Morfologi-baserede skelnen mellem sund og patologiske celler udnytte Fourier transformeringer og selvorganiserende kort

Summary

Her, leverer vi en arbejdsproces, der tillader identifikation af sunde og patologiske celler baseret på deres 3-dimensionelle form. Vi beskriver processen med at bruge 2D projektion konturer baseret på 3D overflader til at træne en selvorganiserende kort, der vil give objektive klynger af de undersøgte cellepopulationer.

Abstract

Udseendet og bevægelser af immunceller er drevet af deres miljø. Som en reaktion på en patogen invasion, immunceller rekrutteres til stedet for betændelse og aktiveres for at forhindre en yderligere spredning af invasionen. Dette afspejles også af ændringer i adfærd og morfologiske udseendet af immunceller. I cancervævet, observeret lignende morphokinetic ændringer i opførsel af microglial celler: samhandel tumorsygdomme mikroglia har mindre komplekse 3-dimensionelle figurer, at have mindre-forgrenede cellulære processer, og bevæge sig hurtigere end i sund væv. Undersøgelse af sådanne morphokinetic egenskaber kræver komplekse 3D mikroskopi-teknikker, som kan være ekstremt udfordrende, når henrettet på langs. Derfor, registrering af en statisk 3D figur af en celle er meget enklere, fordi dette kræver ikke intravital målinger og kan udføres på skåret væv så godt. Men det er vigtigt at besidde analyseværktøjer, der giver mulighed for hurtig og præcis beskrivelse af 3D-figurer og tillader diagnostiske klassificering af sunde og patogene vævsprøver baseret udelukkende på statisk, figur-relaterede oplysninger. Vi præsenterer her, en værktøjskasse, der analyserer de diskrete Fourier komponenter af omridset af et sæt af 2D fremskrivninger af 3D celle overflader via selvorganiserende Maps. Anvendelsen af kunstig intelligens metoder tillader vores rammer til at lære om forskellige celle figurer som det anvendes til flere og flere vævsprøver, mens arbejdsprocessen er enkel.

Introduction

Rettidig, enkel og præcis bestemmelse af patologiske status af biologisk væv er den højeste interesse for biomedicinsk forskning. Musemodeller giver mulighed for at studere en række patologiske tilstande, såsom immun reaktioner eller udviklingen af kræft, i kombination med komplekse 3D og 4 D (3 rumlige dimensioner og tid) mikroskopi-teknikker. Mikroskopi undersøgelser kan udføres via intravital eller skåret ud væv 2-foton mikroskopi, lys-ark mikroskopi, og - at en begrænset væv dybde af omtrent 100 µm-af Konfokal mikroskopi. For at have tidsrelaterede oplysninger om celler opførsel under fysiologiske eller patologiske betingelser, er det nødvendigt at overvåge væv for en længere periode, som normalt kræver intravital billeddannelse^1,2 . Anvendeligheden af denne teknik er naturligvis begrænset til dyremodeller på grund af dens invasionsevne. Ikke-invasive teknikker er også tilgængelige til anvendelse på mennesker, herunder en række tomografi metoder (MSOT, CT, osv.), men disse metoder alle mangler de nødvendige rumlige- og ofte tidsmæssige opløsning til at studere adfærd på cellulært niveau.

Statiske oplysninger om forekomsten af celler kan være tilgængelige lettere via forskellige 3D imaging teknikker henrettet på skåret ud vævsprøver. Her, kinetic opførsel af cellerne er ikke målt, derfor er det nødvendigt at vedtage nye analyseteknikker, der er i stand til at bestemme den patogene status af de undersøgte celler baseret udelukkende på deres morfologi³. En sådan fremgangsmåde blev brugt til at knytte celle figurer og væv teksturer til patologisk adfærd^4,5,6.

I den nye teknik beskrevet her, cellerne er rekonstrueret som 3D overflader og deres figurer er karakteriseret via 3D til 2D fremskrivninger og successive Fourier-baserede periferien-figur analyse^7,8. Ved at reducere dimensioner fra 3 til 2, er problemet forenklet. Det er også muligt at karakterisere celle overflader i 3D ved at anvende sfærisk harmoniske analyse, som det er blevet gjort til medicinske billeder⁹. Dog kan sfærisk harmoniske ikke håndtere skarpe og robust figurer godt, der kræver et multi-skala gitter til at blive etableret på enhed sfære. Desuden antallet af nødvendige sfærisk harmoniske komponenter kan blive store (50-70), med de underliggende beregninger meget krævende og svært at fortolke^10,11,12resultater.

Med vores nyligt foreslåede metode, er opgaven reduceret til en serie af 2D figur beskrivelser, hvor antallet af de 2D fremskrivninger er op til analytikeren og kan reguleres efter kompleksiteten af den 3D form. Fremskrivningerne genereres automatisk via et Python-script, der kører inde i en 3D-animation værktøj. De 2D fremskrivninger er beskrevet af de Diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deres periferi, beregnet ved et Fiji¹³ plugin, der er fastsat her som en del af vores softwarepakke. DFT anvendes her for at nedbryde komplekse omridset af cellen til en serie af synd og cos funktioner. På denne måde, kan vi beskrive kontur med et relativt lille antal DFT komponenter, hvilket reducerer kompleksiteten af problemet (for yderligere oplysninger se ligninger afsnit). DFT komponenter er sat i en uddannet selvorganiserende kort (SOM¹⁴), hvor eksistensen af figur klynger kan være objektivt testet⁸. SOMs yde en konkurrencedygtig og ukontrollerede læringsredskab fra inden for kunstig intelligens. De består af en sammenkædet række kunstige neuroner, som kommunikerer med hinanden via en vægtet kvarter afstand funktion. Neuronal systemet reagerer på det første element i input datasættet og neuroner hvis svar er den stærkeste er "sammenbygget" tættere på hinanden. Som de neurale system modtager flere og flere input, begynde data neuroner, der gentagne gange reagerer kraftigt at danne veldefinerede klynge inden for systemet. Efter passende uddannelse på et stort datasæt, der indeholder 2D form oplysninger i form af et sæt DFT komponenter, en individuel celle DFT komponenter kan sættes i den uddannet SOM og afsløre, om cellen sandsynligt tilhører den sunde eller gruppen patogene celle. Vi forventer sådan værktøj til at blive en fantastisk tilføjelse til metoderne af videnskabelige og kliniske diagnosticering.

Protocol

1. protokol krav

1. Få høj opløsning deconvolved tre-dimensionelle (3D) mikroskopi data deconvolved i overensstemmelse med kriteriet Nyquist med en prøveudtagning interval mindst to gange den højeste rumlige frekvens af modellen til at opnå en høj opløsning billede.
2. Bruge 3D rendering software til overflade genopbygning og eksport.
3. Bruge 3D-animation software kan køre Python scripts (Python script kan downloades fra github opbevaringssted: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) at skabe 2D fremskrivninger.
4. Bruge Fiji¹³ at analysere 2D fremskrivninger og udtrække DFT komponenter.
   1. Brug den aktuelle Fiji distribution. Hvis der allerede findes en installeret version af Fiji, Sørg for, at den installerede version er senest. Dette kan opnås nemt ved at køre den Hjælp | Opdateringsindstillingen.
   2. Bruge den aktive Contour plugin¹⁵, som kan downloades fra http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start og skal kopieres til mappen plugins.
   3. Download skygge Fiji plugin fra github opbevaringssted og kopier til plugins mappe.
5. Bruge beregningsmæssige matematik software i stand til at beregne selvorganiserende Maps.

2. rekonstruere 3D-billede.

Bemærk: Til testformål, tilbydes et eksempel datasæt i github opbevaringssted (se ovenfor).

1. Start 3D rekonstruktion softwaren og åbne 3D billeddataene.
2. Oprette en 3D-overflade i (alle) objekt(er).
   1. Vælg indstillingen 3D-visning , og klik på overflader. Klik på knappen næste (blå cirkel med en hvid trekant) for at fortsætte med guiden overflade skabelse.
   2. Vælg billede kanal til overflade genopbygningen.
   3. Anvende en udjævning funktion for at undgå porøse overflader.
      1. Vælg en udjævning værdi, der ikke skjuler detaljerne i overfladen, men undgår porøse overflader.
   4. Vælg en tærskel metode til at finde overfladerne.
      1. Bruge en absolut intensitet tærskel, når objekterne er godt adskilt fra baggrunden og har en ca ensartet lysstyrkeniveau.
      2. Anvende en lokal kontrast tærskel, når objekterne varierer i deres intensitet men kan stadig være adskilt fra den lokale baggrund og de andre objekter, der omgiver dem. Indstille søgeområdet lokale tærskel ud fra værdien af det forventede diameter af de rekonstruerede objekter.
   5. Filtrere de rekonstruerede overflader efter morfologiske parametre af interesse, fx bind, kugleform, overflade-til-volumen forhold, osv., og finish overflade genopbygningen.
3. Gemme og eksportere de genererede overflader i et format, der er kompatible med de 3D-animation software, der skal bruges i næste trin.

3. Omdan 3D rekonstrueret overflader i 2D fremskrivninger

1. Start Blender og gå til fanen output i den højre rude. Vælg TIFF-format fra dropdown menuen og Indstil farvedybde til 8 bit RGBA.
2. Skifte til Scripting tilstand og åbne den angivne scriptfil "GUI_AutoRotate.py" fra lageret leveres med dette arbejde (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
3. Klik på Kør Script. Vælg mappen wrl filer når du bliver bedt om input.
4. Hvis det er nødvendigt, oprette flere rotationer, når du arbejder med mere komplekse overflader: gå til GUI og sæt boksen rotationer til en værdi på over 6.
   Bemærk: En rotation af 6 forskellige vinkler kan være tilstrækkelige til at skelne de forskellige cellepopulationer. Det anbefales ikke at skabe mindre end seks rotationer pr. overflade, på grund af potentielle information tab.
5. Kør scriptet ved at klikke på knappen Roter i GUI. Gemme fremskrivninger af de enkelte flader i den samme mappe, der blev brugt som mappen input (trin 2.3). Billederne gemmes som standard i en 8 bit Tiff-format (Se trin 2.1), som er det format, der kræves af Fiji plugin skygge.

4. find periferien og beregne Fourier komponenter ved hjælp af Fiji.

1. Åbn Fiji og vælg skygge i menuen Plugins. Start med standardværdierne og finjustere parametrene senere. Klik på OK når du er klar til at køre programmet.
   1. Vælge en Gradient tærskelværdi for tærskel for input-billedets.
   2. Vælg det antal gentagelser. Jo højere Antallet af gentagelser værdi, den mere præcise genopbygningen af periferien. For enklere figurer er en lavere antallet normalt tilstrækkelig.
   3. Brug parameteren Antallet af Dilations til at afgøre, hvor meget større start masken er i forhold til den aktuelle celle. Normalt behøver mere komplekse figurer mere dilatation trin for ordentlig periferien konstatering.
   4. Indskrive den Mørke baggrund checkhæfte, hvis de forventede figurer er lysere end baggrunden.
   5. Aktivere Vis mellemliggende resultater afkrydsningsfeltet kun når du bruger en lille test datasæt til at bestemme effektiviteten af skygge. Aktivering af denne indstilling for større datasæt sænker den beregningsmæssige effektivitet og eventuelt kunne standse et system med for lidt videohukommelse.
   6. Afkrydsningsfelt Gemme resultatet tabeller for at bruge resultaterne af skygge som input til trin 5. Hvis feltet er markeret, gemmes alle resultater i enkelte CSV-filer. Et resumé af output genereres altid i en fil kaldet "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
2. Vælg mappen input-data, der indeholder de TIFF-filer, der blev oprettet i trin 3.
3. Give output datamappe.
4. Klik på OK for at starte plugin.

5. selvorganiserende Maps

Bemærk: SOM netværk kan kun at klassificere data, når de er uddannet på et stort datasæt, der indeholder input fra alle forventede celletyper og betingelser. Til demonstrationsformål, sådant et datasæt er fastsat og kan findes i vores repository ("AllCells_summary_normalised.csv" fra https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

1. Følg disse retningslinjer, hvis der findes ingen uddannede SOM endnu for inputdata; ellers gå videre til trin 5.2.
   1. Starte en beregningsmæssige matematisk software i stand til at udføre neurale netværk klassifikationer.
   2. Vælg en datafil skal anvendes til uddannelse SOM netværk. Dette datasæt indeholder alle forsøgsbetingelser for at træne SOM på de bestemte celletyper og forsøgsbetingelser.
      Bemærk: Det er også muligt at bruge den medfølgende AllCells_summary_normalised.csv til at teste systemet.
   3. Start træningen og vent indtil uddannelsen er afsluttet, før du fortsætter. Scriptet er som standard indstillet til at køre 2000 gentagelser ("epoker").
      Bemærk: Antallet af gentagelser afhænger af læring satsen af SOM. Afhængigt af input-data er det tilrådeligt at teste både højere og lavere antal epoker og observere stabiliteten af mønstret af SOM. Når du bruger scriptet leveres, kan antallet af gentagelser ændres under linje 32. Netværk størrelse kan ændres i linje 34 (som standard er indstillet til 12 af 12).
   4. Når uddannelsen er afsluttet, undersøge netværkstopologi (nabo afstande, input fly, prøve hits, osv.). Netværket er nu uddannet og kan gemmes til fremtidig brug.
2. Indlæse i SOM, når du bruger en allerede uddannede kort (dette kan komme fra trin 5.1 eller fra andre kilder) for at klynge et datasæt.
   1. Importere CSV-filen, der skal testes med det forudindlæste uddannet SOM. Vælg CSV-output af skygge Plugin fra trin 4, når du bruger data udarbejdet af skygge plugin.
      Bemærk: Det er også muligt at bruge eksempel datafiler "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" eller "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv", der leveres via github.
   2. Efter klassificering er færdig, evaluere resultaterne af SOM som i trin 5.1.5.
      1. Undersøge en hitmap, genereret fra CSV-filen. Hver celle i kortet viser hvor mange gange datasættet "hits" bestemt cellen af de uddannede SOM. Når en gruppe af celler er grupperet i et lille område af dette kort, angiver dette, at datasættet er forholdsvis homogen. Flere klynger vil indikere, at undergrupper sandsynligvis findes i datasættet.
      2. Undersøge kvarter vægt afstande. Områder af dette kort, der er godt adskilt svarer til grupper af objekter, der opfører sig meget anderledes end den SOM synspunkt. Med DFT komponenter som input-data betyder det, at disse celle grupper har meget ulige figurer af de tilsvarende 3D overflader.
      3. Undersøge vægt fly oplysninger om bidrag af hvert element af vektoren, funktion. Ved hjælp af de 20 DFT komponenter, som beskrevet tidligere, 19 kort vil blive vist her. Når du bruger den medfølgende eksempel datasæt, de første 5 eller 6 vægt fly vil være forskellige, men resten af dem vises nogenlunde ens. I dette tilfælde kan det konkluderes, at det ville være nok til at bruge ca 7 DFT komponenter.

Representative Results

Vi anvendte en DFT for at beregne de vigtigste komponenter i figuren svarer til celle fremskrivninger. Fourier deskriptorer blev opnået ved at anvende DFT algoritme til xy-koordinaten par monteret periferien af celle fremskrivninger, fremstillet som output af AbSnake del af vores workflow. Disse xycoordinate par kan håndteres som en kompleks-værdsat 2D vektor "g":

Fra vektor "g" bruger vi DFT til at beregne komplekse-værdsat Fourier spektrum:

Baseret på velkendte formler af diskret Fourier spektrum, og ved hjælp af komplekse tal mærkning af "g" som:

Vi får:
(1)
Vi kan beregne de reelle ("A") og imaginære ("B") komponenter i :
(2)
(3)
Her, den første DFT komponent G₀ svarer til m = 0, hvilket giver:
(4)
(5)
Derfor, denne komponent beskriver den geometriske center af det oprindelige objekt.
Det andet element i DFT fremad spektrum, G₁, svarer til m = 1:

(6)

Fra Eq.6 vi konkludere, at disse punkter danner en cirkel med en radius på og udgangspunktet vinkel , hvor cirklen beskriver en komplet revolution, mens figuren er spores tilbage engang. Midten af cirklen er placeret på oprindelse (0, 0), radius er | G₁| og udgangspunktet er:

(7)

Generelt for en enkelt Fourier koefficient , koordinater er beskrevet som:

(8)

På samme måde til Eq.6, Eq.8 også beskriver en cirkel, men med en radius på R_m= | G_m|, en start vinkel og et udgangspunkt på , hvor konturen er spores en gang mens cirklen løber gennem "m" fuld baner^16,17.

Formen parametre som SOM input
Arbejdsgangen, som beskrevet i figur 1, blev anvendt til en deconvolved (ved en målte punkt spredes funktion) intravital multi foton mikroskopi datasæt af microglial celler til at karakterisere deres morfologiske ændringer i sund eller kræft kortikale væv¹⁸. Tyve DFT komponenter blev beregnet for hver 2D projektionen af de rekonstruerede 3D overflader og resultaterne blev brugt som input til SOM uddannelse. Fysiologiske betingelser, mikroglia præsenteret en temmelig kompleks figur med flere, stærkt forgrenet processer (figur 2a). Når det placeres i en kræft miljø (kortikale tumor model), mikroglia ændret til en enklere, mere spindel-lignende figur (figur 2b).

Uddannet SOM blev testet for at vurdere dets evne til at skelne mellem sunde og kræft celler. Befolkningens sund celle blev projiceret op på et enkelt område af SOM (figur 2 c). SOM svarede til kræft mikroglia datasæt med en håndvægt-formet aktivt region (figur 2d). Et blindt blandet input data sæt, som bestod af DFT shape komponenter fra både det sunde og kræft-gruppen blev fremskrevet af SOM i to forskellige grupper, samtidig med at formen af deres individuelle konturer svarende til de adskilte grupper ( Figur 2e; sammenligne med 2 c og 2d). Det kan konkluderes, at den blandede datasæt med succes var grupperet af SOM.

Vi testet effektiviteten af SOM ved at sammenligne sine fremskrivninger med manuel analysen af de samme data af en medicinsk ekspert, der klassificeres datasættet baseret på deres spatio-temporale adfærd. Eksperten identificeret fire adskilte celle grupper (resting celler, phagocytosing celler, interagerende celler og mobile celler¹⁸), som blev rekonstrueret og bruges til at træne en 12 x 12 SOM. Den uddannede netværk (figur 3a) viser grupper af høje hit-værdi kunstige neuroner, især i nederste venstre og de midterste områder af SOM. Svar af uddannede netværket blev også testet med fire tilfældigt udvalgte delmængder, (som ikke var en del af uddannelse dataset) af billeder fra de fire forskellige grupper identificeres ved den ekspert¹⁸. Disse billede delmængder resulterede i fire veldefinerede svar af SOM, som vist på figur 3b. Resting cellerne udviser den mest komplekse form og viste den højeste adskillelse inden for neurale netværk (figur 3b "hvile" panel). De andre tre identificerede celletyper delte et fælles område med SOM i nederste venstre hjørne, men ellers var adskilt af SOM. Nederst til venstre SOM område svarer således til de lavere indeksværdier DFT.

Robusthed af fremgangsmåde, SOM blev testet ved hjælp af de uddannede SOM med tre tilfældige delmængder af det samme - hvile - celle type (ikke en del af uddannelse dataset). SOM svar på denne input udviser en meget lignende reaktion (figur 3 c, delmængder 1-3), demonstrerer robustheden af vores tilgang.

Figur tidsafhængig celleforandringer er netop karakteriseret ved DFT
For at undersøge effekten af tidsafhængig ændringer af figuren celle på DFT komponenter, blev en til tre celler pr. undergruppe (Se figur 3b) sporet til 13 til 28 tid point. Figur 4 viser de første ti DFT komponenter i en ambulant celle (figur 4a) og en interagerende celle (figur 4b), som blev afbildet som en funktion af tiden. Den mobile celle udstiller en permanent ændre form (Se supplerende Video 4 i ⁸), hvilket afspejles af en grovere DFT overflade. Byger af DFT amplituden i den første tredjedel af tidsforløb for cellen interagerende falder sammen med de hurtige og store celle figur ændringer som vist i supplerende Video 5 i ⁸.

Tidsforløb for alle 19 DFT komponenter var også kendetegnet for disse to celler på tre forskellige tidspunkter under sporing af en ambulant celle (figur 5a) og en interagerende celle (figur 5b). De vinkelrette akser repræsenterer hermed seks rotation vinkler og angiver, at alle fremskrivninger er lige så vigtigt for karakterisering af formen for begge celletyper.

Figur 1. Trin for trin workflow af databehandling til at identificere celle klynger baseret på form af celler. Overflader rekonstrueret i 3D blev brugt som input til blenderen for automatiseret 3D til 2D fremskrivninger. I periferien af hver projektion lå og DFT komponenter blev beregnet. Komponenterne, der tjente som input enten til en uddannet SOM i Matlab, eller at uddanne en ny SOM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Typisk udseende af musen kortikale mikroglia celler under kontrol betingelser (a) og i kræft væv (b) Screenshots af rekonstruerede mikroglia overflader. SOM fremskrivninger blev oprettet ud fra de tre grupper af mikroglia prøver fra mus cortex: kontrol (ikke-tumorous) celler (c), tumorceller (d) og en blandet population af celler (e). Dette tal er blevet ændret med tilladelse⁸. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. (en, venstre) Selvorganiserende kort over en mus mikroglia dataset bestående af 768 input funktion vektorer. Datasættet blev brugt til at træne en 12 x 12 kunstige neurale netværk, brug af sekskantede kvarter geometri, tilfældige initialisering og 2000 epoker. (en, højre) Den tilsvarende SOM input fly i de første 10 DFT komponenter (b) svarene fra SOM afbildet i litra a, til en tilfældig VRML fil delmængde hver fra de fire celletyper "mobil", "interagere," "hvile" og "fagocyterende" som først beskrevet i figur 5 af Bayerl et al. ¹⁸. (c) den svar af den samme SOM i (a, venstre) til tre tilfældige delmængder af hele datasættet (der ikke var således en del af uddannelse dataset) "resting celler"-Skriv 3D overflader. Lighed blandt de tre svar er bemærkelsesværdige. Dette tal er blevet ændret med tilladelse⁸. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Fig. 4. (a) tid afhængighed af de første 10 DFT komponenter under et intravital imaging eksperiment af musen mikroglia. Dette panel viser data for en celle af typen "Mobiltelefon celler". X-aksen svarer til tidspunkter af eksperimentet på 60 s tidsopløsning, y-aksen viser amplitude af DFT komponenter i arbitrære enheder (a.u.), der henviser til, at z-aksen svarer til komponenten DFT fra 1 til 10. b Skriv som i (a), men for en celle i "Interagere celler". Dette tal er blevet ændret med tilladelse⁸. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. a opførsel af alle 19 DFT komponenter i en celle af typen "Mobiltelefon celler" i begyndelsen, på midten og slutningen af forsøget. Tal på x-aksen svarer til DFT komponent-ID fra 1 til 19. Y-aksen viser DFT komponent amplitude i arbitrære enheder (a.u.), mens z-akse markerer seks tilfældige rotation vinkler. (b) samme som (en), men for en celle i "Interagere celler" type. Dette tal er blevet ændret med tilladelse⁸. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Identifikation af potentielt patologiske tilstande ved hjælp af små, intakt vævsprøver er af stor betydning. Sådanne teknikker vil sikre en rettidig reaktion på smitsomme sygdomme og aggressive typer af kræft. De kinetiske og morfologiske svar af forskellige immun celler, fx mikroglia og makrofager, er karakteristiske for immunresponset af kroppen. Selv om i de fleste tilfælde ikke er det praktisk eller endda muligt at overvåge disse celler kinetic adfærd, er det temmelig ligetil at erhverve 3-dimensionelle billeder for at hente deres form. Typisk, immunceller antager en kompleks figur i sundt væv og en meget enklere form under betændte eller kræft forhold¹⁸. Mens tidsafhængig Karakteristik af sådan form ændring ville tilføje til vores forståelse af udvikling af immunrespons, kan ved hjælp af kun den 3D figur af en repræsentativ gruppe af celler også være tilstrækkelig til at bestemme den sunde eller patologisk karakter af væv.

Kendetegner en celle 3-dimensionelle overflade er ikke en nem opgave. Anvendelsen af sfærisk harmoniske er en måde at repræsentere en 3D overflade med et relativt stort antal (50-70) af komponenter^11,12. Derudover bestemme de sfæriske harmoniske er beregningsmæssigt dyrt; projicere meget komplekse figurer på enhed sfære er enten umuligt eller meget vanskeligt på grund af behovet for at anvende flere gitre af forskellige Finheden på enhed sfære; Endelig, meningsfuld fortolkning af spektrene af sfærisk harmoniske komponenter er langt fra at være trivielt.

I vores arbejde præsenteres her, erstatte vi den vanskelige opgave at direkte 3D overflade analyse med det meget enklere tilgang til brug af 2D fremskrivninger af den oprindelige overflade for at få tilstrækkelig morfologiske oplysninger for at identificere patologiske betingelser. Vi vist alle trin i denne arbejdsproces ved hjælp af 3D mikroskopi data fra myeloide celler, mens klart påpege, at alle trin var enkle at gennemføre, og de resulterende 2-dimensionale kort var let at fortolke.

Naturligvis, en 3D til 2D projektion vil føre til tab af oplysninger om strukturen af overfladen. I vores eksempel datasæt af mikroglia i en musemodel kortikale tumor var det nok til at bruge seks vinkler, når du opretter 2D fremskrivningerne. Dog kan mere komplekse figurer eller mindre fremtrædende morfologiske ændringer kræve, at et større antal fremskrivninger er lavet for at være i stand til pålideligt identificere celle undergrupper med SOM. Af denne grund, er vores tilgang designet til at være i stand til at generere og analysere enhver antallet af fremskrivninger. Blot ved at vælge et højere antal fremskrivninger for mere komplekse former, er det muligt at skalere information tab til et acceptabelt minimum. Som et eksempel, ville interagerende celletype i figur 4a og 4b kræve et større antal fremskrivninger for at repræsentere komplekse overfladen korrekt.

Som nogen omtrentlige metode havde den hermed foreslåede arbejdsproces skal testes mod resultaterne af en manuel klassificering mikroglia¹⁸. Resultaterne præsenteres tidligere bekræftet pålideligheden af den automatiserede arbejdsgang. Arbejdsprocessen er desuden mere tid effektiv i forhold til konventionelle analyse. Den medicinske ekspert, der klassificeres mikroglia celler manuelt behov ca. 4 uger for hans analyse af datasæt, vores workflow nødvendigt kun omkring 1 dag. Robustheden af vores tilgang blev også tydeligt bevist af reproducerbarhed af de uddannede SOM til et undersæt af data, der tilhørte samme celletype, men blev ikke brugt til at træne SOM, som vist i figur 3 c.

Selvom vores tilgang ikke overveje kinetic oplysninger, undersøgte vi effekten af timing på DFT-baseret form analyse. Det mest typiske eksempel for tidsafhængig adfærd blev fundet blandt befolkningens Ambulant celle, hvor bidrag fra de højere indekserede DFT komponenter var klart observerbare, som i figur 4a. Dette kræver opmærksomhed på vigtigheden af at udnytte et stort nok antal DFT komponenter, når der beskæftiger sig med celletyper, der er tilbøjelige til at opføre sig meget tid-afhængige. På grund af automatiserede natur og høj udførelse hastighed af vores softwareværktøjer, vil det øgede antal DFT komponenter og fremskrivninger øge præcisionen og pålideligheden af resultater, samtidig med at de ikke vil hindre den beregningsmæssige ydeevne mærkbart.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaris 9.1.2, software	Bitplane, Zürich, Switzerland	v.9.1.2	3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software	https://www.blender.org/	v.2.75a	3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software	https://fiji.sc/	ImageJ v.1.52b	Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE	https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis	v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour	http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start	absnake2
Computer	Any	NA	See Imaris instructions for minimum computer requirements