I elektrofysiologiske målinger forstyrrer tilstedeværelsen af en diffusion potentielle den præcise måling af den omvendte potentiale ved at ændre den potentielle elektrode. Ved hjælp af en mikro-agar salt bro, er betydning af diffusion potentielle minimeret, som giver mulighed for en mere præcis måling af substrat omsætning numre af rekonstitueret rekombinant Membranproteiner.
Til dato, målrette mere end 50% af alle farmakologiske stoffer transport kinetik af membranproteiner. Den elektrofysiologiske karakterisering af membran transportør proteiner fremstillet i lipid tolagede membraner er en kraftfuld, men delikat metode til vurdering af deres fysisk-kemiske, farmakologiske egenskaber. Substrat omsætning nummer er en unik parameter, der giver mulighed for sammenligning af forskellige Membranproteiner aktivitet. I en electrogenic transport skaber graduering af de omplantede substrat en membran potentiale, som direkte korrelerer til substrat omsætning sats af protein. Via sølvchloridelektrode elektroder, induceret en diffusion potentiale, også kaldet flydende junction potentielle, som ændrer elektrode potentiale og betydeligt forstyrrer præcise membran potentielle målinger. Diffusion potentielle kan minimeres ved en salt bro, som afvejer elektrode potentiale. I denne artikel, er en mikro-agar salt broen designet til at forbedre den elektrofysiologiske set-up, der bruger Mikropipetter til membran dannelse. Den saltopløsning fyldes i en microcapillary pipette tip, stabiliseret ved tilsætning af agarosegelelektroforese, og let kan monteres på en standard elektrode. Elektrode potentialet i en mikro-salt bro elektrode er mere stabil i forhold til en standard elektrode. Gennemførelsen af dette system stabiliserer elektrode potentielle og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. Ved hjælp af dette system, er proton omsætning satser mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 igen og sammenlignet med tidligere målinger.
Membranproteiner er målrettet med op til 60% af alle kendte lægemidler1. Elektrofysiologiske målinger af membranproteiner er en kraftfuld, men delikat værktøj til at analysere electrogenic transport af substrater medieret af carrier Membranproteiner. Graduering af den transmembrane aktuelle ved anvendelse af konstante spændinger eller spænding ramper giver mulighed for vurdering af de farmakologiske og fysiske egenskaber af luftfartsselskaberne, for eksempel, aktivering og hæmning af substrater eller transport kinetik. Af særlig interesse er substrat omsætning tal, der viser mængden af substrat, der er omplantes af en membran protein pr. tidsenhed. Det er en vigtig parameter, når man sammenligner kinetik af forskellige Membranproteiner. Oprettelse af en koncentration graduering af ladede underlaget på tværs af membranen genererer en elektromotoriske kraft hvorfra omsætning antallet af substratet er udledt.
Brug en AgCl-elektrode, skaber tilstedeværelsen af en klorid-fri buffer en diffusion potentiale, der ændrer elektrode potentielle og fører til et skift i nuværende spænding målinger2. Skønt altid til stede, det er ubetydelig for standard ledningsevne og -kapacitet, da disse parametre er enten afhængig af hældning af den nuværende spænding optagelse (konduktans) eller er forskellen på en enkelt optagelse (kapacitet), som annullerer potentiale. Dog kan optagelsen af den omvendte potentiale, som er lavet af transport af substrat, forstyrres betydeligt ved diffusion potentielle. Således nøjagtige målinger af den omvendte potentiale skal elektrode-potentialer holdes konstant.
Diffusion potentielle kan minimeres ved hjælp af to metoder: (i) i deltagelse af et dobbeltlag membran, har en substratkoncentrationen øges på den ene side af membranen3,4, eller (ii) en salt bro saldi elektrode potentielle 5. den første metode er meget afhængige af stabilitet i målingerne. Membranen skal overleve i flere minutter ved tilsætning af substrat under omrøring indtil substratet er næsten jævnt fordelt på løsningen. Hvis membranen bristninger i mellem, substrat gradient er ændret af den frie udveksling af ladede molekyler, og målinger Drej unøjagtige. Sidstnævnte metode saldi diffusion potentielle men er begrænset af størrelsen af set-up. Gennemføre en lille men velfungerende salt broen i en mikro spænder til en elektrofysiologiske set-up er udfordrende6. For sidstnævnte metode er den saltopløsning fyldes i et microcapillary tip og stabiliseret ved tilsætning af Agarosen at forhindre udbredelsen af den saltopløsning til stødpudeopløsning.
I denne protokol, er der beskrevet en ligetil produktion af en mikro-agar salt bro og gennemførelsen i en elektrofysiologiske set-up baseret på pipette set-up7 . Et microcapillary tip er tilpasset både til at indeholde en 3 M KCl-opløsning med 1 mol % (w/v) Agarosen og at slå bro over en AgCl-elektrode og buffer løsning. Fordelen ved den mikro-salt bro vises tidsregistreringer af elektrode potentielle Skift og de mere præcise målinger af membran potentiale på forskellige pH forløb. I modelsystemet af rekombinante proteiner fremstillet i Liposomer, er omsætning satser af mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 produceres under lignende forhold igen og i forhold til tidligere resultater3,8.
Gennemførelsen af mikro-agar salt broen med elektroden minimerer sine potentielle diffusion og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. I nærværelse af forskellige transmembrane pH forløb, de potentielle skift af begge elektroderne var acceptabel på ΔpH = 0,35 hvor sammenligner hen til den teoretiske værdi af Nernst ligevægt potentielle (ΦNernst = 23,8 mV for ΔpH = 0,4). Dog på flere fysiologiske pH forløb, som for forekomst i mitokondrierne mellem matrix og intermembrane plads, den standard AgCl-elektrode undladt at nøjagtigt måle den potentielle skift på ΔpH = 1 (fig. 3A). Elektroden bro med mikro-agar salt leveret de værdier, som var meget mere sammenlignelig med teorien.
Diffusion potentielle kan også forekomme på AgCl referenceelektrode, hvis stødpudeopløsning er ændret under eksperimentet. Chlorid-fri stødpudeopløsning blev brugt i eksperimenterne, da frakobling proteiner blev foreslået for at transportere chloridioner, og pH var justeret ved hjælp af Tris eller MES. Elektrode potentiale, i mangel af en betydelig koncentration af chlorid, afhænger først og fremmest chlorid urenheder i stødpudeopløsning. Dens sammensætning er uændret under forsøgene, vil det blot resultere i en konstant offset potentiale. Dog til måling af en absolut potentielle forskel mellem de to elektroder, kunne en simpel agar salt-bridge system (Ag/AgCl 3 M KCl) også bruges til referenceelektrode.
En mikro-agar salt bro balancerer diffusion potentielle ved en ækvilibrering af elektrode potentielle. For at stabilisere den saltopløsning, blev 1% (w/v) Agarosen tilføjet for at forhindre blanding af saltopløsning med en stødpudeopløsning. Salt ioner K+ og Cl– har lignende mobilitetsophold i væske og afveje de potentielle elektrode. Til korrekt installere salt-broen, har agar saltopløsning til opvarmes tilstrækkeligt, at fylde microcapillary spidsen uden eventuelle luftbobler og dække AgCl-elektrode. Inden yderligere forbrug har elektrisk kontakt mellem salt bro elektrode og referenceelektrode skal kontrolleres. Afhængigt af den tid det salt bridge bruges, har den saltopløsning til at være tilstrækkeligt geléagtig for at forebygge enhver sammenblanding af den saltopløsning med bufferen. Dette er især kritisk, hvis K+ eller Cl– transportvirksomheder er undersøgt. Salt broen blev brugt for meget kort tid og eluering af Agarosen er ubetydelig i dette tidsinterval. En højere koncentration af Agarosen af op til 5% eller agar (3% – 5%), giver mulighed for ved hjælp af salt broen i en længere periode af tid6,12.
Metoden tillader bestemmelse af transport kinetik af en membran transporter (i) med lav omsætning satser og (ii) af mitokondrielle proteiner i den indre membran, der næppe kunne undersøges i standard patch klemme set-ups13. Dens præcision er primært afhængig af reverse potentielle måling, hvor nøjagtighed er faldet på en lav samlede membran ledningsevne og lille koncentration forløb, som inducerer en membran potentiale under støj af optagelse.
Med dette set-up, blev omsætning satser af UCP1 og UCP3 som produceres under samme betingelser målt. På grund af den højere pH gradient synes de opnåede priser at være mere præcise og uforstyrrede af artefakter som følge af mindre elektrode potentielle Skift. Det kan bruges til yderligere analysere og sammenligne mitokondrielle membran transportvirksomheder produceres under lignende forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den østrigske forskningsfond (P31559-B20 til E.E.P.). Forfatterne takke Sarah Bardakji for den fremragende teknisk bistand i produktionen og rekonstituering af mus UCP1 og UCP3 i proteoliposomes.
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |