em regiões do cérebro de um rato acordado do controle. Nós igualmente demonstramos que in vivo a administração do anisomycin, um inibidor da tradução, abole a síntese da proteína no cérebro.
Nós apresentamos um método quantitativo para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral (rCPS) in vivo em animais experimentais. Este método tem vantagens consideráveis sobre os métodos existentes: 1. as medidas são feitas no animal de comportamento acordado, assim que refletem processos contínuos no cérebro de funcionamento. 2. as medições são feitas por meio de autoradiografia quantitativa, proporcionando a capacidade de determinar os rCPS em todas as regiões e sub-regiões do cé…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer Zengyan Xia para a genotipagem dos camundongos, Tom Burlin para o processamento de aminoácidos e filmes, e Mei Qin para realizar alguns dos experimentos de rCPS. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa intramural da NIMH, ZIA MH00889. RMS também foi apoiado por um autismo fala pós-doutorado Fellowship 8679 e uma FRAXA pós-doutorado Fellowship.
Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
[1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
Norleucine | Sigma | N8513 | |
1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
[H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |