Summary

Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Published: June 28, 2019
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Summary

La synthèse des protéines est un processus biologique essentiel pour les cellules. Dans le cerveau, il est nécessaire pour les changements adaptatifs. La mesure des taux de synthèse des protéines dans le cerveau intact nécessite des considérations méthodologiques soignelées. Ici nous présentons la méthode autoradiographique quantitative de L-[1-14C]-leucine pour déterminer des taux régionaux de synthèse cérébrale de protéine in vivo.

Abstract

La synthèse des protéines est nécessaire pour le développement et le maintien de la fonction neuronale et est impliquée dans les changements adaptatifs dans le système nerveux. En outre, on pense que la dysrégulation de la synthèse des protéines dans le système nerveux peut être un phénotype de base dans certains troubles du développement. La mesure précise des taux de synthèse des protéines cérébrales dans les modèles animaux est importante pour comprendre ces troubles. La méthode que nous avons développée a été conçue pour être appliquée à l’étude des animaux éveillés et se comportant. Il s’agit d’une méthode autoradiographique quantitative, de sorte qu’il peut produire des taux dans toutes les régions du cerveau simultanément. La méthode est basée sur l’utilisation d’un acide aminé traceur, L-[1-14C]-leucine, et un modèle cinétique du comportement de L-leucine dans le cerveau. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme traceur parce qu’elle ne conduit pas à des produits métaboliques étiquetés par des produits non-terrestres. Il est soit incorporé dans les protéines ou rapidement métabolisé pour produire 14CO2 qui est dilué dans un grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau. La méthode et le modèle permettent également la contribution de la leucine non étiquetée dérivée de la protéolyse tissulaire au pool de précurseurs tissulaires pour la synthèse des protéines. La méthode a la résolution spatiale pour déterminer les taux de synthèse des protéines dans les couches cellulaires et neuropil, ainsi que les noyaux hypothalamiques et crâniens nerf. Pour obtenir des données quantitatives fiables et reproductibles, il est important d’adhérer aux détails de la procédure. Ici, nous présentons les procédures détaillées de la méthode quantitative autoradiographique L-[1-14C]-leucine pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines in vivo.

Introduction

La synthèse des protéines est un processus biologique important requis pour un changement adaptatif à long terme dans le système nerveux1. L’inhibition de la synthèse des protéines bloque le stockage de la mémoire à long terme chez les invertébrés et les vertébrés2. La synthèse des protéines est essentielle pour le maintien des phases tardives de certaines formes de potentialisation à long terme (LTP) et de dépression à long terme (LTD)3, survie neuronale pendant le développement4, et pour le maintien général du neurone et de ses connexions synaptiques5. La mesure des taux de synthèse des protéines cérébrales peut être un outil important pour étudier les changements adaptatifs ainsi que les troubles neurodéveloppementaux et les troubles liés à l’apprentissage et à la mémoire.

Nous avons développé une méthode pour quantifier les taux de synthèse des protéines cérébrales in vivo chez un animal éveillé qui offre des avantages inhérents à d’autres techniques qui estiment les taux de préparations ex vivo ou in vitro des tissus cérébraux6. Le premier est l’applicabilité aux mesures dans le cerveau intact dans un animal éveillé. Il s’agit d’une considération clé, car il permet des mesures avec la structure synaptique et la fonction en place et sans préoccupations au sujet des effets post mortem. En outre, l’approche autoradiographique quantitative que nous employons atteint un degré élevé de localisation spatiale. Alors que l’énergie de 14C est telle que nous ne pouvons pas localiser le traceur au niveau subcellulaire ou cellulaire, nous pouvons mesurer les taux dans les couches cellulaires et les petites régions du cerveau telles que les noyaux hypothalamiques, avec environ une résolution de 25 m7.

Un défi des mesures in vivo avec des radiotracers est de s’assurer que l’étiquette radio mesurée est dans le produit de la réaction d’intérêt plutôt que le précurseur étiqueté non réagi ou d’autres produits métaboliques étiquetés non associés6. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme acide aminé traceur parce qu’il est soit incorporé dans la protéine ou rapidement métabolisé à 14CO2, qui est dilué dans le grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau résultant du taux élevé de métabolisme énergétique8. En outre, tout 14C non incorporé dans la protéine existe principalement comme libre [14C]-leucine, qui au cours de la période expérimentale de 60 min, est presque entièrement effacé du tissu6. Les protéines sont ensuite fixées aux tissus avec formaline et ensuite rincées avec de l’eau pour enlever toute leucine libre[14C]-leucine avant l’autoradiographie.

Une autre considération importante est la question de la dilution de l’activité spécifique du pool d’acides aminés précurseurs par des acides aminés non étiquetés dérivés de la protéolyse tissulaire. Nous avons montré que chez le rat et la souris adultes, environ 40% du bassin précurseur de leucine pour la synthèse des protéines dans le cerveau provient d’acides aminés dérivés de la dégradation des protéines6. Ceci doit être inclus dans le calcul des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (RCPS) et doit être confirmé dans les études dans lesquelles cette relation peut changer. La base théorique et les hypothèses de la méthode ont été présentées en détail ailleurs6. Dans le présent document, nous nous concentrons sur les questions de procédure de l’application de cette méthodologie.

Cette méthode a été utilisée pour la détermination de rCPS chez les écureuils terrestres9, moutons10, singes rhésus11, rats12,13,14,15,16 , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21, un modèle de souris de tubercule la sclérose complexe22, un modèle de souris du syndrome X fragile23,24,25,26, fragileX souris prémutation27, et un modèle de souris de phénylketonuria28. Dans ce manuscrit, nous présentons les procédures de mesure de rCPS avec la méthode autoradiographique in vivo L-[1-14C]-leucine. Nous présentons rCPS dans les régions de cerveau d’une souris de contrôle éveillée. Nous démontrons également que l’administration in vivo de l’anisomycine, un inhibiteur de la traduction, abolit la synthèse des protéines dans le cerveau.

Protocol

Remarque : Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité national des soins et de l’utilisation des animaux en santé mentale et ont été exécutées conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health sur les soins et l’utilisation des animaux. Un aperçu du protocole est présenté à la figure 1. 1. Implanter chirurgicalement des cathéters dans une veine fémorale et une artère …

Representative Results

Ici nous montrons une expérience représentative démontrant les effets de l’administration antérieure d’un inhibiteur de synthèse de protéine sur rCPS. L’anisomycine dans la saline normale a été administrée à une souris sauvage de type sauvage de C57/BL6 adulte sous-cutanée (100 mg/kg) 30 min avant l’initiation de la détermination de rCPS. Les effets du traitement de l’anisomycine par rapport à un animal témoin traité par véhicule montrent que le RCPS est presque indétecta…

Discussion

Nous présentons une méthode quantitative pour déterminer les taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (rCPS) in vivo chez les animaux expérimentaux. Cette méthode présente des avantages considérables par rapport aux méthodes existantes : 1. Les mesures sont effectuées chez l’animal qui se comporte éveillé, de sorte qu’elles reflètent les processus continus dans le cerveau qui fonctionne. 2. Les mesures sont faites au moyen de l’autoradiographie quantitative offrant la capacité de déterminer …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Zengyan Xia pour le génotypage des souris, Tom Burlin pour le traitement des acides aminés et des films, et Mei Qin pour avoir effectué certaines des expériences rCPS. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NIMH, ZIA MH00889. RMS a également reçu un programme de bourses postdoctorales Autism Speaks 8679 et une bourse postdoctorale FRAXA.

Materials

Mice The Jackson Laboratory 003024 Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin Tocris Bioscience 1290
Microhematocrit Tubes Drummond Scientific 1-000-3200-H capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant Leica Microsystems 39215003 sealant putty
Glass vial inserts Agilent 5183-2089 used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer Micro-Med Inc. BPA-400 blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System Bayer Breeze 9570A glucose meter
Gastight syringe Hamilton Co. 1710 tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers HeatMax Model HH2 warming pads
Heparin Lock Flush Solution Fresenius Kabi USA, LLC 504505 heparin saline
Clear animal container Instech MTANK/W animal enclosure
Spring tether Instech PS62 catheter tube/rodent attachment
Swivel Instech 375/25 hooks to spring tether
Swivel arm and mount Instech SMCLA hooks to swivel and animal enclosure
Tether button Instech VAB62BS/22 attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube Made in-house N/A used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000 Matrx 91305430 isoflurane vaporizer
Isoflurane Stoelting Co. 50207 isoflurane/halothane adsorber
Clippers Oster Finisher Model 59
Surgical skin hooks Made in-house (??) N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline APP Pharmaceuticals LLC 918610
Forceps Fine Science Tools 11274-20
Surgical scissors Fine Science Tools 14058-11
Microscissors Fine Science Tools 15000-00
UNIFY silk surgical sutures AD Surgical #S-S618R13 6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing SAI Infusion Technologies PE-8-25
Syringe Becton Dickinson and Co. 309659 1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing Clay Adams 427400
MCID Analysis Imaging Research Inc. Version 7.0 optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm) FD Neurotechnologies PO101
Cryostat Leica CM1850
Super RX-N medical x-ray film Fuji 47410-19291
Hypercassettes (8×10 in) Amersham Pharmacia Biotech 11649
[1-14C]leucine Moravek MC404E
Microcentrifuge tube Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. 72.692.005 used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette Wheaton 357335
Glass wool Sigma-Aldrich 18421
Nitrogen NIH Supply Center 6830009737285
Scintillation fluid CytoScint 882453
Liquid scintilllation counter Packard Tri-Carb 2250CA
Amino acid analyzer Pickering Laboratories Pinnacle PCX
HPLC unit Agilent Technologies 1260 Infinity include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope Wild Heerbrugg M650
Sulfosalicylic acid Sigma-Aldrich MKBS1634V 5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine Sigma N8513
1.0 N HCl Sigma-Aldrich H9892
[H3]leucine Moraevk MC672
Falcon tube Thermo Scientific 339652 50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch Heuer Microsplit Model 1000 1/100 min
Euthanasia Solution Vet One H6438
Northern Light Precision Illuminator Imaging Research Inc. Model B95 fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 Nikon 1442 CDD camera

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Cite This Article
Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).

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