electrophysiological माप में, एक प्रसार क्षमता की उपस्थिति इलेक्ट्रोड क्षमता में फेरबदल करके रिवर्स क्षमता की सटीक माप परेशान करता है । एक सूक्ष्म-आगर नमक पुल का उपयोग करना, प्रसार क्षमता के प्रभाव को कम किया गया है, जो पुनर्गठन रिकॉमबिनेंट झिल्ली प्रोटीन का सब्सट्रेट कारोबार संख्या की एक और सटीक माप की अनुमति देता है ।
तारीख करने के लिए, सभी औषधीय दवाओं के ५०% से अधिक झिल्ली प्रोटीन के परिवहन कैनेटीक्स लक्ष्य । झिल्ली वाहक प्रोटीन लिपिड bilayer झिल्ली में पुनर्गठन के electrophysiological लक्षण वर्णन उनके भौतिक और औषधीय गुणों के आकलन के लिए एक शक्तिशाली लेकिन नाजुक तरीका है । सब्सट्रेट कारोबार संख्या अलग झिल्ली प्रोटीन की गतिविधि की तुलना की अनुमति देता है कि एक अद्वितीय पैरामीटर है. एक electrogenic परिवहन में, translocated सब्सट्रेट के ढाल एक झिल्ली क्षमता है कि सीधे प्रोटीन के सब्सट्रेट कारोबार दर को संबद्ध बनाता है । चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, एक प्रसार क्षमता, भी कहा जाता है तरल जंक्शन क्षमता, प्रेरित है, जो बदल जाता है इलेक्ट्रोड क्षमता और काफी सटीक झिल्ली संभावित माप परेशान करता है. प्रसार क्षमता एक नमक पुल है, जो इलेक्ट्रोड क्षमता संतुलन से कम किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, एक माइक्रो-आगर नमक पुल electrophysiological सेट-अप में सुधार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो झिल्ली गठन के लिए micropipettes का उपयोग करता है । नमक समाधान एक microcapillary पिपेट टिप में भरा है, agarose के अलावा द्वारा स्थिर है, और आसानी से एक मानक इलेक्ट्रोड के लिए मुहिम शुरू कर सकते हैं । एक सूक्ष्म नमक पुल इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रोड क्षमता एक मानक इलेक्ट्रोड की तुलना में अधिक स्थिर है. इस प्रणाली के कार्यांवयन इलेक्ट्रोड क्षमता स्थिर और झिल्ली की क्षमता का अधिक सटीक माप एक पीएच ढाल द्वारा उत्पंन की अनुमति देता है । इस प्रणाली का उपयोग करना, mitochondrial वाहक UCP1 और UCP3 के प्रोटॉन कारोबार दर फिर से जांच कर रहे है और पहले माप की तुलना में ।
झिल्ली प्रोटीन अप करने के लिए सभी ज्ञात दवा दवाओं के ६०% द्वारा लक्षित कर रहे हैं1. झिल्ली प्रोटीन की Electrophysiological माप झिल्ली वाहक प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता सब्सट्रेट के electrogenic परिवहन का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली लेकिन नाजुक उपकरण हैं । लगातार वोल्टेज या वोल्टेज रैंप के आवेदन द्वारा transmembrane वर्तमान का मॉडुलन वाहक के औषधीय और भौतिक गुणों का आकलन करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, सक्रियण और सब्सट्रेट या परिवहन द्वारा निषेध कैनेटीक्स. विशेष ब्याज की सब्सट्रेट कारोबार संख्या है, जो कि समय इकाई प्रति एक झिल्ली प्रोटीन द्वारा translocated है सब्सट्रेट की राशि प्रदर्शित करता है । यह एक प्रमुख पैरामीटर जब विभिंन झिल्ली प्रोटीन के कैनेटीक्स की तुलना है । झिल्ली भर में आरोपित सब्सट्रेट की एकाग्रता ढाल की स्थापना एक विद्युतवाहक बल सब्सट्रेट की कारोबार संख्या मुजे है जो उत्पन्न करता है ।
एक AgCl इलेक्ट्रोड का उपयोग करना, एक क्लोराइड मुक्त बफर की उपस्थिति एक प्रसार क्षमता है कि परिवर्तन इलेक्ट्रोड क्षमता बनाता है और वर्तमान वोल्टेज माप2में एक बदलाव की ओर जाता है. हालांकि हमेशा वर्तमान, यह मानक कंडक्टर और क्षमता माप के लिए नगण्य है क्योंकि इन मापदंडों या तो वर्तमान वोल्टेज रिकॉर्डिंग (कंडक्टर) की ढलान पर निर्भर कर रहे हैं या एक एकल रिकॉर्डिंग (क्षमता) का अंतर है, जो क्षमता रद्द करता है । हालांकि, रिवर्स क्षमता है, जो सब्सट्रेट के परिवहन के द्वारा बनाई गई है की रिकॉर्डिंग काफी प्रसार क्षमता से परेशान किया जा सकता है । इस प्रकार, रिवर्स क्षमता की सटीक माप के लिए, इलेक्ट्रोड क्षमता लगातार रखा जाना है ।
प्रसार क्षमता दो तरीकों से कम किया जा सकता है: (i) एक bilayer झिल्ली की उपस्थिति में, एक सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए झिल्ली3,4, या (ii) एक नमक पुल के एक तरफ वृद्धि हुई है इलेक्ट्रोड संभावित संतुलन 5. पहली विधि माप की स्थिरता पर अत्यधिक निर्भर है । झिल्ली सब्सट्रेट लगभग समान रूप से समाधान में वितरित किया जाता है जब तक क्रियाशीलता के तहत सब्सट्रेट के अलावा से, कई मिनट के लिए जीवित है । अगर झिल्ली के बीच में टूटना, सब्सट्रेट ढाल आरोपित अणुओं के मुक्त विनिमय द्वारा बदल दिया है, और माप गलत बारी । उत्तरार्द्ध विधि प्रसार क्षमता को संतुलित करता है, लेकिन सेट-अप के आकार तक सीमित है । एक electrophysiological सेट अप करने के लिए एक सूक्ष्म रेंज में एक छोटी लेकिन कार्य नमक पुल को लागू करने6चुनौती दे रहा है । बाद विधि के लिए, नमक समाधान एक microcapillary टिप में भर जाता है और agarose के अलावा द्वारा स्थिर करने के लिए बफर समाधान के लिए नमक समाधान के प्रसार को रोकने के ।
इस प्रोटोकॉल में, एक सूक्ष्म आगर नमक पुल और कार्यांवयन के एक electrophysiological सेट अप में पिपेट सेट अप7 के आधार पर का एक सीधा उत्पादन वर्णित है । एक microcapillary टिप दोनों 1 मॉल% के साथ एक 3 मीटर KCl समाधान शामिल करने के लिए समायोजित किया जाता है (डब्ल्यू/वी) agarose और एक AgCl इलेक्ट्रोड और बफर समाधान पुल । सूक्ष्म नमक पुल का लाभ इलेक्ट्रोड संभावित बदलाव की समय रिकॉर्डिंग और विभिन्न पीएच ढाल पर झिल्ली की क्षमता का अधिक सटीक माप द्वारा प्रदर्शित किया जाता है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के मॉडल प्रणाली में liposomes में पुनर्गठन, mitochondrial वाहक UCP1 और UCP3 समान परिस्थितियों में उत्पादित की टर्नओवर दरों की जांच कर रहे है और पिछले परिणामों की तुलना में3,8।
इलेक्ट्रोड के साथ माइक्रो-आगर नमक पुल के कार्यांवयन अपनी प्रसार क्षमता को कम करता है और एक पीएच ढाल द्वारा उत्पंन झिल्ली की क्षमता के और अधिक सटीक माप की अनुमति देता है । विभिंन transmembrane पीएच ढाल की उपस्थिति में, दोनों इलेक्ट्रोड के संभावित बदलाव ΔpH पर स्वीकार्य था = ०.३५ जब ताकि नेर्ंस्ट संतुलन क्षमता (Φताकि नेर्ंस्ट = २३.८ एमवी के लिए ΔpH = ०.४) के सैद्धांतिक मूल्य की तुलना । हालांकि, अधिक शारीरिक पीएच ग्रैडिएंट में, उदाहरण के लिए के रूप में मैट्रिक्स और झिल्ली के बीच अंतरिक्ष mitochondria में, मानक AgCl इलेक्ट्रोड ठीक ΔpH पर संभावित shift मापने के लिए विफल = 1 (चित्रा 3A) । इलेक्ट्रोड माइक्रो के साथ पाटने-आगर नमक मूल्यों जो बहुत अधिक सिद्धांत के बराबर थे दिया ।
प्रसार संभावित प्रयोग के दौरान बफर समाधान बदल जाता है, तो AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड पर भी हो सकता है । क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था के बाद से युग्मन प्रोटीन क्लोराइड आयनों के परिवहन के लिए सुझाव दिया गया था, और पीएच Tris या एमईएस का उपयोग कर समायोजित किया गया था । इलेक्ट्रोड क्षमता, क्लोराइड की एक पर्याप्त एकाग्रता के अभाव में, मुख्य रूप से बफर समाधान में क्लोराइड दोष पर निर्भर करता है. के रूप में अपनी संरचना प्रयोग के दौरान अपरिवर्तित है, यह सिर्फ एक निरंतर ऑफसेट क्षमता में परिणाम होगा । हालांकि, दो इलेक्ट्रोड के बीच एक निरपेक्ष संभावित अंतर की माप के लिए, एक साधारण आगार नमक-पुल सिस्टम (Ag/AgCl 3 M KCl) भी संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
एक माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड क्षमता के एक equilibration द्वारा प्रसार क्षमता को संतुलित करता है । आदेश में नमक समाधान को स्थिर करने के लिए, 1% (डब्ल्यू/वी) agarose बफर समाधान के साथ नमक समाधान के मिश्रण को रोकने के लिए जोड़ा गया था । नमक आयनों K+ और सीएल– तरल में समान मोबिल है और इलेक्ट्रोड क्षमता संतुलन । नमक पुल ठीक से स्थापित करने के लिए, आगर नमक समाधान के लिए पर्याप्त रूप से किसी भी हवा के बुलबुले के बिना microcapillary टिप को भरने के लिए और AgCl इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए गर्म हो गया है । आगे उपयोग करने से पहले, नमक पुल इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच बिजली के संपर्क की जाँच की जा करने के लिए है. नमक पुल प्रयोग किया जाता है समय पर निर्भर करता है, नमक समाधान के लिए पर्याप्त बफर के साथ नमक समाधान के किसी भी मिश्रण को रोकने के लिए gelled हो गया है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि K+ या Cl– ट्रांसपोर्टरों की जांच की जाती है । नमक पुल का इस्तेमाल बहुत कम समय के लिए किया गया और agarose का रेफरेंस इस समय रेंज में नगण्य है । 5%, या आगर (3%-5%), के agarose के एक उच्च एकाग्रता समय की एक लंबी अवधि के लिए नमक पुल का उपयोग कर की अनुमति देता है6,12।
इस विधि की अनुमति देता है एक झिल्ली ट्रांसपोर्टर के परिवहन कैनेटीक्स का निर्धारण कम कारोबार दरों के साथ (i) और भीतरी झिल्ली, जो शायद ही मानक पैच दबाना सेट-अप13में जांच की जा सकती है की mitochondrial प्रोटीन की (ii) । इसकी परिशुद्धता मुख्य रूप से रिवर्स संभावित माप है, जो सटीकता कम कुल झिल्ली कंडक्टर और छोटे एकाग्रता ढाल जो रिकॉर्डिंग के शोर से नीचे एक झिल्ली की क्षमता पैदा पर कम है पर निर्भर है ।
इस सेट का उपयोग करना, UCP1 और UCP3 के कारोबार की दर के रूप में एक ही शर्तों के तहत उत्पादित मापा गया । कारण उच्च पीएच ढाल, प्राप्त दरों को और अधिक सटीक और छोटी इलेक्ट्रोड संभावित बदलाव से उत्पंन कलाकृतियों से बेफिक्र लग रहे हैं । यह आगे का विश्लेषण और इसी तरह की शर्तों के तहत उत्पादित mitochondrial झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ऑस्ट्रिया के रिसर्च फंड (P31559-B20 to E.E.P.) ने सपोर्ट किया था । लेखकों proteoliposomes में उत्पादन और माउस UCP1 और UCP3 के पुनर्गठन में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सारा Bardakji धंयवाद ।
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |