Morfologi-baserte skillet mellom sunn og patologiske celler utnytte Fourier transformeres og selv-organisering kart

Summary

Her gir vi en arbeidsflyt som gjør identifisering av sunn og patologiske cellene basert på deres 3-dimensjonal form. Vi beskriver prosessen med å bruke 2D-projeksjon skisserer basert på 3D overflater for å trene kart Self-Organizing som gir objektive klynging av de undersøkte celle populasjonene.

Abstract

Utseendet og bevegelser av immunceller er drevet av miljøet. Som en reaksjon på en patogen invasjon, immunceller er rekruttert til området av betennelse og aktiveres for å hindre en videre spredning av invasjonen. Dette gjenspeiles også av endringer i virkemåten og morfologiske utseende av immunceller. I kreft tissue, lignende morphokinetic endringer er observert i atferden til microglial celler: intra-tumoral microglia har mindre kompleks 3-dimensjonale figurer, har mindre forgrenet cellulære prosesser, og flytte raskere enn sunn vev. Undersøkelse av morphokinetic egenskaper krever kompleks 3D mikroskopi teknikker, som kan være svært utfordrende når henrettet langs. Derfor er opptak av en statisk 3D figur i en celle mye enklere, fordi dette krever ikke intravital mål og kan utføres på forbrukeravgift vev også. Men det er viktig å ha verktøy som tillater en rask og presis beskrivelse av 3D-figurer og lar diagnostiske klassifiseringen av sunn og patogene vevsprøver basert utelukkende på statisk, form-relatert informasjon. Her presenterer vi en verktøykasse som analyserer diskret Fourier komponentene av et sett med 2D anslag av 3D celle overflater via Self-Organizing kart. Bruk av kunstig intelligens metoder gjør vårt rammeverk for å lære om forskjellige celle figurer som det er brukt mer og mer vevsprøver, mens arbeidsflyten er enkel.

Introduction

Rimelig, enkel og nøyaktig bestemmelse av patologisk status for biologisk vev er høyeste interessen for biomedisinsk forskning. Musen modeller gir midler til å studere en rekke pathological betingelser, for eksempel immunreaksjoner eller hudkreft, sammen med komplekse 3D og 4 D (3 romlige dimensjoner og tid) mikroskopi teknikker. Mikroskopi studier kan utføres via intravital eller forbrukeravgift vev 2-fotonet mikroskopi, lys arks mikroskopi, og å en begrenset vev dybde på ca 100 µm-ved AC confocal mikroskopi. For å få gang-relatert informasjon om cellene oppførsel under fysiologiske eller patologiske forhold, er det nødvendig å overvåke vevet i lengre tid, som vanligvis krever intravital tenkelig^1,2 . Naturligvis, anvendelse av denne teknikken er begrenset til dyremodeller på grunn av sin invasiveness. Ikke-invasive teknikker er også tilgjengelig for menneskelig programmer, inkludert en rekke tomografi metoder (MSOT, CT, etc.), men disse metodene alle mangler nødvendige romlig- og ofte midlertidig løsning å studere atferden på cellenivå.

Statisk informasjon om utseendet av celler kan være tilgjengelige lettere via ulike 3D bildeprodukter teknikker kjøres på forbrukeravgift vevsprøver. Her kinetic virkemåten til cellene er ikke målt, derfor er det nødvendig å vedta romanen analyseteknikker som kan kontrollere patogene undersøkt cellene basert utelukkende på deres morfologi³. En slik tilnærming ble brukt til å knytte cellen figurer og vev teksturer til patologisk adferd^4,5,6.

I den nye teknikken beskrevet her, cellene er rekonstruert som 3D flater og deres er preget via 3D til 2D anslag og påfølgende Fourier-baserte periferien-form analyse^7,8. Ved å redusere dimensjonene fra 3 til 2, er problemet forenklet. Det er også mulig å karakterisere celle overflatene i 3D bruke sfærisk harmoniske analyse, som det har blitt gjort for medisinske bilder⁹. Imidlertid håndterer sfærisk harmoniske ikke skarpe og robust Vel, krever en multi-skala rutenettet skal etableres på enheten sfæren. I tillegg antallet nødvendige sfærisk harmoniske komponenter kan være store (50-70), med de underliggende beregningene svært krevende og resultatene vanskelig å tolke^10,11,12.

Vår nylig foreslåtte metoden reduseres aktiviteten til en serie av 2D figurbeskrivelser, der antall 2D anslagene er opp analytiker og justeres etter kompleksiteten i 3D-form. Anslagene genereres automatisk via et Python-skript som kjører i en 3D-animasjon verktøyet. 2D anslagene er beskrevet av diskret Fourier transform (DFT) komponenter i deres periferi, beregnet av en Fiji¹³ plugin som tilbys her som en del av vår programvarepakke. DFT er brukt her for å dele opp komplekse omrisset av cellen inn i synd og cos funksjoner. På denne måten kan vi beskrive disposisjonen med et relativt lite antall DFT komponenter, dermed redusere kompleksiteten av problemet (for mer detaljer se ligninger avsnitt). DFT komponentene er satt i en utdannet Self-Organizing kart (SOM¹⁴), der eksistensen av figuren klynger kan objektivt testet⁸. Somer gir en konkurransedyktig og unsupervised læremiddel fra feltet av kunstig intelligens. De består av en koblet rekke kunstige nerveceller som kommuniserer med hverandre via en vektet nabolaget avstand funksjon. Neuronal systemet reagerer på det første elementet i input datasettet og neurons som svar er den sterkeste "gruppert" nærmere hverandre. Som neural systemet mottar mer input, begynner data nerveceller som gjentatte ganger reagerer sterkt å danne veldefinert klynge i systemet. Etter riktig trening på store datasett som inneholder 2D-figurinformasjon i form av et sett med DFT komponenter, enkeltstående cellers DFT komponenter kan settes i trent SOMEN og avsløre om cellen sannsynlig tilhører den sunne eller gruppen patogene cellen. Vi forventer slik verktøyet å bli et flott tillegg til metodene av vitenskapelig og klinisk diagnostikk.

Protocol

1. protokoll krav

1. Få høy oppløsning deconvolved tredimensjonale (3D) mikroskopi data deconvolved i samsvar med Nyquist vilkåret med et utvalg intervall på høyeste romlige frekvensen for å få et bilde med høy oppløsning.
2. Bruk 3D-rendring programvare for surface rekonstruksjon og eksport.
3. Bruk 3D-animasjon programvare kan kjøre Python-skript (Python-skript kan lastes ned fra github oppbevaringssted: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) å lage 2D prognoser.
4. Bruk Fiji¹³ å analysere 2D anslag og ekstra DFT komponenter.
   1. Bruk gjeldende Fiji fordelingen. Hvis det allerede finnes en installert versjon av Fiji, kontroller at den installerte versjonen er nyest. Dette kan enkelt oppnås ved å kjøre Hjelp | Oppdateringsalternativet.
   2. Bruk aktiv kontur plugin¹⁵, som kan lastes ned fra http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start og skal kopieres inn i plugins-mappen.
   3. Dataoverføre SKYGGEN Fiji plugin til github oppbevaringssted og kopiere inn i plugins-mappen.
5. Bruke beregningsorientert matematikk programvare i stand til å beregne Self-Organizing kart.

2. rekonstruere det 3D Image.

Merk: For tester hensikt, et eksempel datasett er gitt i github oppbevaringssted (se ovenfor).

1. Start programmet 3D rekonstruksjon og åpne 3D bildedataene.
2. Opprette en 3D-overflate av (alle) objekt(er).
   1. Velger du 3D-visning , og klikk på overflater. Klikk på neste -knappen (blå sirkel med en hvit trekant) for å fortsette overflate opprettelsesveiviseren.
   2. Velg bilde kanalen for overflaten gjenoppbygging.
   3. Bruke utjevning funksjon for å unngå porøse overflater.
      1. Velg en utjevning verdi som ikke skjule detaljene i overflaten, men unngår porøse overflater.
   4. Velg en terskelverdi finne overflater.
      1. Bruk en absolutt intensitet terskel når objektene er godt adskilt fra bakgrunnen og har et lag lysstyrkenivå.
      2. Bruke en lokal derimot terskel når objektene varierer i intensitet, men kan fortsatt bli separert fra lokale bakgrunnen og de andre objektene rundt dem. Angi søkeområdet lokale terskelen etter verdien av forventet diameteren på rekonstruert objektene.
   5. Filtrere rekonstruert overflater etter morfologiske parametere av interesse, f.eks volum, sphericity, overflate-til-volum forhold, etc., og Avslutt overflaten gjenoppbygging.
3. Lagre og eksportere genererte overflater i et format som er kompatibelt med 3D-animasjon programvare som skal brukes i neste trinn.

3. transformere 3D rekonstruert overflater i 2D anslag

1. Start Blender og gå til kategorien levering i det høyre vinduet. Velg TIFF-formatet fra nedtrekksmenyen og angi fargedybden til 8-biters RGBA.
2. Bytte til modus for skripting og åpne angitte skriptfilen "GUI_AutoRotate.py" fra lageret med dette arbeidet (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
3. Klikk på Kjør skriptet. Velg mappen wrl filer når spørsmål for inndata.
4. Hvis nødvendig, opprette flere rotasjoner når du arbeider med mer komplekse overflater: gå til GUI og sette boksen rotasjoner til en verdi over 6.
   Merk: En rotasjon av 6 forskjellige vinkler kan være tilstrekkelig til å skille de ulike celle populasjonene. Det anbefales ikke å opprette færre enn seks rotasjoner per overflaten, på grunn av mulig informasjonstap av.
5. Kjør skriptet ved å klikke på knappen Roter i GUI. Lagre anslagene av personlige overflater i den samme mappen som ble brukt som input-mappen (trinn 2.3). Standard bildene lagres i en 8-biters Tiff-format (se trinn 2.1), som er formatet som kreves av Fiji plugg SKYGGEN.

4. Finn periferien og beregne Fourier komponentene bruker Fiji.

1. Åpne Fiji og velg SKYGGEN i Plugins-menyen. Start med standardverdiene og finjustere parametere senere. Klikk OK når du er klar til å kjøre programmet.
   1. Velg en Gradient terskelverdi for terskelverdi inndatabildet.
   2. Velg antall gjentakelser. Jo høyere Nummer av gjentakelser verdi, desto mer nøyaktig gjenoppbyggingen av periferien. For enklere figurer er et lavere tall vanligvis tilstrekkelig.
   3. Bruke parameteren Nummeret av Dilations å finne ut hvor mye større Start masken er i forhold til selve cellen. Vanligvis trenger mer kompliserte figurer dilatasjon skritt for å finne riktig periferi.
   4. Merk av i avkrysningsruten Mørk bakgrunn hvis projiserte figurene er lysere enn bakgrunnen.
   5. Aktivere avmerkingsboksen Vis midlertidige resultater bare når du bruker en liten test datasett for å avgjøre ytelsen til SKYGGE. Aktivere dette alternativet for større datasett senker beregningsorientert effektiviteten og muligens kunne stoppe et system med lite videominne.
   6. Se Lagre resultatet tabeller sjekkheftet å bruke resultatene av SKYGGEN som inndata til trinn 5. Hvis boksen er avmerket, lagres alle resultater i individuelle csv-filer. Et sammendrag av utdataene genereres alltid i en fil kalt "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
2. Velg mappen inndataene som inneholder TIFF-filer som ble opprettet i trinn 3.
3. Gi mappen output data.
4. Klikk OK for å starte plugin.

5. selv-organisering kart

Merk: SOM nettverk er bare kunne klassifisere data når de er utdannet på store datasett som inneholder innspill fra alle forventede celletyper og betingelser. For demonstrasjon, slik et dataset tilbys og finnes i våre depotet ("AllCells_summary_normalised.csv" fra https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

1. Følg disse retningslinjene hvis det finnes ingen utdannet SOM ennå for inndataene; ellers går du til trinn 5.2.
   1. Starte en beregningsorientert matematisk programvare kan yte nettverk klassifiseringer.
   2. Velg en datafil som skal brukes for trening SOM nettverket. Dataset må inneholde alle eksperimentelle forhold for å trene SOM på hvilke bestemt celle og eksperimentelle forhold.
      Merk: Det er også mulig å bruke den angitte AllCells_summary_normalised.csv for å teste systemet.
   3. Begynne å trene og vente til treningen er fullført før du fortsetter. Standard er skriptet satt til å kjøre 2000 gjentakelser ("epoker").
      Merk: Antall gjentakelser er avhengig av læring rate av SOM. Avhengig av inndataene er det lurt å teste både høyere og lavere tall epoker og observere stabiliteten til mønsteret av SOM. Når du bruker manuset leveres, kan antall gjentakelser endres under linje 32. Nettverk størrelsen kan endres i linje 34 (som standard er satt til 12 ved 12).
   4. Når treningen er fullført, Undersøk nettverkets topologi (nabo avstander, inngang fly, prøve treff, osv.). Nettverket er nå trent og kan lagres for fremtidig bruk.
2. Laster inn SOM, når du bruker en allerede trent kart (dette kan komme fra trinn 5.1 eller andre kilder) for å klynge dataset.
   1. Importere csv-filen som skal testes med de forhåndsinnlastede utdannet SOM. Velge csv utskrift av SKYGGEN Plugin fra trinn 4 når du bruker data utarbeidet av SKYGGEN plugin.
      Merk: Det er også mulig å bruke eksempel datafilene "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" eller "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv" som tilbys via github.
   2. Etter klassifiseringen er ferdig, evaluere resultatene av SOMEN som i trinn 5.1.5.
      1. Undersøk hitmap generert fra csv-filen. Hver celle av kartet viser hvor mange ganger datasettet "treff" bestemt cellen av de kvalifiserte SOM. Når en gruppe celler er samlet i et lite område av dette kartet, angir dette at datasettet er ganske homogent. Flere klynger vil indikere at undergrupper sannsynlig finnes i datasettet.
      2. Undersøke nabolaget vekt avstandene. Deler av dette kartet som skilles godt tilsvarer grupper med objekter som oppfører seg svært forskjellig fra den SOM synspunkt. Med DFT komponenter som inndata betyr dette at gruppene cellen har svært ulike former for tilsvarende 3D overflater.
      3. Undersøke vekt flyene informasjon om bidraget ved hvert element i funksjonen vektoren. Ved hjelp av 20 DFT komponenter som beskrevet tidligere, vises 19 kartene her. Når du bruker den medfølgende eksempel datasettet, første 5 eller 6 vekt flyene vil være annerledes, men resten av dem vil vises ganske lik. I dette tilfellet kan det konkluderes at det ville være nok til å bruke ca 7 DFT komponenter.

Representative Results

Vi brukt en DFT for å beregne hovedkomponentene i figuren tilsvarer celle anslagene. Fourier beskrivelsene ble oppnådd ved å bruke DFT algoritmen xy-koordinaten parene av montert utkanten av cellen anslagene, innhentet avgang av den AbSnake delen av vår arbeidsflyt. Disse xycoordinate par kan behandles som en kompleks verdsatt 2D vektor "g":

Angrepsvektorene i "g" bruker vi DFT til å beregne komplekse verdsatt Fourier spekteret:

Basert på velkjente formler diskret Fourier spekteret, og bruker komplekse-tallet merkingen av "g" som:

Får vi:
(1)
Vi kan beregne den virkelige ("A") og imaginære ("B") komponenter i :
(2)
(3)
Her, den første DFT komponent G₀ tilsvarer m = 0, som gir:
(4)
(5)
Følgelig beskriver denne komponenten geometriske midten av det opprinnelige objektet.
Det andre elementet i DFT frem spekteret, G₁, tilsvarer m = 1:

(6)

Fra Eq.6 vi konkludere med at disse punktene danner en sirkel med en radius på og start vinkel , der sirkelen beskriver en fullstendig revolusjon mens figuren spores en gang. Midten av sirkelen er på origo (0, 0), radius | G₁| og utgangspunktet er:

(7)

Generelt, for en enkelt Fourier-koeffisient , koordinatene beskrives som:

(8)

Tilsvarende til Eq.6, Eq.8 også beskriver en sirkel, men med en radius på R_m= | G_m|, en start vinkel og et utgangspunkt på , der konturen spores en gang mens sirkelen går gjennom "m" full baner^16,17.

Figur parametere SOM inndata
Arbeidsflyten som beskrevet i figur 1, ble brukt til en deconvolved (med en målt punkt spredning funksjon) intravital flere Foton mikroskopi dataset microglial celler å karakterisere morfologiske endringer i sunn eller kreft kortikale vev¹⁸. Tjue DFT komponenter ble beregnet for hver 2D-projeksjon av rekonstruerte 3D overflater og resultatene ble brukt som inndata for SOM trening. Fysiologiske forhold, microglia presentert en ganske komplisert figur med flere svært forgrenet prosesser (figur 2a). Når den plasseres i et kreft miljø (kortikale svulst modell), microglia til en enklere, mer spindel-lignende figur (figur 2b).

Trent SOM ble testet for å vurdere sin evne til å skille mellom sunn og kreft celler. Sunn celle befolkningen ble anslått til ett område av SOMEN (figur 2 c). SOMEN svarte i kreft microglia datasettet en manual-formet aktiv region (figur 2d). Et blindt blandet inn datasett som besto av DFT komponentene fra både den sunne og kreft gruppen ble anslått av SOMEN i to grupper, stund holder formen på deres personlige konturer ligner de av separate grupper ( Finne 2e; Sammenlign med 2 c og 2d). Det kan konkluderes at blandet datasettet ble vellykket klyngen av SOM.

Vi testet ytelsen til SOMEN ved å sammenligne sine anslag med manuell analyse av samme data fra medisinsk sakkyndig, som klassifisert datasettet basert på deres spatio-temporale oppførsel. Eksperten identifisert fire forskjellige cellegrupper (hvile celler, phagocytosing celler, samspill celler og mobile celler¹⁸), som ble rekonstruert og brukt til å trene en 12 x 12 SOM. Utdannet nettverket (figur 3a) viser grupper av høy hit-verdien kunstig neurons, spesielt i nedre venstre og de midterste områdene av SOM. Responsen av kvalifiserte nettverket ble testet med fire tilfeldig utvalgte undergrupper (som ikke var del av opplæring datasettet) av bilder fra disse fire gruppene identifiseres av ekspert¹⁸. Disse bilde delsett resulterte i fire veldefinerte svar av SOM, som vist i figur 3b. Hvile cellene exhibit mest komplekse form og viste høyeste for separasjon i nettverk (figur 3b "hvile" panel). De andre tre identifiserte celletyper delte et felles område for SOM i nedre venstre hjørne, men ellers var atskilt med SOM. Nederst til venstre SOM området tilsvarer dermed lavere-indeks DFT verdiene.

Robust tilnærming SOM ble testet ved hjelp av utdannet SOMEN med tre tilfeldige delsett av det samme - hvile - celle type (ikke del av opplæring datasettet). Responsen av SOMEN inndataene utstillinger ligner svar (Figur 3 c, delsett 1-3), demonstrere robustheten av vår tilnærming.

Tidsavhengige celle figurendringene er nettopp preget av DFT
Undersøke effekten av tidsavhengige endringer på celle figuren på DFT komponenter, ble en til tre celler per undergruppe (se figur 3b) sporet for 13 til 28 tidspunkt. Figur 4 viser de første ti DFT komponenter av en mobil celle (figur 4a) og en samspill celle (figur 4b), som var skal tegnes som en funksjon av tid. Transportabel cellen utstillinger en permanent endre figur (se utfyllende Video 4 i ⁸), noe som gjenspeiles av en grovere DFT overflate. Bursts av DFT amplituden i første tredje selvfølgelig tid for samspill cellen sammenfallende med figurendringene rask og store cellen som vist i supplerende Video 5 i ⁸.

Tid selvfølgelig alle 19 DFT komponenter var også preget for disse to cellene på tre separate tidspunkt under sporing av en mobil celle (figur 5a) og en samspill celle (figur 5b). De vinkelrette aksene representerer herved seks rotasjon vinkler og angi at alle anslag er like viktig for karakterisering av figuren for begge celletyper.

Figur 1. Trinnvis arbeidsflyten av databehandlingen å identifisere celle klynger basert på formen på cellene. Overflater i 3D ble brukt som innspill til Blender til å automatisk 3D til 2D. Utkanten av hver projeksjon lå og DFT komponenter ble beregnet. Komponentene fungerte som en inngang til en utdannet SOM i Matlab eller å trene en ny SOM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Typisk utseende musen kortikale microglia celler under kontroll forhold (a) og i kreft tissue (b) skjermbilder av rekonstruert microglia overflater. NOEN anslag ble opprettet fra de tre microglia prøver fra musen cortex: kontrollere (ikke-tumorous) celler (c), tumorceller (d) og en blandet befolkning av celler (e). Dette tallet er endret med tillatelse⁸. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. (a, venstre) Selv-organisering kart av musen microglia dataset bestående av 768 input funksjonen vektorer. Datasettet ble brukt for et 12 x 12 kunstige nevrale nettverk, med Sekskantet nabolaget geometri, tilfeldig initialisering og 2000 epoker. (a, høyre) Den tilsvarende SOM inngang fly første 10 DFT komponenter (b) svarene på SOM avbildet i (a), til en tilfeldig VRML filen delsett hver fra de fire celletyper "mobile", "samspill", "hvile" og "phagocytic" som første beskrevet i figur 5 av Bayerl et al. ¹⁸. (c) svar av den samme SOM i (a, venstre) til tre tilfeldige delsett av hele datasettet (som ikke var dermed del av opplæring datasettet) "hvile cellene"-type 3D overflater. Er likheten blant tre svarene. Dette tallet er endret med tillatelse⁸. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. (a) tid avhengighet av de første 10 DFT komponentene under en intravital tenkelig eksperimentet av musen microglia. Dette panelet viser data for en celle type "Mobile celler". X-aksen tilsvarer tidspunkt av eksperimentet på 60 s tid oppløsning, y-aksen viser amplituden til DFT komponentene i vilkårlig enheter (a.u.), mens z-aksen tilsvarer komponenten DFT fra 1 til 10. (b) som (a), men for en celle "Samspill cellene" Skriv inn. Dette tallet er endret med tillatelse⁸. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. (a) oppførselen til alle 19 DFT komponenter i en celle type "Mobile celler" i begynnelsen, midten og slutten av eksperimentet. Tallene på x-aksen tilsvarer DFT komponent-ID fra 1 til 19. Y-aksen viser DFT komponent amplituden i vilkårlig enheter (a.u.), mens z-aksen markerer seks tilfeldige rotasjon vinkler. (b) samme som (a), men for en celle "Samspill cellene" type. Dette tallet er endret med tillatelse⁸. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Identifikasjon av potensielt patologiske forhold med små, intakt vevsprøver er høy viktighet. Slike teknikker vil sikre en betimelig respons infeksjonssykdommer og aggressiv typer kreft. Kinetic og morfologiske svarene på ulike immunceller, f.eks microglia og makrofager, er karakteristisk for immunforsvaret i kroppen. Selv i de fleste tilfeller ikke er det praktisk eller mulig å overvåke kinetic virkemåten til disse cellene, er det ganske enkelt hente 3-dimensjonale bilder for å hente sin form. Vanligvis anta immunceller en kompleks figur i friskt vev og en mye enklere form under betent eller kreft¹⁸. Mens tidsavhengige kjennetegner slik figur endring ville legge til vår forståelse av utviklingen av immunforsvaret, kan bruker bare 3D form av en representant cellegruppe også være tilstrekkelig å angi sunn eller patologisk av vev.

Karakterisere 3-dimensjonale overflaten av en celle er ikke en enkel oppgave. Bruk av sfæriske harmoniske er en måte å representere en 3D overflate med et relativt stort antall (50-70) komponenter^11,12. I tillegg bestemme den sfæriske harmoniske er beregningsmessig dyrt; projisere svært komplekse figurer på enheten sfæren er enten umulig eller svært vanskelig på grunn av behovet for å bruke flere nett av ulike finhet på enheten sfæren; Endelig er meningsfull tolkningen av spectra sfærisk harmoniske komponentene langt fra ubetydelig.

I vårt arbeid som presenteres her, erstatte vi den vanskelige oppgaven med direkte 3D overflaten analyse med mye enklere tilnærming av bruker 2D projeksjoner av opprinnelige overflaten for å få tilstrekkelig morfologiske informasjon for å identifisere patologisk forhold. Vi viste hvert trinn av arbeidsflyten ved hjelp av 3D mikroskopi data fra myeloide celler, mens tydelig påpekte at alle trinnene var enkle å fullføre, og de resulterende 2-dimensjonal kartene var lett å tolke.

Naturligvis, en 3D-til-2D-projeksjon vil føre til tap av informasjon om strukturen på overflaten. I vårt eksempel datasett av microglia i en mus kortikale svulst modell var det nok til å bruke seks vinkler når du oppretter 2D anslagene. Men kan mer kompliserte figurer eller mindre fremtredende morfologiske endringer kreve at et større antall anslag er skapt for å identifisere pålitelig celle undergrupper med SOM. Derfor er vår tilnærming utformet for å kunne generere og analysere flere anslag. Ved å velge et høyere antall anslagene for mer komplekse figurer, er det mulig å skalere informasjonstap til et tålelig minimum. Som et eksempel, vil samspill celle type figur 4a og 4b kreve et større antall anslag for å representere komplekse overflaten riktig.

Som et omtrentlig metoden måtte herved foreslåtte arbeidsflyten testes mot resultatene av en manuell klassifisering prosess microglia¹⁸. Resultatene presentert tidligere bekreftet påliteligheten av automatiserte arbeidsflyten. Videre er arbeidsflyten mer tid effektiv sammenlignet med konvensjonelle analyse. Medisinsk ekspert som klassifisert microglia cellene manuelt nødvendig ca 4 uker for sin analyse av datasettet mens våre arbeidsflyt trengs bare ca 1 dag. Robust vår tilnærming ble også tydelig påvist av reproduserbarhet av utdannet SOMEN til et delsett med data som tilhørte samme celle type, men ble ikke brukt til å trene SOM, som vist i Figur 3 c.

Selv om vår tilnærming ikke vurdere kinetic informasjon, undersøkte vi effekten av timingen på DFT-baserte form analyse. Det vanligste eksemplet for tid avhengig atferd ble funnet blant befolkningen transportabel cellen der bidraget fra høyere indeksert DFT komponentene var tydelig observerbare, som i figur 4a. Dette krever oppmerksomhet til viktigheten av bruker et tilstrekkelig antall DFT komponenter når håndtere celletyper som er sannsynlig å oppføre seg på en svært tidsavhengige måte. Automatisert natur og høy kjøringen av våre verktøy, vil økt antall DFT komponenter og anslag øke presisjon og pålitelighet av resultatene, mens de ikke merkbart hindrer databehandlingsytelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaris 9.1.2, software	Bitplane, Zürich, Switzerland	v.9.1.2	3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software	https://www.blender.org/	v.2.75a	3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software	https://fiji.sc/	ImageJ v.1.52b	Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit	MathWorks, www.mathworks.com	R2017b	Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE	https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis	v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour	http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start	absnake2
Computer	Any	NA	See Imaris instructions for minimum computer requirements