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Immunology and Infection

इन विट्रो में प्रवाह के अंतर्गत Monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती का एक साथ अध्ययन

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

यहाँ, हम एक एकीकृत प्रोटोकॉल है कि विशिष्ट सतह मार्करों और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग द्वारा इन विट्रो में प्रवाह के तहत monocyte उपजनसंख्या की तस्करी के उपाय प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए अनुक्रमिक भर्ती कदम का पता लगाने के साथ ही अंय विशिष्ट सतह मार्करों का उपयोग कर अंय ल्युकोसैट उपप्रकार प्रोफ़ाइल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

रक्त से लक्षित परिधीय ऊतकों में monocytes की भर्ती ऊतक की चोट, ट्यूमर के विकास और स्व-प्रतिरक्षित रोगों के दौरान भड़काऊ प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है । यह सक्रिय endothelial कोशिकाओं की चमकदार सतह पर मुक्त प्रवाह से कब्जा करने की एक प्रक्रिया के माध्यम से सुविधा है, अंतर्निहित प्रभावित ऊतक में उनके आसंजन और transendothelial माइग्रेशन (स्थानांतरगमन) के बाद । हालांकि, monocyte उपआबादी के तरजीही और संदर्भ-आश्रित भर्ती का समर्थन करने वाले तंत्र अभी भी पूरी तरह से नहीं समझ पाए हैं । इसलिए, हमने एक ऐसी विधि विकसित की है, जो विभिन्न monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती को एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन और प्रवाह के अंतर्गत मापी जाने की अनुमति देती है. इस विधि, समय के आधार पर चूक फोकल इमेजिंग, अनुयाई और जन्मांतर monocytes के बीच अस्पष्ट अंतर के लिए अनुमति देता है । यहां, हम वर्णन कैसे इस विधि को एक साथ प्रो angiogenic और गैर angiogenic monocytes के भर्ती झरना इन विट्रो में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि को तीन monocyte आबादी तक की भर्ती के विभिंन चरणों का अध्ययन बढ़ाया जा सकता है ।

Introduction

Monocytes का गठन एक phagocytic घटक है कि रोगज़नक़ों से लड़ने के लिए आवश्यक है, क्षतिग्रस्त ऊतकों की सफाई, angiogenesis, और कैंसर सहित कई रोगों के pathophysiology1,2,3 . Monocytes अस्थि मज्जा-व्युत्पंन विषम उप जनसंख्या से बना कोशिकाओं है कि रक्त में घूम रहे हैं, लेकिन विशिष्ट आणविक तंत्र के माध्यम से परिधीय ऊतक में सूजन की साइट पर भर्ती किया जा सकता है । monocytes के भर्ती झरने, सामान्य रूप में ल्यूकोसाइट्स के लिए के रूप में, पोत दीवार के माध्यम से कब्जा, रोलिंग, रेंगने, गिरफ्तारी, transendothelial प्रवास (स्थानांतरगमन) और प्रवास सहित विभिन्न चरणों में फंसाते हैं (तहखाने झिल्ली और भित्ति कक्ष)4. इन कदमों में मुख्य रूप से endothelial चमकदार सतह पर सूजन प्रेरित अणुओं जैसे selectins, ग्लाइकोप्रोटीन लाइगैंडों, chemokines, सेलुलर और जंक्शनीय आसंजन अणुओं, और ल्यूकोसाइट्स पर उनकी रिसेप्टर्स शामिल selectin लाइगैंडों जैसे और integrins । या तो endothelial सेल जंक्शनों (paracellular) के माध्यम से या endothelial सेल शरीर (transcellular) के माध्यम से रास्ते ्े ल्यूकोसाइट्स द्वारा endothelial बैरियर5पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Whilst monocytes ऐतिहासिक transcellular मार्ग के माध्यम से transmigrate के लिए प्रलेखित किया गया है, उनके प्रवासी मार्ग में संभावित मतभेदों का प्रस्ताव किया गया है के रूप में monocytes अब एक सजातीय कोशिका आबादी माना जाता है । अब यह स्पष्ट होता जा रहा है कि monocyte विविधता उनके विशिष्ट extravasation कैस्केडिंग3,6के संबंध में उनके प्रत्येक मतभेद और समानताएं से परिभाषित की जा सकती है । इसलिए, monocyte उपआबादी के बीच स्पष्ट रूप से भेदभाव करने के लिए, यह कल्पना और भर्ती प्रक्रिया के दौरान इन विभिन्न उपजनसंख्याों में से प्रत्येक के व्यवहार को phenotype करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

मानव, सुअर, चूहे और चूहे से Monocytes कुछ जिंमेदार माना कार्यों और विशिष्ट प्रवासी व्यवहार7,8,9के साथ phenotypic उपआबादी में विभाजित किया गया । उदाहरण के लिए, मनुष्यों में, monocytes CD14 की उनकी सतह अभिव्यक्ति, बैक्टीरियल lipopolysaccharide के लिए एक coreceptor, और CD16, एफसी-गामा रिसेप्टर III के आधार पर तीन उपसमुच्चय में विभाजित किया जा सकता है । मानव monocyte उपजनसंख्याों में शास्त्रीय CD14+CD16-, मध्यवर्ती CD14+CD16+ तथा गैर-शास्त्रीय CD14मंदCD16+ कोशिकाएँ६,९शामिल हैं. शास्त्रीय CD14+CD16- monocytes मुख्य रूप से भड़काऊ हो दिखाया गया है जबकि CD16+ monocytes के पूल TIE2 अभिव्यक्ति और proangiogenic समारोह10वर्तमान को सामूहिक रूप से पाए गए । लगातार, भड़काऊ साइटोकिंस के साथ endothelial कोशिका उत्तेजना जैसे मानव ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) α या interleukin (IL-1) बीटा (पारंपरिक सूजन) शास्त्रीय CD14 की पूरी भर्ती को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त है+CD16 - monocytes । हालांकि, संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) एक और TNFα (angiogenic कारकों से प्रेरित सूजन) के एक साथ कार्रवाई स्थानांतरगमन के CD16+ proangiogenic पूल के monocytes को भड़काने के लिए आवश्यक हैं3. ऐतिहासिक, स्थैतिक शर्तों के तहत पारंपरिक Transwell प्रणाली, समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर, और µ-स्लाइड प्रवाह कक्षों को मात्रात्मक एक समय में एक ल्युकोसैट आबादी की भर्ती का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है इन विट्रो11 ,12,13. Whilst इन प्रोटोकॉल मांय किया गया है, एक और अधिक मजबूत तरीका है कि कई monocyte उपआबादी के एक साथ विश्लेषण की अनुमति दी और अधिक व्यावहारिक माना जाएगा । इस तरह के तरीके कई बातचीत और प्रत्येक संबंधित जनसंख्या के भिंन आवृत्तियों के लिए खाता है और यह भी समानताएं और भर्ती के लिए विशिष्टताओं के एक यंत्रवत समझ प्रदान करना चाहिए कि प्रत्येक monocyte परिभाषित सबसेट.

यहाँ, हम प्रवाह के तहत monocyte भर्ती की समय-चूक इमेजिंग पर आधारित एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो विभिन्न monocyte उपजनसंख्याों के प्रवासी झरने को एक साथ फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अध्ययन करने की अनुमति देता है । इस विधि endothelial कोशिका सूजन की नकल है कि कुछ महत्वपूर्ण सुविधाओं को एकीकृत करता है, के रूप में अच्छी तरह से पोस्ट-केशिका venules में संचारी monocytes के hemodynamics, vivo में ल्युकोसैट भर्ती के मुख्य स्थान. प्रस्तावित विधि मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) है, जो मानव गर्भनाल से अलगाव की एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पंन कर रहे है का उपयोग करता है । यह नैदानिक संसाधन भी endothelial कोशिकाओं है कि नाल नस से अलग किया जा सकता है की एक उचित उपज प्रदान whilst एक जैविक द्वारा उत्पाद के रूप में आसानी से उपलब्ध होने का लाभ है । हम भी फ्लोरोसेंट रंगों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इस्तेमाल के लिए अलग सेलुलर घटकों के बीच अंतर है, और फोकल माइक्रोस्कोपी स्पष्ट रूप से समय के साथ monocyte स्थिति (चमकदार बनाम abluminal) को परिभाषित करने के लिए । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल को एक साथ monocyte उपआबादी के स्थानांतरगमन स्तरों को मापने के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पद्धति को विभिन्ना उपक्रमों और लेबलिंग के उपयोग द्वारा अन्य ल्यूकोसाइट्स उपजनसंख्याों और भर्ती प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Protocol

मानव सामग्री स्वयंसेवक दाताओं की जानकारी सहमति के साथ और स्विस नीतिशास्त्र समितियों के अनुसार नैदानिक अनुसंधान पर इस्तेमाल किया गया ।

1. अलगाव और मानव गर्भनाल नस Endothelial कोशिकाओं की ठंड (HUVEC)

  1. एक T75 कुप्पी के लिए कोटिंग समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें (०.१ मिलीग्राम/एमएल कोलेजन जी और ०.२% फॉस्फेट में जिलेटिन बफर HUVEC से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीएच पर ७.४) ।
  2. पंजाब के साथ गर्भनाल साफ, यह बाँझ compresses के साथ पोंछ, और यह एक बाँझ 20 सेमी पेट्री डिश में जगह है । इस नाल के सिरों को बाँझ कैंची से काट लें ।
  3. एक बड़ी नस और दो छोटी धमनियों की पहचान । धीरे से एक प्रवेशनी डालने के साथ एक तीन तरह से टोंटी गर्भनाल पर नस में उग्रवाद समाप्त होता है ।
  4. गर्भनाल और तार की लंबाई के साथ मजबूती से प्रवेशनी कनेक्शन कस ।
  5. नाल की नसों को धोने के लिए नाल को दो बार Perfuse १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० u/एमएल streptomycin और २५० एनजी/एमएल amphotericin बी युक्त 20 मिलीलीटर के साथ RPMI । इस प्रक्रिया में गर्भनाल के कण और साफ होने की सूरत बनती है । collagenase इसके अलावा एक छोर पर एक सिरिंज के साथ RPMI इकट्ठा करने से पहले नस खाली ।
  6. Perfuse 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase प्रकार मैं (०.२२ µm-फ़िल्टर) की 12 मिलीलीटर के साथ नस ।
  7. नाल पर टोंटी बंद समाप्त होता है और 12 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्भनाल गर्मी ।
  8. धीरे शिरा लुमेन से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए गर्भनाल मालिश ।
  9. एक ५० मिलीलीटर सिरिंज के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त RPMI के 30 मिलीलीटर ले लो और गर्भनाल के एक छोर से कनेक्ट ।
  10. एक खाली ५० एमएल सिरिंज गर्भनाल के दूसरे छोर से कनेक्ट
  11. टोंटी खोलें और एक अंत whilst दूसरे छोर से इकट्ठा करने से नस perfuse ।
    नोट: एकत्रित निलंबन में endothelial कक्ष होते हैं ।
  12. 5 मिनट के लिए २०० x g पर इस सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  13. supernatant त्यागें और पूर्ण M199 मध्यम (20% FCS युक्त M199 के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend, 15 µ जी/एमएल endothelial सेल ग्रोथ सप्लीमेंट, १०० µ जी/एमएल हेपरिन सोडियम, ०.५ µ एम hydrocortisone, 10 µ जी/एमएल एल-Ascorbic एसिड, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० यू/एमएल streptomycin और २५० एनजी/एमएल amphotericin बी) ।
  14. T75 कुप्पी से कोटिंग समाधान निकालें और पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला ।
  15. बीज T75 कुप्पी में कदम १.१३ से एकत्र कोशिकाओं और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन में जगह है ।
  16. अगले दिन, अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए पूरी M199 माध्यम से कुप्पी 3 बार कुल्ला करें और फिर मध्यम हर 2 दिन तक संगम को बदल दें ।
  17. 80 – 90% संगम पर, HUVEC monolayer को एक बार कुल्ला करें और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिमी EDTA में ०.०५% trypsin के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को अलग कर लें । M199 क्रिया को रोकने के लिए FCS की 4 मिलीलीटर और 1 मिलीलीटर जोड़ें । कुप्पी फ्लश करने के लिए सभी HUVEC अलग ।
  18. ५० µ एल के एक aliquot ले लीजिए-cadherin, PECAM-1 और gp38 के दाग के लिए इस्तेमाल किया जा, और cytometry शुद्धता की जांच करने के लिए प्रवाह HUVEC द्वारा विश्लेषण ।
  19. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में १.१८ कदम से HUVEC के शेष ले लीजिए और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
  20. १.१९ कदम से supernatant त्यागें, ठंड समाधान (FCS 10% DMSO) में 5 x 105 कोशिकाओं की एक घनत्व पर cryotubes में, और फ्रीज में-८० डिग्री सेल्सियस या उपयोग तक तरल नाइट्रोजन में सेल गोली resuspend ।
  21. HUVEC शुद्धता की जांच करने के लिए:
    1. एंटी-ह्यूमन VE के 1 µ l को जोड़ें-cadherin-FITC एंटीबॉडी, 1 µ l के एंटी-ह्यूमन PECAM1-पे एंटीबॉडी, और एंटी-ह्यूमन µ के 1 Podoplanin l-सुरक्ष एंटीबॉडी के aliquot µ के ५० से HUVEC l के चरण १.१८ पर एकत्र.
    2. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    3. पंजाब के १०० µ एल जोड़ें और 30 एस के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक
    4. supernatant को छोड़ें और पंजाब के १०० µ jk में फिर से सस्पेंड करें । डेटा अब प्रवाह cytometry तकनीकों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।
      नोट: HUVEC VE-cadherin और PECAM-1 के लिए सकारात्मक हैं, और Podoplanin के लिए नकारात्मक ।

2. HUVEC

नोट: प्रयोग के लिए कम मार्ग पर HUVEC का उपयोग करें (अधिकतम 5 अंश) ।

  1. कोट 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोटिंग समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक T75 कुप्पी ।
  2. तेजी से 2 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर HUVEC स्थिर और पूर्ण M199 के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  4. पूरा M199 के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  5. पूर्व में लेपित कुप्पी में सेल सस्पेंशन स्थानांतरित । ३७ ° c पर 5% CO2के साथ मशीन में कुप्पी प्लेस । सेल कल्चर मीडियम को हर 2 दिन में बदलें ।

3. ०.४ µ में HUVEC संस्कृति-स्लाइड चैंबर

  1. पांच दिन के प्रवाह प्रयोग शुरू करने से पहले, पूर्व कोट एक ०.४ µ के मंडलों-30 मिनट के लिए ३७ ° c पर ०.१ मिलीग्राम/एमएल कोलेजन जी, ०.२% जिलेटिन युक्त पंजाब के µ एल के साथ स्लाइड ।
  2. चैंबर्स को धोकर पंजाब के १०० µ एल.
  3. एक 80-90% एक T75 कुप्पी के धाराप्रवाह HUVEC से कोशिकाओं को अलग ।
  4. पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला HUVEC और उंहें 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.०५% trypsin के 5 मिलीलीटर के साथ अलग ।
  5. फ्लश और पूरा M199 में सेल निलंबन इकट्ठा और सबसे सुविधाजनक विधि द्वारा कोशिकाओं की गिनती । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. 106 कोशिकाओं पर सेल गोली resuspend/एमएल और 30 µ एल चैंबर प्रति (३०,००० कोशिकाओं) वितरित ।
  7. एक मशीन में ३७ ° c के साथ 5% सह2 के लिए 1 एच के लिए कोशिकाओं में मशीन ।
  8. प्रत्येक कक्ष और संस्कृति ३७ ° c और 5% CO2पर मशीन में 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को पूरा M199 के १५० µ एल जोड़ें । मीडियम को हर 2 दिन में चेंज कर लीजिये.

4. प्रवाह के तहत Monocyte भर्ती परख के लिए HUVEC धुंधला

  1. M199 और CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) के 1 µ मीटर के बने लेबलिंग माध्यम तैयार करें और सेल लेबलिंग से पहले 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर इसे गर्म कर लें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म M199 मध्यम के साथ दो बार HUVEC धो लें ।
  3. गर्म लेबलिंग मध्यम के 30 µ एल के साथ बदलें ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 के लिए 10 मिनट में मशीन में CMFDA और जगह के 1 µ मीटर से युक्त ।
  4. पूरा M199 के साथ एक बार धो लें और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में 30 मिनट के लिए मशीन में पूरा M199 के साथ कोशिकाओं को गर्मी ।
    नोट: यह लेबलिंग समाधान के अलावा पहले सीरम के सभी निशान को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, अंयथा यह HUVEC धुंधला बदल सकते हैं ।
  5. या तो मानव TNFα (५०० यू/एमएल) या मानव TNFα (५०० u/एमएल) के साथ मानव VEGFA (1 µ जी/एमएल) के साथ एक मशीन में 6 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2से युक्त पूर्ण M199 के साथ मध्यम बदलें ।

5. मानव पान Monocytes का अलगाव और उपआबादी का दाग

  1. या तो ध्यान केंद्रित मानव रक्त, या हौसले से अलग मानव रक्त के 20 मिलीलीटर, EDTA vacutainer ट्यूबों में प्रयोग के दिन पर एकत्र की एक buffy कोट का प्रयोग करें ।
  2. पंजाब में खून पतला-1 mM EDTA (1:1) और पिपेट धीरे घनत्व ढाल मीडिया के 20 मिलीलीटर के शीर्ष पर पतला रक्त के 20 मिलीलीटर । धीमी गति से त्वरण के साथ और ब्रेक के बिना कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
  3. परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMC)-प्लेटलेट परत (घनत्व ढाल मीडिया और प्लाज्मा परतों के बीच) लीजिए एक नया ५० मिलीलीटर में पंजाब के ४० मिलीलीटर-1 मिमी EDTA युक्त ट्यूब । टॉप अप ५० एमएल के साथ पंजाब-1 मिमी EDTA ।
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  5. सेल गोली के दाग बफर के 10 मिलीलीटर के साथ resuspend (पंजाब-1 मिमी ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन BSA युक्त EDTA) ।
  6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
  7. चरण ५.५ और ५.६ दोहराएँ ।
  8. के साथ सेल गोली resuspend बफर धुंधला के 10 मिलीलीटर । सेल काउंट के लिए 10 µ l का aliquot लें ।
  9. PBMC आबादी की जांच करें और एक प्रवाह cytometer के साथ तेजी से कोशिकाओं गिनती ।
    नोट: विशेषता लिम्फोसाइट और monocyte आबादी (चित्रा 1a) मनाया जा सकता है । से ५० मिलीलीटर ताजा मानव रक्त की उंमीद के बारे में 50-100 x 106 PBMC ।
  10. CD14 की भर्ती के लिए + बनाम CD14-PBMC के तहत प्रवाह:
    1. गोली धो प्रवाह बफर के साथ तीन बार (M199 ०.५% BSA युक्त) और 6 x 106 प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं पर प्रवाह बफर में mononuclear कोशिकाओं resuspend ।
    2. प्रत्येक परख के लिए २०० µ l का aliquots बनाओ । ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी 20 मिनट तक परख से पहले ।
    3. प्रत्येक aliquot के लिए 2 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता पर विरोधी CD14-पीई और Hoechst ३३३४२ के 5 µ एल जोड़ें । मिश्रण और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    4. केंद्रापसारक 30 एस के लिए ४०० x g पर aliquot ।
    5. supernatant त्यागें और २०० µ प्रवाह बफर के एल के साथ गोली resuspend ।
  11. प्रवाह के अंतर्गत monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती के लिए:
    1. अलग monocytes एक पैन monocyte आइसोलेशन किट के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
      नोट: निम्न आइसोलेशन प्रोटोकॉल ५० x 106 कक्षों के लिए है । यह ऊपर या नीचे के रूप में यह निर्माता की सिफारिशों के भीतर है जब तक स्केल किया जा सकता है ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर PBMC निलंबन केंद्रापसारक ।
    3. supernatant त्यागें और ४०० µ धुंधला बफर के एल के साथ गोली resuspend ।
    4. जोड़ें ५० µ एफसी के एल-रिसेप्टर ब्लॉकिंग एजेंट और ५० पैन Monocyte एंटीबॉडी कॉकटेल के µ एल.
    5. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    6. धुंधला बफर के ४०० µ एल जोड़ें और चुंबकीय मोतियों की १०० µ एल संयुग्मित विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    7. धुंधला बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और एक एमएसीएस रास एक चुंबक के साथ युग्मित कॉलम का उपयोग करें ।
    8. चुंबक पर रास कॉलम प्लेस और धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    9. कॉलम में PBMC निलंबन दर्रा और स्पष्ट प्रवाह हालांकि एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में पैन monocytes युक्त इकट्ठा ।
    10. 5 मिलीलीटर ऊपर ऊपर करने के लिए धुंधला बफ़र जोड़ें ।
    11. एक aliquot ले लो और एक प्रवाह cytometer के साथ monocyte अलगाव की गुणवत्ता की जांच करें ।
    12. पैन monocyte गणना का निर्धारण ।
      नोट: केवल monocyte जनसंख्या (आंकड़ा 1b)मनाया जा सकता है ।
    13. 5 मिनट के लिए २०० x g पर कदम 5.11.11 से monocytes के शेष केंद्रापसारक ।
    14. supernatant को त्यागें ।
    15. प्रवाह बफर के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (०.५% BSA युक्त M199) ।
    16. EDTA के किसी भी ट्रेस को समाप्त करने के लिए 5.11.13 दोहराएं 5.11.14 दो बार ।
  12. प्रवाह बफर में monocyte सस्पेंशन (M199 ०.५% BSA के साथ) 6 x 106 कोशिकाओं/एमएल में बनाओ ।
  13. प्रत्येक भर्ती की परख के लिए monocytes के २०० µ l का aliquots बनाओ ।
  14. इंजेक्शन से पहले 20 मिनट तक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर aliquot रखें ।
  15. प्रत्येक µ को एंटी-CD16-पे एंटीबॉडी और Hoechst ३३३४२ (2 aliquot मी final) के 5 µ l जोड़ें ।
  16. मिश्रण और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  17. केंद्रापसारक 30 एस के लिए ४०० x g पर aliquot ।
  18. supernatant त्यागें और २५० µ प्रवाह बफर के एल के साथ गोली resuspend ।
  19. एक कक्ष में monocyte निलंबन के 30 µ l जोड़ने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना के लिए सेवा करने के लिए स्लाइड.
  20. monocyte के aliquots को ३७ ° c पर चरण ५.१८ से रखें ।
    नोट: इस सस्पेंशन को फ्लो सिस्टम में इंजेक्ट कर तैयार किया गया है ।

6. द्रवित प्रणाली की तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि इमेजिंग के लिए सेल मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट ।
    नोट: प्रवाह प्रणाली का एक आरेख चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  2. टयूबिंग भाग मैं इकट्ठा: सिलिकॉन टयूबिंग (8 सेमी लंबी और 3 मिमी मोटी) के एक टुकड़े के एक छोर करने के लिए एक Luer संबंधक पुरुष डालें और एक लाइन में Luer इंजेक्शन सेट करने के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट । एक छोर पर सिलिकॉन टयूबिंग (४० सेमी और 3 मिमी मोटी) का एक टुकड़ा के बाद Luer कनेक्टर कनेक्ट ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 3 तरह से एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े नल में लाइन Luer इंजेक्शन सेट और अंततः हवा बुलबुला हटाने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के बीच डाला जा सकता है ।
  3. टयूबिंग भाग द्वितीय इकट्ठा: सिलिकॉन टयूबिंग (1 मीटर लंबी और 3 मिमी मोटी) की लंबाई के एक छोर के लिए एक 20 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट । टयूबिंग के दूसरे छोर पर एक Luer कनेक्टर पुरुष डालें ।
  4. एक महिला Luer ताला युग्मक (चित्रा 2a) के लिए Luer संबंधक पुरुषों डालने से भाग मैं और भाग द्वितीय टयूबिंग कनेक्ट ।
  5. प्रवाह बफर युक्त जलाशय में सिलिकॉन टयूबिंग के मुक्त अंत रखो (M199 + ०.५% BSA) ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम ।
  6. प्रवाह बफर के साथ टयूबिंग भरने के लिए 20 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर पर खींचो ।
  7. पंप पर सिरिंज प्लेस और यह सुरक्षित ।
  8. वापस मोड में पंप सेट (के रूप में मना करने का विरोध किया) और प्रवाह की दर निर्दिष्ट करें ।
  9. प्रवाह दर निम्न सूत्र का उपयोग करके उपयोग किया गया IBIDI स्लाइड के अनुसार निर्धारित करें:
    Equation
    नोट: स्लाइड फ़ैक्टर प्रयोग के लिए उपयोग की गई IBIDI स्लाइड पर निर्भर होता है । इस उदाहरण में उपयोग किया गया µ-स्लाइड I०.४ Luer लॉक के लिए, स्लाइड फ़ैक्टर १३१.६ है । विशिष्ट स्लाइड कारकों के लिए, कंपनी की वेबसाइट14देखें । प्रवाह बफर चिपचिपापन है ०.००७२ dyn. s/ कतरनी तनाव के बाद केशिका venules है के बारे में ०.५ dyn/
  10. स्लाइड कनेक्ट करें (चित्र b):
    1. महिला Luer ताला युग्मक के आसपास सिलिकॉन टयूबिंग दबाना और युग्मक से दो Luer कनेक्टर नर डिस्कनेक्ट ।
    2. उन्हें उत्तेजित HUVEC युक्त स्लाइड के जलाशयों से कनेक्ट करें और मध्यम से भरें । इस कदम के दौरान हवा के बुलबुले से बचें ।
    3. बंद clamps ले लो और सुनिश्चित करें कि कनेक्शन लीक नहीं है ।
  11. समय के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड प्लेस-चूक इमेजिंग और पंप शुरू करते हैं ।

7. फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रवाह के तहत Monocyte भर्ती की समय-चूक इमेजिंग

  1. इमेजिंग के लिए 40x उद्देश्य ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
  2. सक्रिय ४०५ एनएम (ब्लू monocyte नाभिक), ४८८ एनएम (हरी endothelial कोशिकाओं) और ५६१ एनएम (लाल CD16 + सबसेट) पराबैंगनीकिरण ।
  3. जिसमें monocytes प्राप्ति पैरामीटर सेट करने के लिए कक्ष का उपयोग करें ।
    नोट: दोनों गैर जन्मांतर और जन्मांतर monocytes का पता लगाने के लिए, pinhole और लेजर ४०५ एनएम की तीव्रता उच्च सेट कर रहे हैं । इस प्रकार, गैर जन्मांतर monocytes बेसल योजना में थोड़ा दिखाई दे रहे हैं । लेकिन केवल जन्मांतर monocytes endothelial कोशिकाओं के नीचे कब्जा कर लिया नए अंतरिक्ष के लिए इसी नाभिक के आसपास एक दाग क्षेत्र मौजूद ।
  4. चैंबर माइक्रोस्कोप के तहत अधिग्रहीत किया जा करने के लिए जगह है ।
  5. बहु स्थिति फोकल इमेजिंग के लिए 1 सेमी त्रिज्या के भीतर विचारों के 3 क्षेत्रों चुनें ।
  6. endothelial कोशिकाओं के बेसल और शिखर पक्षों को परिभाषित करें
  7. एक z-स्टैक करने के लिए 10 – 12 µm श्रेणी (०.५ µm चरण) सेट करें । एक समय चूक अधिग्रहण हर 1 मिनट भागो ।
  8. इमेजिंग के 3 मिनट के बाद, में लाइन Luer इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से monocyte निलंबन (6x106 कोशिकाओं/एमएल) के २०० µ एल इंजेक्षन ।
    नोट: तेजी से monocytes शिखर फोकल विमान में दिखाई देते हैं, का पालन करें और स्थानांतरगमन शुरू (शिखर से बेसल योजना के लिए पारगमन) ।
  9. छवि के लिए ंयूनतम 30 मिनट । एक बार समाप्त, इमेजिंग बंद करो और प्रवाह को रोकने के । उंहें स्लाइड से डिस्कनेक्ट करने के लिए टयूबिंग दबाना ।
  10. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde के साथ स्लाइड को ठीक करें ।
  11. पंजाब के साथ स्लाइड धो और अगर जरूरत है और विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान ।

8. ImageJ के साथ डेटा का विश्लेषण

  1. प्रत्येक फ़ील्ड में कुल अनुयाई monocytes की संख्या गिनना । प्रति mm2कक्ष संख्या निर्धारित करें ।
  2. गिनती जन्मांतर monocytes कि endothelial कोशिकाओं के नीचे बेसल योजना में मौजूद है और नाभिक के आसपास (ग्रीन चैनल में) एक काला छेद की उपस्थिति द्वारा की पहचान की ।
  3. अनुयाई ल्यूकोसाइट्स की कुल संख्या द्वारा जन्मांतर ल्यूकोसाइट्स की गिनती विभाजित । स्थानांतरगमन दर को शत-प्रतिशत अनुयाई monocytes के रूप में प्रस्तुत किया गया है.
  4. उदाहरण के लिए, शिखर और बेसल पक्षों को एक साथ दिखाया जा सकता है इन endothelial डिब्बों में से प्रत्येक में होने वाली घटनाओं को वर्णन ।

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Representative Results

TNFα द्वारा प्रेरित HUVEC सक्रियण की स्थिति का निर्धारण

भड़काऊ cytokine TNFα की जैव-गतिविधि बैच और ठंड के repletion-गल चक्र के अनुसार भिन्न हो सकते हैं । यह TNFα उपचार के साथ HUVEC की सक्रियण स्थिति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह selectins, िकैम-1 और VCAM-115,16,17के भड़काऊ प्रेरण के लिए धाराप्रवाह HUVEC के कुछ नमूने समानांतर में दाग द्वारा किया जा सकता है । TNFα उपचार के बाद HUVEC की सक्रियण स्थिति की जाँच करने के लिए एक आसान और सरल तरीका भड़काऊ तनाव के तहत endothelial कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित रूपात्मक परिवर्तन है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, 6 के बाद HUVEC बढ़ाव उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना में TNFα की उपस्थिति में एच । इसी तरह के बढ़ाव मनाया जाता है जब HUVECs TNFα और VEGFA के मिश्रण से उत्तेजित कर रहे हैं । HUVEC की सक्रियण स्थिति रिकॉर्डिंग महत्वपूर्ण है के रूप में monocytes के स्थानांतरगमन के अंतिम परिणाम endothelial सेल सक्रियण की गुणवत्ता पर निर्भर करेगा ।

Monocyte स्थानांतरगमन endothelial कोशिकाओं में एक विशेषता विच्छेदन बनाता है

प्रवाह के तहत monocyte स्थानांतरगमन का अध्ययन करने के लिए, हम endothelial कोशिकाओं के साथ हरे रंग में सना हुआ CMFDA और नाभिक monocytes ३३३४२ डाई (चित्रा 4) के साथ नीले रंग में दाग अलग पारगंय के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया । समय चूक फोकल इमेजिंग शिखर विमान है, जहां उनके phenotype (चित्रा 4a-सी, पूरक फिल्म 1) का मूल्यांकन किया जा सकता है पर monocytes के दृश्य की अनुमति दी । स्थानांतरगमन से गुजरने वाले कक्ष माइग्रेट करने से पहले वे शिखर विमान से गायब हो गए और बेसल विमान में प्रकट हुए सेल-सेल जंक्शनों के संगत सेलुलर स्पेस में चले गए । जन्मांतर कोशिकाओं monocyte आकार करने के लिए इसी नाभिक के चारों ओर एक काला छेद प्रस्तुत किया । यह आकार लगातार endothelial कोशिकाओं (चित्रा 4a-सी, पूरक फिल्मों 2-3) केनीचे monocyte प्रवास के दौरान बदल दिया है । इस गतिशील ब्लैक होल endothelial कोशिकाओं के नीचे monocyte शरीर द्वारा बनाई गई, और monocyte स्थिति, जन्मांतर कोशिकाओं की अस्पष्ट पहचान के लिए अनुमति दी । समय के साथ monocyte भर्ती के Quantitation स्थानांतरगमन (चित्रा 4dई) के बाद monocyte आसंजन दिखाया । हालांकि ल्यूकोसाइट्स transcellular और paracellular दोनों मार्गों के माध्यम से extravasate कर सकते हैं, हम केवल इस विधि के साथ प्रवाह के तहत paracellular स्थानांतरगमन का निरीक्षण कर सकता है । यह हमारे पिछले टिप्पणियों3,11,18,19के साथ संगत है ।

Angiogenic फैक्टर प्रेरित सूजन CD16 के स्थानांतरगमन को बढ़ावा + monocytes

इस विधि का उपयोग करके, हम मानव proangiogenic बनाम गैर angiogenic monocytes के स्थानांतरगमन का विश्लेषण एक endothelial monolayer cytokine कारक TNFα के साथ अकेले या संयोजन में भड़काऊ angiogenic द्वारा उत्तेजित के माध्यम से । मानव proangiogenic monocytes को उनकी सतह पर CD16 या TIE2 की अभिव्यक्ति से पहचाना जा सकता है. यहां एंटी-CD16-पे एंटीबॉडी के समर्थक और गैर-angiogenic monocytes के बीच भेदभाव किया जाता था. चित्रा 5बी (पूरक फिल्मों 4-5)में दिखाया गया है, CD16+ monocytes की स्थानांतरगमन दर कम थी जब endothelial कोशिकाओं TNFα के साथ ही उत्तेजित हो गया था । हालांकि, इस दर में वृद्धि हुई जब endothelial कोशिकाओं TNFα और VEGFA (चित्रा 5C-ई, पूरक फिल्मों 6-7) के साथ एक साथ उत्तेजित थे । गैर angiogenic monocytes की स्थानांतरगमन दर इसी तरह दोनों भड़काऊ स्थितियों के तहत उच्च था । दोनों सेल उपआबादी के लिए, स्थानांतरगमन paracellular मार्ग के माध्यम से विशेष रूप से हुई । इस विधि इसलिए विभिंन monocytic आबादी के स्थानांतरगमन योग्यता के लिए अनुमति देता है एक साथ जांच की जाएगी ।

monocytes की पवित्रता स्थानांतरगमन कुशलता को प्रभावित करती है

परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, NK कोशिकाओं और monocytes से बना रहे हैं । यहाँ प्रयुक्त monocyte आइसोलेशन पद्धति को PBMC से अन्य ल्युकोसैट आबादी की कमी की आवश्यकता है. monocyte शुद्धता के अभाव के परिणामों को कैसे प्रभावित करता है, यह समझने के लिए हमने PBMCs के तहत भर्ती परख करने से पहले एक एंटी-CD14-पे एंटीबॉडी के साथ पान-monocytes के लिए दाग लगाया था । के रूप में चित्रा 6में दिखाया गया है, TNFα या TNFα + VEGFA के साथ HUVEC उत्तेजना केवल स्थानांतरगमन जनसंख्या के monocyte प्रेरित । टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और NK कोशिकाओं से बना अन्य ल्यूकोसाइट्स TNFα या TNFα + VEGFA के तहत transmigrate नहीं किया. वास्तव में, यह प्रलेखित किया गया है कि इन ल्यूकोसाइट्स स्थानांतरगमन के लिए अंय संकेतों की जरूरत है । इस प्रकार, monocytes के एक अकुशल अलगाव monocyte स्थानांतरगमन के एक अनुमान को बढ़ावा मिलेगा, के रूप में अंय ल्यूकोसाइट्स monocytes के रूप में गिना जाएगा । यह monocyte स्थानांतरगमन पर एक गलत परिणाम के लिए नेतृत्व, अंय ल्यूकोसाइट्स के साथ monocyte जनसंख्या के संदूषण के कारण होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह cytometry द्वारा पृथक monocytes की रूपरेखा । (क) लिम्फोसाइट की कमी से पहले PBMC की आकृति विज्ञान का विश्लेषण. परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के आकार (फॉरवर्ड तितर बितर: FSC) और दानेदार (साइड स्कैटर: एसएससी) प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किए गए थे । (ख) पृथक monocytes का आकार और दानेदार लिम्फोसाइट घट जाने के पश्चात् प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया. monocytes का एक कुशल अलगाव लिम्फोसाइट जनसंख्या की एक पूरी कमी से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: द्रव प्रणाली के आरेख । (एक) छिड़काव प्रणाली की योजनाबद्ध सिंहावलोकन से पहले और स्लाइड के कनेक्शन के बाद और सिरिंज पंप पर बढ़ते । (ख) clamps का उपयोग कर टयूबिंग के साथ स्लाइड को जोड़ने की प्रक्रिया के आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: endothelial कोशिकाओं के कुशल सक्रियण की जाँच. भड़काऊ उत्तेजनाओं द्वारा HUVEC के सक्रियकरण चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सेल आकार का विश्लेषण करके जांच की थी । उपचार के 6 घंटे के बाद, HUVEC TNFα (५०० u/एमएल) या TNFα का मिश्रण (५०० u/एमएल) + VEGFA (1 µ जी/एमएल) के साथ उत्तेजित जब उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना में एक लंबी आकृति विज्ञान मौजूद है । भड़काऊ उत्तेजना के बाद HUVEC के इस रूपात्मक परिवर्तन एक आसान सेल सक्रियण, जो प्रवाह परख के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए के सूचक का पता लगाने के लिए है । स्केल बार = १२० µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जन्मांतर monocytes की पहचान. (क) शिखर और बेसल विमानों में अपेक्षित विचारों के साथ monocyte स्थानांतरगमन का आरेख. Hoechst ३३३४२ के साथ दाग monocytes के नाभिक नीले रंग में चित्रित कर रहे हैं, और monocytes की सैद्धांतिक आकृतियों नाभिक के आसपास धराशाई लाइनों के साथ चित्रित कर रहे हैं । बेसल व्यू में जन्मांतर फ्लैट monocytes को endothelial सेल के नीचे एक स्पेस पर कब्जा करते हुए दिखाया गया है । यह स्थान एक काला छेद फोकल छवियों पर monocyte नाभिक आसपास के रूप में प्रकट होता है । (ख) स्थानांतरगमन के पहले और बाद में किसी monocyte का स्थानीयकरण. ओर्थोगोनल दृश्य दिखाए जाते हैं, और एक ब्लैक होल की उपस्थिति (सफेद डैश्ड रेखा के साथ delineated) endothelial abluminal डिब्बे में monocyte माइग्रेशन के बाद मनाया जा सकता है । एक लाल arrowhead स्थानांतरगमन से पहले एक monocyte की स्थिति को इंगित करता है और सफेद arrowhead स्थानांतरगमन के बाद एक ही कोशिका को इंगित करता है । ओर्थोगोनल विचार बताते है कि जन्मांतर monocyte endothelial सेल के नीचे है । स्केल बार = ४० µm. (ग) monocyte भर्ती ओवरटाइम के समय चूक छवि अनुक्रम (से 0 में 20 मिनट) । शिखर और बेसल दृश्य दिखाए गए हैं । पूर्ण दृश्यों पूरक फिल्मों 1, 2 और 3में देखा जा सकता है । लाल चौकों एक नीले नाभिक के साथ एक जन्मांतर monocyte पर प्रकाश डाला । endothelial सेल के नीचे monocyte के फ्लैट शरीर के अनुरूप ब्लैक होल एक डैश्ड येलो लाइन द्वारा delineated है । स्केल बार = ४० µm. (घ) TNFα के लिए monocyte आसंजन के ठहराव-उत्तेजित बनाम समय के साथ उत्तेजित HUVEC । (ङ) समय के साथ monocyte स्थानांतरगमन दर का ठहराव. N = 3 जैविक प्रतिकृति । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.D. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रवाह के तहत monocyte उपआबादी के स्थानांतरगमन की एक साथ जांच । (क) proangiogenic monocytes की भर्ती (CD16+) और गैर-angiogenic monocytes के समय पर TNFα-आपन HUVEC के माध्यम से समय-चूक छवि अनुक्रम (0 से 20 मिनट तक). स्केल बार = ४० µm; शिखर और बेसल दृश्य दिखाए गए हैं । पूर्ण अनुक्रम शिखर और पूरक फिल्म के लिए 4 पूरक फिल्म में देखा जा सकता है 5 बेसल विचारों के लिए । (ख) मानव proangiogenic monocytes के स्थानांतरगमन (HPMo: CD16 +) और मानव गैर-angiogenic monocytes (HNMo) के Quantitation के माध्यम से एक TNFα-आपन HUVEC monolayer । N = 4 जैविक प्रतिकृति, डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.D. * p < ०.०५; मान-Whitney test. (ग) TNFα + VEGFA-आपन HUVEC के माध्यम से proangiogenic और गैर-angiogenic monocytes ओवरटाइम की भर्ती के समय-चूक छवि अनुक्रम (0 से 20 मिनट) । स्केल बार = ४० µm; शिखर और बेसल दृश्य दिखाए गए हैं । पूर्ण दृश्यों शिखर और पूरक मूवी 7 के लिए बेसल विचारों के लिए पूरक फिल्म 6 में देखा जा सकता है । (घ) मानव proangiogenic monocytes के स्थानांतरगमन के Quantitation (HPMo: CD16 +) और मानव गैर-angiogenic monocytes (HNMo: CD16-) के माध्यम से TNFα + VEGFA-आपन HUVEC monolayer. N = 4 जैविक प्रतिकृति, डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± S.D. * p < ०.०५; मान-Whitney test. (ङ) CD16 का स्थानीयकरण+ monocytes से पहले (10 min) और उसके बाद (15 min) स्थानांतरगमन के माध्यम से TNFα + VEGFA-उत्तेजित HUVEC. ओर्थोगोनल दृश्य दिखाए गए हैं । स्केल बार = ४० µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: CD14 के स्थानांतरगमन की एक साथ जांच + बनाम CD14-PBMC प्रवाह के अंतर्गत । (क) CD14 के आसंजन+बनाम CD14- PBMC को TNFα-आपन HUVEC के तहत प्रवाहित करना. (ख) CD14 के आसंजन+बनाम CD14- PBMC को TNFα + VEGFA-आपन HUVEC के तहत प्रवाहित करना. (ग) स्थानांतरगमन दर (%) CD14+बनाम CD14- PBMC के माध्यम से TNFα-आपन HUVEC के तहत प्रवाह. (घ) स्थानांतरगमन दर (%) CD14+बनाम CD14- PBMC के माध्यम से TNFα + VEGFA-आपन HUVEC के तहत प्रवाहित. डेटा मतलब ± S.D. N = 4 जैविक प्रतिकृति हैं । * p < ०.०५; मान-Whitney test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक फिल्म 1: पैन के शिखर विमान में देखें-monocyte प्रवाह के तहत भर्ती । शिखर विमान में प्रवाह के अंतर्गत पैन monocyte की भर्ती का विस् तृत दृश् य । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. स्केल बार = ५० µm कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फिल्म 2: पैन के बेसल विमान पर देखें-monocyte प्रवाह के तहत भर्ती । बेसल विमान में प्रवाह के तहत पैन monocyte की भर्ती का विस् तृत दृश् य । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. स्केल बार = ५० µm कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक फिल्म 3: पैन के ढेर-monocyte प्रवाह के अंतर्गत -------- प्रवाह के तहत पैन monocyte की भर्ती के विस्तार दृश्य के रूप में पूरक फिल्मों 1 और 2में दिखाया गया है । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. स्केल बार = ५० µm कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक चलचित्र 4: monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती के शिखर विमान में देखें TNFα-आपन HUVEC. प्रवाह के तहत TNFα-सक्रिय HUVEC प्रवाह के अंतर्गत monocyte उपजनसंख्याों के एक साथ भर्ती के शिखर विमान में विस्तारित दृश्य । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. मानव proangiogenic monocyte उपआबादी CD16 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा पहचान की गई. स्केल बार = 30 µm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 5: monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती के बेसल विमान में देखें TNFα-आपन HUVEC. विस्तारित दृश्य, बेसल विमान में, प्रवाह के तहत monocyte उपनिवेशों के लिए TNFα-सक्रिय HUVEC के तहत एक साथ भर्ती की । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. मानव proangiogenic monocyte (HPMo) उपजनसंख्या CD16 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना गया था । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 6: monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती के शिखर विमान में देखें TNFα+ VEGFA-आपन HUVEC. विस्तारित दृश्य, शिखर विमान में, प्रवाह के तहत monocyte उपआबादी के एक साथ भर्ती के TNFα + VEGFA-सक्रिय HUVEC प्रवाह के तहत । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. मानव proangiogenic monocyte उपजनसंख्या CD16 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना गया था । स्केल बार = 30 µm कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 7: monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती के बेसल विमान में देखें TNFα+ VEGFA-आपन HUVEC. विस्तारित दृश्य, बेसल विमान में, प्रवाह के तहत monocyte उपआबादी के एक साथ भर्ती के TNFα + VEGFA-प्रवाह के तहत सक्रिय HUVEC । HUVEC CMFDA से सना थे और monocytes के नाभिक Hoechst ३३३४२ से सना रहते थे. मानव proangiogenic monocyte (HPMo) उपजनसंख्या CD16 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना गया था । स्केल बार = 30 µm कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम एक अध्ययन की विधि का ब्यौरा कैसे monocyte उपआबादी transmigrate के माध्यम से सूजन endothelial monolayer । चर्चा की विधि के बजाय चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी, जो भी प्रवाह3,11,19के तहत monocyte भर्ती अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है फोकल माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया । समय के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के एक प्रमुख लाभ-चूक इमेजिंग स्थानांतरगमन और monocytes के मजबूत आसंजन के बीच स्पष्ट रूप से भेदभाव करने की क्षमता है । हालांकि चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी आधारित विधि भी मजबूत है, यह जन्मांतर कोशिकाओं और जोरदार अनुयाई कोशिकाओं को मिश्रण से बचने के क्रम में विशेषज्ञता की आवश्यकता है । इस मामले में, एक monocyte भर्ती झरना के इन दो राज्यों के बीच एक स्पष्ट अंतर बनाने के क्रम में विश्लेषण के लिए सख्त मानदंड स्थापित करने की जरूरत है । इसके अलावा, यह भी महत्वपूर्ण है के लिए फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा एक समापन बिंदु विश्लेषण करने के क्रम में वैश्विक रुझान की पुष्टि के लिए चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया । इस प्रकार, फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रत्यक्ष उपयोग प्रवाह के तहत monocyte भर्ती की जांच करने के लिए कब्जा कर लिया monocytes की वास्तविक स्थानांतरगमन स्थिति पर स्पष्ट परिणाम प्रदान करता है ।

प्रवाह के तहत ल्युकोसैट भर्ती परख निष्पादित करने में प्रमुख अड़चनों में से एक है और एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए विश्लेषण प्रदर्शन और सेल-सेल जंक्शन के माध्यम से स्थानांतरगमन को कब्जा से व्यक्तिगत कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए खर्च समय है । इस तरह के विश्लेषण के स्वचालन संभव है, लेकिन क्रॉल और जन्मांतर monocytes के बीच चरण विपरीत समानता के कारण प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है । यहां हम फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिखा कि monocyte स्थानांतरगमन बेसल monocytes नीचे जन्मांतर HUVEC के आकार के अनुरूप विमान में धुंधला सेल के एक विच्छेदन के साथ था । इस स्थिति की पुष्टि ओर्थोगोनल प्रक्षेपण द्वारा किया गया । monocyte स्थानीयकरण के संक्रमण सेल सेल एक paracellular स्थानांतरगमन का संकेत जंक्शनों के बीच विशेष रूप से हुई । यह हमारे पिछले डेटा के अनुरूप है, जो दिखाया है कि इन विट्रो में प्रवाह के तहत, monocytes transmigrate HUVEC3,18के साथ paracellular मार्ग के माध्यम से विशेष रूप से । यहां प्रस्तावित विधि पूरक करने के लिए, यह जैसे VE-cadherin, जाम, या PECAM1 के लिए monocyte स्थानांतरगमन (paracellular बनाम transcellular) के संभावित स्थलों के चित्र के रूप में जंक्शनीय प्रोटीन के खिलाफ गैर अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संभव है । हम पुष्टि की है कि काले monocyte नाभिक आसपास के आकार जन्मांतर कोशिकाओं की एक मजबूत विशेषता है और एक साधारण घटना है कि सॉफ्टवेयर द्वारा detectable हो सकता है । हालांकि एक मैनुअल सेल गिनती प्रणाली यहां का प्रदर्शन किया है, ल्युकोसैट नाभिक के चारों ओर काले आकार के गठन एक कसौटी है कि स्वचालित विश्लेषण में ल्युकोसैट स्थानांतरगमन को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार समय की एक बहुत बचत । वर्तमान में हम इस तरह के विश्लेषण के लिए एक स्वचालित आवेदन विकसित करने पर काम कर रहे हैं ।

प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोपी पहले ल्युकोसैट भर्ती के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । हालांकि, वे एक साथ विभिन्न उपआबादी की भर्ती की जांच तक नहीं करते थे । यहाँ हम एक ही microenvironment में एक साथ ल्युकोसैट उपप्रकार की भर्ती का अध्ययन करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की एक रूपरेखा का प्रस्ताव. हम बताते है कि फोकल माइक्रोस्कोपी अलग monocyte उपआबादी के प्रवासी व्यवहार एक साथ जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, हमने proangiogenic और गैर-angiogenic monocytes के बीच भेदभाव करने के लिए CD16 अभिव्यक्ति का उपयोग किया है ताकि विभिन्न भड़काऊ संदर्भों में दो उपजनसंख्याों की स्थानांतरगमन क्षमता का अध्ययन हो सके. हमारे हाल के प्रकाशन के अनुरूप, फोकल माइक्रोस्कोपी मोडल का उपयोग करके, हम पता चला है कि CD16+ monocytes के स्थानांतरगमन दर कम था जब endothelial सेल monolayer केवल TNFα3द्वारा उत्तेजित किया गया था । हालांकि, TNFα और VEGFA के संयोजन proangiogenic monocytes के स्थानांतरगमन में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया । स्थानांतरगमन दर दोनों भड़काऊ स्थितियों के तहत गैर-angiogenic CD16- monocytes के लिए इसी तरह उच्च था । हम पहले से पता चला है कि monocyte विरोधी CD16 एंटीबॉडी के साथ धुंधला स्थानांतरगमन पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव मौजूद नहीं था, monocytes परख के बाद unlabelेड स्थानांतरगमन के विश्लेषण से इस पुष्टि, फोकल माइक्रोस्कोपी3का उपयोग कर । हालांकि, नए ल्युकोसैट उपप्रकार या एंटीबॉडी के लिए उंहें चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया, लेबलिंग प्रभाव का आकलन करने की जरूरत है । इस विधि का प्रयोग, ल्यूकोसाइट्स के तीन अलग आबादियों के लिए एक साथ अध्ययन किया जा सकता है । यह है कि कार्यात्मकता अलग या समान प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार है उपजनसंख्या हो सकता है । हालांकि यहां ध्यान monocyte स्थानांतरगमन पर है, उनकी भर्ती के अंय कदम भी इस विधि द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, स्थानांतरगमन से पहले सेल व्यवहार, जैसे कब्जा, और माइग्रेशन दिशात्मकता सहित । abluminal प्रतिधारण और रिवर्स स्थानांतरगमन के रूप में पोस्ट-स्थानांतरगमन घटनाओं को भी अलग ल्युकोसैट आबादी के लिए जांच की जा सकती है, इस पद्धति का एक विस्तार के रूप में । एक सीमा के खराब होने का पता लगाने के दूर में धुंधला-लाल चैनल में समय चूक इमेजिंग, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रतिदीप्ति संकेतों के कुछ पतन है कि कम z-ढेर संकल्प । यह मुख्य रूप से फोकल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया साधन से संबंधित था । छवि deconvolution का उपयोग अंततः छवि गुणवत्ता में सुधार और ल्युकोसैट भर्ती के विभिंन चरणों के विश्लेषण की अनुमति देने में मदद कर सकता है ।

इष्टतम शर्तों के तहत ल्युकोसैट भर्ती का अध्ययन करने के लिए, यह endothelial सेल monolayer की सक्रियण स्थिति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, endothelial कोशिकाओं की कमी सक्रियण monocyte आसंजन और स्थानांतरगमन में एक वैश्विक कमी की ओर जाता है । Endothelial सेल सक्रियण ICAM1 और VCAM1 जैसे Endothelial सेल सतह पर आसंजन अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण करके जाँच की जा सकती है । इन आसंजन अणुओं के स्तर को उत्तेजित endothelial कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि की जानी चाहिए । यदि इन endothelial आसंजन अणुओं में कोई परिवर्तन detectable नहीं है, तो कल्चर्ड HUVEC को सक्रिय नहीं माना जा सकता है । आसंजन अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन HUVEC के एक ही बैच का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगों के बीच एक अच्छा मात्रात्मक नियंत्रण का गठन कर सकते हैं. हालांकि, इन आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति स्तर भी ICAM1 या VCAM1 की एक वैश्विक दहलीज के विचार को सीमित endothelial कोशिकाओं के विभिन्न प्राथमिक संस्कृति के बीच भिन्न हो सकते हैं. HUVEC जैसे macrovascular endothelial कोशिकाओं के आकार में परिवर्तन भी उनके सक्रियण का एक अच्छा संकेतक है । phenotype में यह उत्तरार्द्ध परिवर्तन HUVEC सक्रियण के एक त्वरित और गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है । हालांकि, आसंजन अणुओं के विश्लेषण microvascular कोशिकाओं है कि प्रमुख आकार नहीं दिखा है के लिए एक बेहतर विकल्प हो सकता है-भड़काऊ साइटोकिंस के साथ सक्रियण पर बदल जाते हैं ।

यंत्रवत अध्ययन के लिए, monocyte स्थानांतरगमन के प्रासंगिक नकारात्मक नियंत्रण जैसे ICAM1 के रूप में endothelial आसंजन अणुओं के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रदर्शन किया जा सकता, VCAM1 या ल्युकोसैट सतह पर जैसे ल्युकोसैट समारोह से जुड़े प्रतिजन (एलएफए)-1. एक प्रासंगिक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग monocytes में ऐसे यंत्रवत अध्ययन के लिए आवश्यक है के रूप में वे अपने सेल पर एफसी रिसेप्टर्स एक्सप्रेस सतहों । अलगाव के बाद monocytes की पवित्रता भी महत्वपूर्ण है, क्रम में अंय ल्युकोसैट आबादी और monocyte स्थानांतरगमन की दर के एक अनुमान के द्वारा संदूषण से बचने के लिए । एक अंय महत्वपूर्ण पैरामीटर तापमान है, जो सभी परख के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट की जरूरत है ताकि सभी प्रयोगात्मक टिप्पणियों को सुनिश्चित करने के लिए प्रासंगिक है और vivo सेल ्े में मानव के अनुसार अनुवाद कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पढ़ने और फीडबैक के लिए डॉ पॉल Bradfield का शुक्रिया अदा करते हैं । ए. एस. सर जूल्स कांटा चैरिटेबल ओवरसीज ट्रस्ट Reg., से वित्तीय सहायता प्राप्त

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ ल्युकोसैट ्े monocyte भर्ती शोथ डीकॉक इमेजिंग फोकल माइक्रोस्कोपी आसंजन स्थानांतरगमन monocyte उपजनसंख्या chemokines integrins आसंजन अणुओं
इन विट्रो में प्रवाह के अंतर्गत Monocyte उपजनसंख्याों की भर्ती का एक साथ अध्ययन
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Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

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