Morfologi-baserade åtskillnad mellan friska och sjukliga celler utnyttja Fourier transformer och självorganiserande kartor

Summary

Här, tillhandahåller vi ett arbetsflöde som möjliggör identifiering av friska och sjukliga celler baserat på deras 3-dimensionell form. Vi beskriver processen för att använda 2D projektion konturer baserat på de 3D-ytorna för att utbilda en självorganiserande karta som kommer att ge objektiva klustring av de undersökta cellpopulationer.

Abstract

Utseende och förehavanden av immunceller drivs av sin omgivning. Som en reaktion på en patogen invasion, immuncellerna rekryteras till platsen för inflammation och aktiveras för att förhindra en ytterligare fördelning av invasionen. Detta avspeglas också av förändringar i beteendet och immuncellerna morfologiska utseende. I cancervävnaden, liknande morphokinetic förändringar har observerats i beteendet hos mikrogliaceller: intra-tumoral mikroglia har mindre komplexa 3-dimensionella figurer, med mindre förgrenade cellulära processer, och flytta snabbare än i friska vävnad. Prövningen av sådana morphokinetic egenskaper kräver komplexa 3D mikroskopi tekniker, som kan vara mycket utmanande när utförat longitudinellt. Registrering av en statisk 3D form i en cell är därför mycket enklare, eftersom detta kräver inte intravital mätningar och kan utföras på exciderad vävnad samt. Men det är viktigt att inneha analysverktyg som gör den snabb och exakt beskrivningen av de 3D-formerna och tillåter diagnostisk klassificering av friska och patogena vävnadsprover baserade enbart på statiska, form-relaterad information. Här presenterar vi en verktygslåda som analyserar de diskreta Fourier komponenterna av konturerna av en uppsättning 2D projektioner av 3D cellen ytbehandlar via självorganiserande kartor. Användning av artificiell intelligens metoder tillåter vårt ramverk att lära sig om olika cell former som den tillämpas på fler och fler vävnadsprover, medan arbetsflödet är enkelt.

Introduction

Snabb, enkel och exakt fastställande av patologiskt status av biologisk vävnad är av högsta intresse inom biomedicinsk forskning. Mus-modeller ger möjlighet att studera en rad sjukdomstillstånd, till exempel immunreaktioner eller cancerutveckling, i kombination med komplexa 3D och 4 D (3 rumsliga dimensioner och tid) mikroskopi tekniker. Mikroskopi studier kan vara utförs via intravital eller exciderad vävnad 2-foton mikroskopi, ljus ark mikroskopi, och - begränsad vävnad djup av cirka 100 µm-av konfokalmikroskopi. Att har tid-relaterad information om cellernas beteende under fysiologiska eller patologiska förhållanden, är det nödvändigt att övervaka vävnaden under en längre tid, vilket oftast kräver intravital imaging^1,2 . Tillämpligheten av denna teknik är naturligtvis begränsad till djurmodeller på grund av dess invasivt. Icke-invasiva tekniker finns också för användning på människor, inklusive en mängd tomografi metoder (MSOT, CT, etc.), men dessa metoder alla saknar nödvändigt rumsliga- och ofta temporal upplösning att studera beteende på cellnivå.

Statisk information om utseendet av celler kan nås enkelt via olika 3D avbildningstekniker avrättades den censurerade vävnadsprover. Här, den kinetiska beteenden av cellerna mäts inte, därför är det nödvändigt att anta nya analysmetoder som kan avgöra patogena status för de undersökta celler baserat enbart på deras morfologi³. Ett sådant tillvägagångssätt användes att länka cell former och vävnad texturer till patologiskt beteende^4,5,6.

I den nya teknik som beskrivs här, cellerna rekonstrueras som 3D-ytor och deras former är karakteriserade via 3D-att-2D prognoser och successiva Fourier-baserade periferi-form analys^7,8. Genom att minska dimensioner från 3 till 2, är problemet förenklad. Det är också möjligt att karaktärisera den cell ytbehandlar i 3D genom att tillämpa sfäriska övertoner analys, som det har gjorts för medicinska bilder⁹. Dock hanterar sfäriska övertoner inte skarpa och robusta former väl, som kräver ett flerskalig rutnät fastställas på området för enheten. Dessutom antalet nödvändiga sfäriska övertoner komponenter kan vara stort (50-70), med underliggande beräkningarna mycket krävande och resultaten svåra att tolka^10,11,12.

Med vår nyligen föreslagna metod förminskas uppgiften till en serie 2D form beskrivningar, där antalet 2D projektionerna är upp till analytikern och kan justeras enligt komplexiteten i 3D formen. Prognoserna genereras automatiskt via ett Python-skript som körs inuti en 3D animation verktyg. 2D prognoserna beskrivs av Diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deras periferi, beräknas av en Fiji¹³ plugin som tillhandahålls här som en del av våra programpaket. DFT används här för att bryta ner komplexa konturerna av cellen till en serie av synd och cos funktioner. På detta sätt kan vi beskriva konturerna med ett relativt litet antal DFT komponenter, vilket minskar komplexiteten av problemet (för ytterligare detaljer se ekvationer avsnitt). DFT komponenter sätts i en utbildad självorganiserande karta (SOM¹⁴), där förekomsten av formen kluster kan vara objektivt testade⁸. SOMs ge ett konkurrenskraftigt och oövervakade läromedel från fältet av artificiell intelligens. De består av en länkad rad konstgjorda nervceller som kommunicerar med varandra via en vägda stadsdelen avstånd funktion. Neuronala systemet svarar på det första elementet i den ingående datamängden och nervceller vars svar är den starkaste ”grupperas” närmare varandra. Som neurala systemet tar emot mer ingång, börja data nervceller som upprepade gånger reagerar starkt bilda väldefinierade kluster inom systemet. Efter lämplig träning på en stor datamängd som innehåller 2D form i form av en uppsättning DFT komponenter, alla enskilda cellens DFT komponenter kan sättas i utbildad SOM och avslöja huruvida cellen sannolikt hör till de friska eller gruppen patogena cell. Vi förväntar oss sådant verktyg att bli ett bra komplement till metoderna för vetenskaplig och klinisk diagnostik.

Protocol

1. protokollet krav

1. Hämta högupplösta deconvolved tredimensionella (3D) mikroskopi data deconvolved i enlighet med Nyquistkriteriet med en provtagningsintervall minst två gånger den högsta spatial frekvensen av preparatet till få en högupplöst bild.
2. Använda 3D-program för surface återuppbyggnad och export.
3. Använda 3D animation programvara kan köra Python skript (Pythonskriptet kan laddas ner från github databasen: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) att skapa 2D projektioner.
4. Använda Fiji¹³ att analysera 2D prognoser och extrahera DFT komponenterna.
   1. Använd den aktuella Fiji-fördelningen. Om det redan finns en installerad version av Fiji, kontrollera att den installerade versionen är senast. Detta enkelt kan uppnås genom att köra Hjälp | Uppdateringsalternativ.
   2. Använda Active Contour plugin¹⁵, som kan laddas ner från http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start och bör kopieras till mappen plugins.
   3. Hämta skugga Fiji plugin från github arkivet och kopiera till mappen plugins.
5. Använda Beräkningsmatematik programvara kan beräkna självorganiserande kartor.

2. rekonstruera 3D-bilden.

Observera: För teständamål, finns ett exempel datamängden i github databasen (se ovan).

1. Starta programvaran 3D rekonstruktion och öppna 3D bilddata.
2. Skapa en 3D-yta av (alla) objekt.
   1. Välj alternativet 3D-vyn och klicka på ytor. Klicka på knappen Nästa (blå cirkel med en vit triangel) för att fortsätta med guiden yta.
   2. Välj bild kanal för surface återuppbyggnaden.
   3. Applicera en utjämnande funktion för att undvika porösa ytor.
      1. Välja ett utslätande värde som döljer inte detaljerna i ytan men undviker porösa ytor.
   4. Välj ett tröskelvärde metod att hitta ytorna.
      1. Använda en absolut intensitet tröskelvärde när objekten är väl avskilt från bakgrunden och har ett ungefärligt enhetliga ljusstyrkan.
      2. Tillämpa ett tröskelvärde för lokal kontrast när objekten varierar i intensitet men kan fortfarande vara åtskilda från lokala bakgrunden och från andra föremål omger dem. Ange lokala tröskelområdet Sök enligt värdet av de rekonstruerade objekt beräknade diameter.
   5. Filtrera de rekonstruerade ytorna enligt morfologiska parametrar av intresse, t.ex., volym, sfärisk, baserat på ytan till volym, etc., och avsluta ytan återuppbyggnaden.
3. Spara och exportera genererade ytor i ett format som är kompatibelt med 3D animation programvara som kommer att användas i nästa steg.

3. omvandla 3D rekonstruerade ytor till 2D prognoser

1. Starta mixern och gå till fliken utmatning i det högra fönstret. Välj TIFF-format i rullgardinsmenyn och ange färgdjup till 8 bitars RGBA.
2. Växla in Scripting-läget och öppna den medföljande skriptfilen ”GUI_AutoRotate.py” från databasen med detta arbete (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
3. Klicka på Kör skript. Välj mappen wrl filer när du uppmanas ange indata.
4. Om det behövs, skapa fler rotationer när du arbetar med mer komplexa ytor: gå till GUI och ange i rutan rotationer till ett värde över 6.
   Obs: En rotation av 6 olika vinklar kan vara tillräcklig för att skilja de olika cellpopulationer. Det är inte rekommenderat att skapa mindre än sex rotationer per yta, på grund av potentiell förlust av information.
5. Kör skriptet genom att klicka på knappen Rotera i GUI. Spara projektionerna av de enskilda ytorna i samma mapp som användes som mappen input (steg 2.3). Som standard sparas bilderna i en 8-bitars Tiff-format (se steg 2.1), vilket är det format som krävs av Fiji plugin skugga.

4. hitta periferin och beräkna de Fourier komponenter med Fiji.

1. Öppna Fiji och välj nyans i Plugins-menyn. Börja med standardvärdena och finjustera parametrar senare. Klicka på OK när du är redo att köra programmet.
   1. Välja en Gradient tröskelvärde för tröskelvärde hos indatabilden.
   2. Välj antalet iterationer. Ju högre nummer av Iterationsvärdet, den mer exakt återuppbyggnaden av periferin. För enklare former räcker oftast en lägre siffra.
   3. Använd parametern Antal av utspädningar för att avgöra hur mycket större börjar masken är jämfört med den faktiska cellen. Mer komplexa former behöver vanligtvis mer dilatation steg för att hitta rätt periferi.
   4. Kryssrutan Mörk bakgrund om de planerade formerna är ljusare än bakgrunden.
   5. Aktivera Visa mellanliggande resultat kryssrutan bara när du använder en litet test datamängd för att bestämma utförandet av skugga. Aktivera det här alternativet för större datamängder sänker computational effektivitet och möjligen kunde stoppa ett system med låga grafikminne.
   6. Kryssrutan Spara Resultattabeller för att använda resultaten av nyans som indata för steg 5. Om rutan är markerad sparas alla resultat i enskilda CSV-filer. En sammanfattning av utdata genereras alltid i en fil som heter ”Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv”.
2. Välj mappen indata som innehåller de TIFF-filer som skapades i steg 3.
3. Ge mappen utgående data.
4. Klicka på OK starta plugin.

5. självorganiserande kartor

Obs: SOM nätverk är bara kunna klassificera data när de är utbildade på en stor datamängd som innehåller input från alla förväntade celltyper och villkor. I demonstrationssyfte, sådan en datamängd finns och kan hittas i vår databas (”AllCells_summary_normalised.csv” från https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

1. Följ dessa riktlinjer om det finns ingen utbildad SOM ännu för indata; Gå annars vidare till steg 5.2.
   1. Starta en computational matematisk programvara kan utföra neurala nätverk klassificeringar.
   2. Välj en datafil som ska användas för utbildning SOM nätverket. Den här datamängden bör innehålla alla experimentella betingelser för att träna SOM på de specifika celltyper och experimentella förhållanden.
      Obs: Det är också möjligt att använda den medföljande AllCells_summary_normalised.csv för att testa systemet.
   3. Starta utbildningen och vänta tills utbildningen är klar innan du fortsätter. Som standard ligger skriptet att köra 2000 iterationer (”epoker”).
      Anmärkning: Antalet iterationer beror på den lärande skattesatsen för SOM. Beroende på indata är det lämpligt att testa både högre och lägre antal epoker och observera stabiliteten i mönstret för SOM. När du använder skriptet som tillhandahålls, kan antalet iterationer ändras under linje 32. Nätverk storleken kan ändras i linje 34 (som standard det är satt till 12 av 12).
   4. När utbildningen är klar, granska nätverkets topologi (granne avstånd, ingående plan, prov hits, etc.). Nätverket är nu utbildad och kan sparas för framtida bruk.
2. Ladda som, när du använder en redan utbildad karta (detta kan komma antingen från steg 5.1 eller från andra källor) för att klustra en datamängd.
   1. Importera csv-filen som skall provas med den förinstallerade utbildade SOM. Välj CSV-resultatet av skugga Plugin från steg 4 när du använder data som utarbetats av skugga plugin.
      Obs: Det är också möjligt att använda exempel datafilerna ”InteractingCells_summary_normalised.csv”, ”MobileCells_summary_normalised.csv” eller ”PhagocytosingCells_summary_normalised.csv” som tillhandahålls via github.
   2. Efter klassificeringen är färdig, utvärdera resultaten av SOM som i steg 5.1.5.
      1. Undersöka den hitmap som genereras från CSV-filen. Varje cell av kartan visar hur många gånger datamängden ”träffar” särskilt cellen av de utbildade SOM. När en grupp av celler är grupperade i ett litet område av denna karta, indikerar detta att datamängden är ganska homogen. Flera kluster kommer att indikera att undergrupper sannolikt finns i datamängden.
      2. Undersöka de stadsdel vikt avstånd. Områden av denna karta som är väl avgränsade motsvarar grupper av objekt som beter sig mycket annorlunda från den Soms synvinkel. Med DFT komponenter som indata innebär detta att dessa cellgrupper har mycket olika former av de motsvarande 3D-ytorna.
      3. Undersöka de vikt plan för information om bidrag genom varje element av funktionen vector. Vid användning 20 DFT komponenter som tidigare beskrivits, kommer att 19 kartor visas här. När du använder medföljande exempel datamängden, de första 5 eller 6 vikt plan kommer att vara annorlunda, men resten av dem visas ganska liknande. Det kan i detta fall konstateras att det skulle vara nog att använda cirka 7 DFT komponenter.

Representative Results

Vi tillämpat en DFT för att beräkna de viktigaste komponenterna i den form som motsvarande cell prognoserna. Fourier beskrivare erhölls genom att tillämpa DFT algoritmen xy-koordinat parar av monterade peripheryen av cell prognoserna, erhålls under produktionen av den AbSnake delen av vårt arbetsflöde. Dessa xycoordinate par kan hanteras som en komplex enkelvärdesattribut 2D-vektor ”g”:

Från vector ”g” använder vi DFT för att beräkna komplexa enkelvärdesattribut Fourier spektrumet:

Baserad på välkända formler av Diskret Fourier spektrumet, som använder komplexa-tal märkning av ”g” som:

Vi får:
(1)
Vi kan beräkna den verkliga (”A”) och imaginära (”B”) komponenter i :
(2)
(3)
Här, den första DFT komponent G₀ motsvarar m = 0, vilket ger:
(4)
(5)
Därför beskrivs denna komponent geometriska mittpunkt det ursprungliga objektet.
Det andra elementet i DFT framåt spektrumet, G₁, motsvarar m = 1:

(6)

Från Eq.6 drar vi slutsatsen att dessa punkter bildar en cirkel med en radie av och start vinkel , där cirkeln beskriver ett varv medan formen spåras en gång. Mitten av cirkeln ligger på beskärningen (0, 0), radien är | G₁| och utgångspunkten är:

(7)

I allmänhet för en enda Fourier-koefficient , koordinaterna beskrivs som:

(8)

Likaså att Eq.6, Eq.8 också beskriver en cirkel, men med en radie av R_m= | G_m|, en start vinkel och en utgångspunkt vid , där konturen är spåras en gång medan cirkeln går genom ”m” full banor^16,17.

Form parametrar som SOM indata
Arbetsflödet, som beskrivs i figur 1, tillämpades på en deconvolved (med en uppmätt punkt sprida funktion) intravital flera foton mikroskopi dataset av mikrogliaceller att karakterisera deras morfologiska förändringar i friska eller cancerogena kortikala vävnaden¹⁸. Tjugo DFT komponenter beräknades för varje 2D projektionen av de rekonstruerade 3D-ytorna och resultaten användes som indata för SOM utbildning. Under fysiologiska betingelser, mikroglia presenteras en ganska komplex form med flera, mycket Grenade processer (figur 2a). När den placeras i en cancergen miljö (kortikal tumör modell), den mikroglia ändras till en enklare, mer spindel-liknande form (figur 2b).

Utbildad SOM testades för att utvärdera dess förmåga att skilja mellan friska och cancerogena celler. Frisk cell befolkningen projicerades på ett enda område av SOM (figur 2 c). SOM svarat på cancerogena mikroglia datamängden med en hantel-formade aktiva region (figur 2d). Ett blint blandade input data set som bestod av DFT form komponenter från både friska och gruppen cancerogena projekterades av SOM i två distinkta grupper, samtidigt hålla formen på deras individuella konturer liknar dem separerade grupper ( Figur 2e; (jämför med 2 c och 2d). Det kan konstateras att blandade datamängden framgångsrikt var grupperade efter SOM.

Vi testade SOM prestanda genom att jämföra sina prognoser med manuell analys av samma data av en medicinsk expert, som klassificeras datamängden baserat på deras plats och tid beteende. Handledaren identifierade fyra distinkta cellgrupper (vilande celler, phagocytosing celler, samverkande celler och mobila celler¹⁸), som rekonstrueras och används för att utbilda en 12 x 12 SOM. Det utbildade nätverket (figur 3a) visar grupper av hög träff-värde artificiella neuroner, särskilt i den nedre vänstra och de mellersta delarna av SOM. Svaret från det utbildade nätverket testades också med fyra slumpmässigt utvalda grupper (som inte var en del av den utbildning datamängden) av bilder från de fyra olika grupperna identifieras av expert¹⁸. Dessa bild delmängder resulterade i fyra väldefinierade svar av SOM, som visas i figur 3b. De vilande cellerna uppvisar den mest komplexa formen och visade högsta separation inom neurala nätverk (figur 3b ”vilar” panel). De andra tre identifiera celltyper delade ett gemensamt område för SOM i det nedre vänstra hörnet, men var annars åtskilda av SOM. Längst ned till vänster SOM området motsvarar således lägre-index DFT värdena.

Robustheten av metoden SOM testades med hjälp av utbildad SOM med tre random delmängder av detsamma - vilar - cell typ (inte en del av den utbildning datamängden). SOM svar på denna ingång uppvisar en mycket liknande respons (figur 3 c, grupper 1-3), visar robustheten av vår strategi.

Tidsberoende cell formförändringar kännetecknas just av DFT
För att undersöka effekten av tidsberoende förändringar av formen cell på DFT komponenter, spårades en till tre celler per undergrupp (se figur 3b) för 13 till 28 tidpunkter. Figur 4 visar de första tio DFT komponenter av en rörlig cell (figur 4a) och en samverkande cellen (figur 4b), som var ritas som en funktion av tiden. Den mobila cellen uppvisar en permanent ändra form (se kompletterande Video 4 ⁸), vilket återspeglas av grövre DFT ovansida. Utbrott av DFT amplituden i den första tredjedelen av tidsförloppet för samverkande cellen sammanfaller med de snabba och stora cell formförändringar som visas i kompletterande Video 5 i ⁸.

Tidsförloppet för alla 19 DFT komponenter präglades också för dessa två celler vid tre olika tidpunkter under spårningen av en rörlig cell (figur 5a) och en samverkande cellen (Figur 5b). De vinkelräta axlarna representerar härmed sex rotation vinklarna och ange att alla prognoser är lika viktiga för karakterisering av formen för båda celltyper.

Figur 1. Steg för steg arbetsflödet av databehandlingen att identifiera cell kluster baserat på formen på celler. Ytor som rekonstrueras i 3D användes som indata till Blender för automatiserad 3D-att-2D projektioner. Peripheryen av varje projektion lokaliserades och DFT komponenter beräknades. Komponenterna serveras som indata antingen till en utbildad SOM i Matlab, eller att utbilda en ny SOM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Typiska utseende av mus kortikala mikroglia celler kontroll villkor (a) och i cancervävnaden (b) skärmdumpar av rekonstruerade mikroglia ytor. SOM prognoserna skapades från de tre grupperna av mikroglia prover från mus cortex: styra (icke-maligna) celler (c), tumörceller (d) och en blandad population av celler (e). Denna siffra har modifierats med tillstånd⁸. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. (en, vänster) Självorganiserande karta över en mus mikroglia dataset bestående av 768 ingående funktionen vektorer. Datamängden användes att träna en 12 x 12 artificiella neurala nätverk, använda sexkantiga stadsdelen geometri, slumpmässiga initiering och 2000 epoker. (en, höger) Motsvarande SOM ingång plan av de första 10 DFT komponenterna (b) svaren från SOM skildras i a, till en slumpmässig VRML fil delmängd varje från de fyra celltyper ”mobil”, ”interagera med”, ”vila” och ”fagocytos” som första beskrivs i figur 5 i Bayerl o.a. ¹⁸. (c) i svaret av den samma SOM i (a, vänster) till tre slumpmässiga delmängder av hela datamängden (som således inte ingick i utbildning datamängden) av de ”vilande cellerna”-typ 3D-ytor. Likheten mellan de tre svar är anmärkningsvärda. Denna siffra har modifierats med tillstånd⁸. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. (a) tid beroende av de första 10 DFT-komponenterna under en intravital imaging experiment av mus mikroglia. I denna panel visas data för en cell av typen ”Mobile celler”. X-axeln motsvarar tidpunkter av experiment på 60 s tidsupplösning, y-axeln visar amplituden av DFT komponenterna i godtyckliga enheter (a.u.), medan z-axeln motsvarar den DFT-komponenten från 1 till 10. (b) som i a men för en cell ”interagera celler” Skriv. Denna siffra har modifierats med tillstånd⁸. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. (a) beteendet hos alla 19 DFT komponenter i en cell av typen ”Mobile celler” i början, mitten och slutet av experimentet. Numren på x-axeln motsvarar DFT komponent-ID från 1 till 19. Y-axeln visar DFT komponent amplituden i godtyckliga enheter (a.u.), medan z-axeln markerar sex slumpmässig rotation vinklarna. (b) samma som a men för en cell ”interagera celler” skriver. Denna siffra har modifierats med tillstånd⁸. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Identifiering av potentiellt sjukdomstillstånd med hjälp av små, intakt vävnadsprover är av hög betydelse. Sådana metoder kommer att garantera ett snabbt svar på infektionssjukdomar och aggressiva typer av cancer. Kinetiska och morfologiska Svaren olika immunceller, t.ex. mikroglia och makrofager, är karakteristiska för immunförsvaret av kroppen. Även i de flesta fall inte är det praktiskt eller ens möjligt att övervaka dessa celler kinetiska beteende, är det ganska enkelt att förvärva 3-dimensionella bilder för att hämta sin form. Typiskt, immunceller anta en komplex form i frisk vävnad och en enklare form under inflammerad eller cancerogena förhållanden¹⁸. Medan sådana formförändringen tidsberoende egenskaper skulle lägga till vår förståelse av utvecklingen av immunförsvaret, kan använder bara 3D formen av en representativ grupp av celler också vara tillräcklig för att bestämma den friska eller patologiska naturen av vävnad.

Kännetecknar en cell 3-dimensionell yta är inte en enkel uppgift. Tillämpningen av sfäriska övertoner är ett sätt att representera en 3D-yta med ett relativt stort antal (50-70) komponenter^11,12. Att bestämma den sfäriska övertoner är dessutom beräkningsmässigt kostsamt. projicera mycket komplexa former på området för enheten är omöjligt eller mycket svårt på grund av behovet av att tillämpa flera nät av olika finhet på området för enheten. Slutligen, meningsfulla tolkningen av spektra av sfäriska övertoner komponenter är långtifrån trivial.

I vårt arbete som presenteras här, ersätter vi den svåra uppgiften att direkt 3D ytanalys med den mycket enklare metoden att använda 2D projektioner av den ursprungliga ytan för att få tillräcklig morfologisk information för att identifiera patologiska förhållanden. Vi visade varje steg i arbetsflödet med hjälp av 3D mikroskopi data från myeloida celler, medan tydligt påpeka att alla steg var enkla att slutföra och de resulterande 2-dimensionella kartorna var lätta att tolka.

Naturligtvis, en 3D-att-2D-projektion kommer att leda till förlust av information om strukturen på ytan. I vårt exempel dataset av mikroglia i en musmodell kortikala tumör var det nog att använda sex vinklar när du skapar 2D prognoserna. Mer komplexa former eller mindre framträdande morfologiska förändringar kan dock kräva att ett större antal projektioner är skapade för att kunna tillförlitligt identifiera cell undergrupper med SOM. Av denna anledning, är vår metod utformad för att kunna generera och analysera valfritt antal projektioner. Bara genom att välja ett högre antal projektioner för mer komplexa former, är det möjligt att skala förlusten av information till en acceptabel minimum. Som ett exempel, skulle den samverkande Celltypen i figur 4a och 4b kräva ett större antal projektioner för att representera komplexa ytan ordentligt.

Som någon ungefärlig metod hade härmed föreslagna arbetsflödet ska testas mot resultaten av en manuell klassificeringsprocessen av mikroglia¹⁸. De resultat som presenteras tidigare bekräftade tillförlitligheten i den automatiserat arbetsflöden. Arbetsflödet är dessutom mer tidseffektivt jämfört med konventionella analys. Den medicinska expert som klassificeras mikroglia celler manuellt behövs cirka 4 veckor för hans analys av datamängden, medan vårt arbetsflöde behövs endast cirka 1 dag. Robustheten av vårt tillvägagångssätt bevisades också tydligt av reproducerbarheten för utbildade SOM till en delmängd av data som hörde till samma celltyp men användes inte att träna SOM, som visas i figur 3 c.

Trots att vår inställning inte ansåg kinetiska information, undersökte vi effekten av timing på DFT-baserade form analys. Det mest typiska exemplet för tidsberoende beteende hittades bland mobila cell befolkningen, där bidraget från högre indexerade DFT komponenter var tydligt observerbara, som i figur 4a. Detta kräver uppmärksamhet på vikten av att utnyttja ett tillräckligt högt antal DFT komponenter när man arbetar med celltyper som sannolikt kommer att uppträda på ett sätt som mycket tidsberoende. Tack vare automatiserade natur och hög exekveringshastighet av våra verktyg, kommer att det ökade antalet DFT komponenter och prognoser öka noggrannheten och tillförlitligheten av resultaten, medan de påtagligt inte kommer att hindra den computational prestandan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaris 9.1.2, software	Bitplane, Zürich, Switzerland	v.9.1.2	3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software	https://www.blender.org/	v.2.75a	3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software	https://fiji.sc/	ImageJ v.1.52b	Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE	https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis	v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour	http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start	absnake2
Computer	Any	NA	See Imaris instructions for minimum computer requirements