I elektrofysiologiska mätningar stör närvaron av en diffusion potentiella exakt mätning av omvänd potential genom att ändra elektroden potentiella. Med en mikro-agar salt bridge minimeras effekterna av diffusion potentiella, vilket ger en mer exakt mätning av substrat omsättning antalet ombildade rekombinant membranproteiner.
Hittills har rikta mer än 50% av alla farmakologiska läkemedel transport kineticsen av membranproteiner. Elektrofysiologiska karakterisering av membran bärarproteiner beredas i lipid lipidens membran är en kraftfull men känslig metod för bedömning av sina fysikalisk-kemiska och farmakologiska egenskaper. Omsättning är substrat en unik parameter som tillåter jämförelse av aktiviteten av olika membranproteiner. I en electrogenic transport skapar gradient flyttade substratet en membranpotential som direkt korrelerar till substrat Omsättningshastigheten av protein. Med hjälp av silverklorid elektroder, induceras en diffusion potential, även kallad flytande junction potentiella, vilket förändrar elektrod potential och avsevärt stör exakt membran potentiella mätningar. Diffusion potentiella kan minimeras genom en salt bro, som balanserar elektrod potential. I den här artikeln är en mikro-agar salt bro för att förbättra elektrofysiologiska set-up, som använder Mikropipetter för membran bildandet. Saltlösningen är fylld till en microcapillary pipettspetsen, stabiliseras genom tillsats av agaros, och kan enkelt monteras till en standard elektrod. Elektrod potential av en mikro-salt bridge elektrod är stabilare jämfört med en standard elektrod. Genomförandet av detta system stabiliserar elektrod potential och ger mer exakta mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. Med detta system, är proton omsättning de mitokondriella trafikföretag UCP1 och UCP3 föremål för en förnyad och jämfört med tidigare mätningar.
Membranproteiner är riktade med upp till 60% av alla kända läkemedel1. Elektrofysiologiska mätningar av membranproteiner är en kraftfull men känsliga verktyg för att analysera electrogenic transport av substrat som medieras av transportören membranproteiner. Moduleringen av transmembrana strömmen genom tillämpning av konstant spänningar eller spänning ramper tillåter bedömning av de farmakologiska och fysiska egenskaperna hos bärarna, exempelvis aktivering och hämning av substrat eller transport kinetik. Av särskilt intresse är numret för omsättning substrat, som visar mängden substrat som är flyttad av ett membranprotein per tidsenhet. Det är en viktig parameter när man jämför kineticsen av olika membranproteiner. Om inrättande av en koncentrationsgradient laddade substratets över membranet genererar en elektromotorisk kraft som omsättning antalet substratet härleds.
Med en Granulatfyllda elektrod, skapar förekomsten av klorid-fri buffert en diffusion potential som förändrar elektrod potential och leder till en förskjutning i ström-spänning mätningar2. Även om det är alltid närvarande, är försumbara för standard konduktans och kapacitet mätningar eftersom dessa parametrar är antingen beroende på lutningen på den ström-spänning inspelning (konduktans) eller är skillnaden mellan en enda inspelning (kapacitet), som avbryter potential. Inspelningen av den omvända potential som skapas genom transport av substrat, kan dock störas betydligt av diffusionen potentiella. För exakta mätningar av omvänd potential alltså elektrod potential kan hållas konstant.
Diffusionen potentiella kan minimeras genom två metoder: (i) i närvaro av en lipidens membran, har ett substrat koncentrationen ökas på ena sidan av membranet3,4, eller (ii) en salt bro balanserar elektroden potentiella 5. den första metoden är starkt beroende av stabiliteten i mätningarna. Membranet måste överleva i flera minuter, från tillägg av substrat under omrörning tills underlaget är nästan jämt fördelad i lösningen. Om membranet spricker i mellan, substrat lutningen ändras genom ett fritt utbyte av laddade molekyler och mätningar slår felaktig. Den senare metoden balanserar diffusion potentiella men begränsas av storleken på set-up. Genomföra en liten men fungerande salt bridge i micro intervallet till en Elektrofysiologisk set-up är utmanande6. För den senare metoden, saltlösningen fylls i en microcapillary spets och stabiliseras genom tillsats av agaros att förhindra spridning av saltlösningen till buffertlösningen.
I detta protokoll beskrivs en enkel produktion av en mikro-agar salt bro och genomförandet i en Elektrofysiologisk set-up baserat på pipetten set-up7 . En microcapillary spets justeras både innehåller en 3 M KCl-lösning med 1 mol % (w/v) agaros och överbrygga en Granulatfyllda elektrod och buffert lösning. Fördelen med mikro-salt bron visas tid inspelningar av elektroden potentiella skiftet och mer exakta mätningar av membranpotential som vid olika pH lutningar. I modell-systemet av rekombinanta proteiner beredas i liposomer är omsättning mitokondriell transportföretag UCP1 och UCP3 produceras under liknande förhållanden förnyad undersökning och jämfört med tidigare resultat3,8.
Genomförandet av mikro-agar salt bron med elektroden minimerar dess potentiella diffusion och tillåter mer precisa mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. I närvaro av olika transmembrana pH övertoningar, potentiella förskjutningen av båda elektroderna var acceptabelt på ΔpH = 0,35 när jämförande till det teoretiska värdet av Nernst equilibriumen potentiella (ΦNernst = 23,8 mV för ΔpH = 0,4). Men på mer Fysiologiskt pH lutningar, som för instans i mitokondrier mellan matrisen och intermembrane utrymme, standard Granulatfyllda elektroden misslyckades att exakt mäta det potentiella skiftet på ΔpH = 1 (figur 3A). Elektroden överbryggas med mikro-agar salt levereras de värden som var mycket mer jämförbara med teorin.
Diffusion potentiella kan också uppstå vid Granulatfyllda referenselektroden om buffertlösningen ändras under experimentet. Klorid-fri buffertlösning användes i experimenten sedan uncoupling protein föresloggs för att transportera kloridjoner, och pH justerades med Tris eller MES. Elektroden potential, i avsaknad av en betydande koncentration av klorid, beror främst på klorid orenheter i buffertlösningen. Dess sammansättning är oförändrad under experimenten, kommer det bara resultera i en konstant offset potential. För mätning av en absolut potentialskillnaden mellan de två elektroderna, kunde dock en enkel agar salt-bridge systemet (Ag/Granulatfyllda 3 M KCl) även användas för referenselektroden.
En mikro-agar salt bro balanserar den potentiella spridningen genom en Jämviktstiden av elektroden potentiella. För att stabilisera saltlösningen, lades 1% (w/v) agaros till förhindra blandning av saltlösningen med buffertlösningen. Salt jonerna K+ och Cl– har liknande mobiliteter i vätska och balansera elektroden potentiella. För att korrekt installera salt bron, har agar salt lösningen till vara tillräckligt värms upp att fylla den microcapillary spetsen utan eventuella luftbubblor och för att täcka Granulatfyllda elektroden. Innan ytterligare användning har elektrisk kontakt mellan salt bridge elektroden och referenselektroden skall kontrolleras. Beroende på vilken tid de salt överbryggar används, måste saltlösningen vara tillräckligt geléartad för att förhindra någon blandning av saltlösningen med bufferten. Detta är särskilt viktigt om K+ eller Cl– transportörer undersöks. Salt bron användes för en mycket kort tid och elueringen av agaros är försumbar i detta tidsintervall. En högre koncentration av agaros av upp till 5%, eller agar (3% – 5%), tillåter använder salt bron längre tid6,12.
Denna metod tillåter att fastställa transport kineticsen av membran transportör (i) med låg omsättning priser och (ii) mitokondrie proteiner av den inre membran, som knappast kan undersökas i standard patch clamp uppställningar13. Dess precision är främst beroende av omvänd potentiella mätning, vilken noggrannhet är minskade vid en låg total membran konduktans och liten koncentration övertoningar som inducerar en membranpotential nedanför bullret från inspelningen.
Med detta upplägg, mättes omsättning andelen UCP1 och UCP3 som producerats under samma förhållanden. På grund av den högre pH gradienten verkar de erhållna priserna vara mer exakt och ostörda av artefakter som följd av det mindre elektrod potentiella skiftet. Det kan användas för att ytterligare analysera och jämföra mitokondriella membranet transportörer produceras under liknande förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den österrikiska forskningsfond (P31559-B20 till E.E.P.). Författarna tackar Sarah Bardakji med utmärkta tekniska bistånd inom produktion och beredning av mus UCP1 och UCP3 i proteoliposomes.
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |