Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En mikro-agar Salt bro elektrode til at analysere Proton omsætning sats af rekombinant Membranproteiner

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

I elektrofysiologiske målinger forstyrrer tilstedeværelsen af en diffusion potentielle den præcise måling af den omvendte potentiale ved at ændre den potentielle elektrode. Ved hjælp af en mikro-agar salt bro, er betydning af diffusion potentielle minimeret, som giver mulighed for en mere præcis måling af substrat omsætning numre af rekonstitueret rekombinant Membranproteiner.

Abstract

Til dato, målrette mere end 50% af alle farmakologiske stoffer transport kinetik af membranproteiner. Den elektrofysiologiske karakterisering af membran transportør proteiner fremstillet i lipid tolagede membraner er en kraftfuld, men delikat metode til vurdering af deres fysisk-kemiske, farmakologiske egenskaber. Substrat omsætning nummer er en unik parameter, der giver mulighed for sammenligning af forskellige Membranproteiner aktivitet. I en electrogenic transport skaber graduering af de omplantede substrat en membran potentiale, som direkte korrelerer til substrat omsætning sats af protein. Via sølvchloridelektrode elektroder, induceret en diffusion potentiale, også kaldet flydende junction potentielle, som ændrer elektrode potentiale og betydeligt forstyrrer præcise membran potentielle målinger. Diffusion potentielle kan minimeres ved en salt bro, som afvejer elektrode potentiale. I denne artikel, er en mikro-agar salt broen designet til at forbedre den elektrofysiologiske set-up, der bruger Mikropipetter til membran dannelse. Den saltopløsning fyldes i en microcapillary pipette tip, stabiliseret ved tilsætning af agarosegelelektroforese, og let kan monteres på en standard elektrode. Elektrode potentialet i en mikro-salt bro elektrode er mere stabil i forhold til en standard elektrode. Gennemførelsen af dette system stabiliserer elektrode potentielle og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. Ved hjælp af dette system, er proton omsætning satser mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 igen og sammenlignet med tidligere målinger.

Introduction

Membranproteiner er målrettet med op til 60% af alle kendte lægemidler1. Elektrofysiologiske målinger af membranproteiner er en kraftfuld, men delikat værktøj til at analysere electrogenic transport af substrater medieret af carrier Membranproteiner. Graduering af den transmembrane aktuelle ved anvendelse af konstante spændinger eller spænding ramper giver mulighed for vurdering af de farmakologiske og fysiske egenskaber af luftfartsselskaberne, for eksempel, aktivering og hæmning af substrater eller transport kinetik. Af særlig interesse er substrat omsætning tal, der viser mængden af substrat, der er omplantes af en membran protein pr. tidsenhed. Det er en vigtig parameter, når man sammenligner kinetik af forskellige Membranproteiner. Oprettelse af en koncentration graduering af ladede underlaget på tværs af membranen genererer en elektromotoriske kraft hvorfra omsætning antallet af substratet er udledt.

Brug en AgCl-elektrode, skaber tilstedeværelsen af en klorid-fri buffer en diffusion potentiale, der ændrer elektrode potentielle og fører til et skift i nuværende spænding målinger2. Skønt altid til stede, det er ubetydelig for standard ledningsevne og -kapacitet, da disse parametre er enten afhængig af hældning af den nuværende spænding optagelse (konduktans) eller er forskellen på en enkelt optagelse (kapacitet), som annullerer potentiale. Dog kan optagelsen af den omvendte potentiale, som er lavet af transport af substrat, forstyrres betydeligt ved diffusion potentielle. Således nøjagtige målinger af den omvendte potentiale skal elektrode-potentialer holdes konstant.

Diffusion potentielle kan minimeres ved hjælp af to metoder: (i) i deltagelse af et dobbeltlag membran, har en substratkoncentrationen øges på den ene side af membranen3,4, eller (ii) en salt bro saldi elektrode potentielle 5. den første metode er meget afhængige af stabilitet i målingerne. Membranen skal overleve i flere minutter ved tilsætning af substrat under omrøring indtil substratet er næsten jævnt fordelt på løsningen. Hvis membranen bristninger i mellem, substrat gradient er ændret af den frie udveksling af ladede molekyler, og målinger Drej unøjagtige. Sidstnævnte metode saldi diffusion potentielle men er begrænset af størrelsen af set-up. Gennemføre en lille men velfungerende salt broen i en mikro spænder til en elektrofysiologiske set-up er udfordrende6. For sidstnævnte metode er den saltopløsning fyldes i et microcapillary tip og stabiliseret ved tilsætning af Agarosen at forhindre udbredelsen af den saltopløsning til stødpudeopløsning.

I denne protokol, er der beskrevet en ligetil produktion af en mikro-agar salt bro og gennemførelsen i en elektrofysiologiske set-up baseret på pipette set-up7 . Et microcapillary tip er tilpasset både til at indeholde en 3 M KCl-opløsning med 1 mol % (w/v) Agarosen og at slå bro over en AgCl-elektrode og buffer løsning. Fordelen ved den mikro-salt bro vises tidsregistreringer af elektrode potentielle Skift og de mere præcise målinger af membran potentiale på forskellige pH forløb. I modelsystemet af rekombinante proteiner fremstillet i Liposomer, er omsætning satser af mitokondrie luftfartsselskaber UCP1 og UCP3 produceres under lignende forhold igen og i forhold til tidligere resultater3,8.

Protocol

1. produktionen af rekombinant frakobling proteiner (UCPs) og dannelse af Planar tolagede membraner

  1. Producere rekombinant UCP1 og UCP3 som beskrevet af Rupprecht et al. 9 og Hilse et al. 10
  2. Udgør planar tolagede membraner på spidsen af konventionelle undværes plast pipetter, som beskrevet af Beck et al. 7

2. forberedelse af mikro-agar Salt bro elektrode

  1. Justere en microcapillary pipette tip (Se Tabel af materialer) i passende længde.
    1. Mark positionen på en tom tip som buffer-holdige spidsen vil være knyttet til og bruge en glidende caliper til at måle længden af mikro-agar salt bro elektrode.
      Forsigtig: Microcapillary spidsen skal være lang nok til at angive bufferopløsning for målingerne.
    2. Skåret microcapillary spidsen med en skarp kniv eller blade og rense snitfladen med ethanol og vand.
  2. Forberede den AgCl-beklædt elektrode.
    1. Afskære en Ag wire ca 8 cm i længden og rense det med ethanol og vand.
    2. Tag et stykke sandpapir og glat ned overfladen af 1 cm længde for enden af kablet, som skal være i kontakt med en saltopløsning.
    3. Dyppe den glattede ende i en 3 M KCl-opløsning og pels det elektrokemisk med klorid ved hjælp af en DC forsyning på 1,5 V for 10 s.
    4. Ren elektrode med vand, tør det og justere længden af AgCl-elektrode fra ubestrøget side, så det trænger microcapillary tip så dybt som muligt.
      Bemærk: Protokollen kan pause her.
  3. Forberede en 3 M KCl saltopløsning med 1% (v/v) agarosegelelektroforese.
    1. 4.47 g af KCl der afvejes og opløses i 20 mL vand ved omrøring det i en kolbe.
    2. Fjerne omrøreren, afvejes 0,2 g af agarosegelelektroforese, og tilføje det til kolben.
    3. Varme op løsning til 100 ° C for at smelte Agarosen og forhindre det i at størkne.
      Forsigtig: Kolben vil være meget varmt. Rør ikke ved det med bare hænder. Brug handsker til håndtering.
  4. Fyld microcapillary spidsen med Agarosen saltopløsning.
    Forsigtig: Løsningen er varmt. Beskytte hænder og arbejde omhyggeligt for at undgå stænk.
    1. Hvis Agarosen begynder clotting, varme op saltopløsning til fuldt smelte Agarosen igen.
    2. Suge 10 µL af agar saltopløsning ind i microcapillary spidsen. Suge det langsomt og omhyggeligt at undgå luft bobler i spidsen.
    3. Fjern spidsen fra pipetten og skubbe i AgCl-elektrode fra den bredere side af spidsen. Sikre, at elektroden trænger den saltopløsning.
    4. Køle ned elektrode til stuetemperatur og sætter det ind i forstærkeren.
  5. Forberede bufferen for målingerne.
    1. Afvejes 0.710 g Na2SO4, 0.195 g af MES, 0.121 g af TRIS og 0,023 g af EGTA, derefter tilsættes 100 mL destilleret vand til et bægerglas og opløsningen omrøres.
    2. Indskrive nemlig bufferen pH-værdi ved hjælp af en pH elektrode og justere pH-værdien til 7,32.
    3. Kontroller, at reference elektroden og agar salt bro elektrode i elektrisk kontakt.
      1. Der tilsættes 1 mL af buffer til en plastikbeholder.
      2. Dyp i referenceelektrode og agar salt bro elektrode og kontrollere et signal svar. Hvis signalet svar er korrekte, Fortsæt til trin 2.7.
  6. Hvis der er en falsk signal svar eller ingen elektrisk kontakt overhovedet, udføre den efter fejlfinding.
    1. Kontroller elektrode er i kontakt med den saltopløsning og skubbe elektroden i løsningen.
      Bemærk: Hvis løsningen er allerede alt for klistret, fjerne mikro-agar salt broen og forberede et nyt microcapillary tip.
    2. Kontrollere, om der er luftbobler i den saltopløsning. Hvis ja, forberede et nyt microcapillary tip.
    3. Kontrollere, om den saltopløsning er i kontakt med stødpudeopløsning. Hvis ikke, så afbrød en anden 1 mm tube ende af spidsen.
      Forsigtig: Sørg for at spidsen er stadig længe nok til at trænge igennem den buffer-holdige spids. Hvis der er stadig ingen kontakt, forberede et nyt microcapillary tip.
    4. Hvis ingen af disse trin hjælper, forberede et nyt microcapillary tip.
  7. Til opbevaring, dyppe agar salt bro elektrode i en 3 M KCl-opløsning.
    Bemærk: Protokollen kan standses her. For en pause natten, gemme elektroden i 3 M KCl saltopløsning ved 4 ° C.
  8. Forberede den buffer-holdige plastik tip.
    Bemærk: Hvis elektroden blev gemt natten, tage det og lad det varme op til stuetemperatur i 30 min.
    1. Tage et microcapillary tip og bøje rør, 2 cm fra kanten af den smalle del, ca. 90 grader ved hjælp af en varme ledning.
    2. Brug en meget skarp kniv eller blade og skåret ud røret omkring 5 mm fra bøje.
    3. Ren overflade for enden med ethanol og vand og måle diameter af hullet i spidsen. Fra dette, beregne området i overfladen.
    4. Coat overfladen af tip med 85:15 (v: v) hexan: hexadecane.
      1. Tilsæt 3 µL opløsningsmiddel og fjerne det fra spidsen.
      2. Vent 1 min., således at alle de resterende opløsningsmiddel i spidsen er fordampet.
    5. Fyld måling spidsen med 3 µL af buffer og sætte den ind på salt bro elektrode.
      Bemærk: Spørg igen hvis salt bro elektrode og referenceelektrode er elektrisk kontakt ved at udføre trin 2.5.3.
    6. Hvis der er ingen elektrisk kontakt, kontrollere, om følgende:
      1. Kontrollere, om salt bro elektrode er i kontakt med stødpudeopløsning. Hvis ikke, så enten øge mængden af buffer i spidsen eller forberede en længere microcapillary spids.
      2. Hvis der er en luftboble, fjerne spidsen fra mikro-salt bro elektrode, refill buffer i spidsen, og slut det til elektroden igen.

3. måling af de elektriske parametre af membranen rekonstitueres med rekombinante Protein

  1. Anvende en trekantet skiftende spænding signal med maksimal spænding Umax = 50 mV og ΔTrampe = 50 ms, hvilket skaber en rektangulær vekselstrøm svar. Fra de gennemsnitlige værdier af positive og negative strømme (+ og jeg-), beregne kapacitet af membran efter følgende formel:
    Equation 1
  2. Anvende en spænding rampe spænder fra -50 mV til + 50 mV og post aktuelt. Passer en lineær funktion til data - hældningen er ledningsevne - og beregne x-aksen skæringspunkt fit.
  3. Decharge løsning i den plastik tip og udfylde et nyt med en buffer, som indeholder en øget substratkoncentrationen.
    1. Hvis ingen membran er dannet inden for de første 20-30 s, decharge volumen og genopfylde det. Dette sikrer, at koncentration forløb på tværs af membranen ikke væsentligt ændrer under membran dannelse.
    2. Efter dannelsen af en membran, skal du udføre trin 3.1 og 3.2 igen for at bekræfte korrekte membran dannelse og at få x-aksen skæringspunkt.

4. beregning af substrat omsætningshastighed

Bemærk: Se tidligere arbejde for detaljer3,7.

  1. Vurdere mængden af protein i membran fra molekylvægt af lipid og protein (MLipid og Mproteiner), området af membranen og et lipid hoved gruppe (enmembran og etLipid) og masse forholdet mellem protein pr. lipid (r).
    Equation 2
  2. Beregne Nernst potentiale for de transporterede substrat. R er konstanten gas, T temperatur, z afgift af den transporterede substrat, F Faradays konstant, og c1 og c2 koncentrationen af substratet i begge sider af membranen.
    Equation 3
  3. Fra de nuværende spænding optagelser, tage omvendt potentielle beregnet med forskellen i x-aksen skæringspunkter fra de lineære passer i tilstedeværelse og fravær af substrat gradient.
  4. Beregne andelen af substrat ledningsevne, Gsubstrat, til den samlede membran ledningsevne, Gsamlede, af forholdet mellem omvendt potentiale til Nernst potentielle11.
    Equation 4
  5. Beregne substrat omsætning nummer ΔNsubstrat pr. gang enhed ΔT fra substrat ledningsevne (Gsubstrat), den anvendte spænding U og beregning af substrat z:
    Equation 5
  6. Beregn omsætning sats κ fra forholdet mellem transporteres substrat pr. gang til antallet af proteiner.
    Equation 6

Representative Results

For at kontrollere minimering af potentielle diffusion, blev stabiliteten af de nuværende spænding målinger af en intakt membran målt. I figur 2A, er repræsentant-aktuelle spænding optagelser afbildet i tilstedeværelse (hvide prikker) og fravær (sorte prikker) på en graduering, pH. Ifølge Nernst-ligningen inducerer pH gradient et skift i spænding. Den potentielle Skift er beregnet ud fra skæringspunktet x-aksen i en lineær passer til dataene. For at teste både elektroder, blev skift i x-aksen skæringspunkt analyseret for en standard AgCl-elektrode (figur 2B, hvide prikker) og mikro-agar salt bro (figur 2B, sorte prikker). En spænding rampe var optaget ti gange i træk og den gennemsnitlige skift i x-aksen er afbildet mod tiden. Paa agar salt bro elektrode havde en maksimal skift af mindre end 5 mV selv efter 300 sekunder af måling, den standard elektrode varierede op til 30 mV i uforudsigelige, tilfældige adfærd.

Næste, begge elektroder blev testet på forskellige pH forløb (fig. 3A). For standard elektroden, blev en pH gradient 0,35 og 1,0 (hvide prikker) genereret; agar salt bro elektrode, pH gradienter 0,35, 0,7 og 1,0 (sorte prikker). Skift i potentiale blev analyseret i tre uafhængige målinger. I modsætning til en graduering af 0,35, hvor den målte Skift kun varierer lidt, ændrer spænding Skift væsentligt på pH graduering af 1.0 i mangel af mikro-agar salt broen. Fra en lineær passer til dataene er hældningen af funktionen 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH for den standard elektrode og 50.1 ± 4,6 mV/ΔpH for mikro-agar salt bro elektrode. Ifølge Nernst-ligningen, er den beregnede potentielle Skift 60,7 mV/ΔpH til T = 32 ° C.

Ved hjælp af mikro-agar salt broen, nummeret proton omsætning blev κ af mitokondrie UCP1 og UCP3 målt og sammenlignet med tidligere målinger (fig. 3B). Svarende til figur 3A, ΔpH = 1,0 blev genereret og omvendt potentiale blev målt. Mængden af protein i membranen blev anslået ud fra formlen i afsnit 4 i protokollen, protein lipid-forhold på 4 µg / (mg af lipid), en molekylvægt 33.000, og 750 Da for proteiner og lipid, en membran areal af 3.53 x 10 -4 cm2, og et areal pr. lipid af 7,8 x 10-15 cm2. De opnåede κwas 5,56 ± 0,38 s-1 og 4,10 ± 0,71 s-1 for UCP1 og UCP3, henholdsvis (fig. 3B).

Figure 1
Figur 1 : Den elektrofysiologiske set-up med mikro-agar salt broen. (A) dette panel viser en skitse over set-up. Microcapillary spidsen indeholdende agar saltopløsning (afbildet i orange) er placeret mellem elektrode (sort) og den buffer-holdige spids (blå). Membranen er dannet på overfladen ved slutningen af den buffer-holdige spids (angivet med pilen). (B) dette panel viser et billede af den elektrofysiologiske set-up med gennemførelsen af mikro-agar salt broen. Pilene peger på elektroden, mikro-agar salt broen, referenceelektrode og container med bufferopløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligning af en mikro-agar salt bro og en standard AgCl-elektrode. (A) dette panel viser en repræsentativ nuværende spænding måling i tilstedeværelse (grå prikker) og fravær (hvide prikker) på en pH graduering af 1. Linjerne repræsenterer en lineær passer til de data, fra hvilke ledningsevne og x-aksen skæringspunktet værdier er opnået. Spænding Skift er evalueret af forskellen på skæringspunktet værdier af begge optagelser. (B) dette panel viser skift af membran potentiale i en standard AgCl-elektrode (hvide prikker) til en mikro-agar salt bro elektrode (sorte prikker) i gang. Ti aktuelle spænding målinger blev indspillet i en række og den gennemsnitlige spænding Skift ved diffusion potentielle afbildes som funktion af tiden. I alle eksperimenter, blev membranen foretaget af 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % arachidonic syre i en koncentration på 1,5 mg/mL. Bufferen, der indeholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0,6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Proton omsætning antal UCP1 og UCP3 beregnes ud fra den omvendte potentiale i overværelse af en pH gradient. (A) dette panel viser skiftet i potentialet i en UCP1-holdige membran af forskellige pH forløb af en standard AgCl-elektrode (hvide prikker) og en mikro-agar salt bro elektrode (sorte prikker). Linjerne repræsenterer en lineær passer til dataene. (B) dette panel viser proton omsætning antallet af UCP1 (første datasæt) og UCP3 (andet datasæt) som beregnet fra forholdet mellem spænding Skift til Nernst potentiale overensstemmelse med formlerne i punkt 4 i protokollen. Den første bar i hvert sæt repræsenterer omsætning satser målt med mikro-agar salt broen. Den anden søjle af hvert datasæt repræsenterer tidligere målinger ved hjælp af en standard AgCl-elektrode. Værdier for UCP1 og UCP3 blev taget fra Urbankovaet al. 3 og Macher et al. 8. alle målinger, membranen blev foretaget af 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueres med 15 mol % AA og UCP1/UCP3. Koncentrationen af lipid og protein var 1,5 mg/mL og 4 µg/mg af lipid, henholdsvis. Bufferen, der indeholdt 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS og 0,6 mM EGTA ved pH = 7.34 og T = 32 ° C. PH buffer for gradient målingerne var steget til 7,66, 8,00 eller 8.33 ved at tilføje TRIS og blev ændret i den løsning-holdige pipette. Værdierne er gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Gennemførelsen af mikro-agar salt broen med elektroden minimerer sine potentielle diffusion og giver mere præcise målinger af membran potentiale genereret af en pH gradient. I nærværelse af forskellige transmembrane pH forløb, de potentielle skift af begge elektroderne var acceptabel på ΔpH = 0,35 hvor sammenligner hen til den teoretiske værdi af Nernst ligevægt potentielle (ΦNernst = 23,8 mV for ΔpH = 0,4). Dog på flere fysiologiske pH forløb, som for forekomst i mitokondrierne mellem matrix og intermembrane plads, den standard AgCl-elektrode undladt at nøjagtigt måle den potentielle skift på ΔpH = 1 (fig. 3A). Elektroden bro med mikro-agar salt leveret de værdier, som var meget mere sammenlignelig med teorien.

Diffusion potentielle kan også forekomme på AgCl referenceelektrode, hvis stødpudeopløsning er ændret under eksperimentet. Chlorid-fri stødpudeopløsning blev brugt i eksperimenterne, da frakobling proteiner blev foreslået for at transportere chloridioner, og pH var justeret ved hjælp af Tris eller MES. Elektrode potentiale, i mangel af en betydelig koncentration af chlorid, afhænger først og fremmest chlorid urenheder i stødpudeopløsning. Dens sammensætning er uændret under forsøgene, vil det blot resultere i en konstant offset potentiale. Dog til måling af en absolut potentielle forskel mellem de to elektroder, kunne en simpel agar salt-bridge system (Ag/AgCl 3 M KCl) også bruges til referenceelektrode.

En mikro-agar salt bro balancerer diffusion potentielle ved en ækvilibrering af elektrode potentielle. For at stabilisere den saltopløsning, blev 1% (w/v) Agarosen tilføjet for at forhindre blanding af saltopløsning med en stødpudeopløsning. Salt ioner K+ og Cl- har lignende mobilitetsophold i væske og afveje de potentielle elektrode. Til korrekt installere salt-broen, har agar saltopløsning til opvarmes tilstrækkeligt, at fylde microcapillary spidsen uden eventuelle luftbobler og dække AgCl-elektrode. Inden yderligere forbrug har elektrisk kontakt mellem salt bro elektrode og referenceelektrode skal kontrolleres. Afhængigt af den tid det salt bridge bruges, har den saltopløsning til at være tilstrækkeligt geléagtig for at forebygge enhver sammenblanding af den saltopløsning med bufferen. Dette er især kritisk, hvis K+ eller Cl- transportvirksomheder er undersøgt. Salt broen blev brugt for meget kort tid og eluering af Agarosen er ubetydelig i dette tidsinterval. En højere koncentration af Agarosen af op til 5% eller agar (3% - 5%), giver mulighed for ved hjælp af salt broen i en længere periode af tid6,12.

Metoden tillader bestemmelse af transport kinetik af en membran transporter (i) med lav omsætning satser og (ii) af mitokondrielle proteiner i den indre membran, der næppe kunne undersøges i standard patch klemme set-ups13. Dens præcision er primært afhængig af reverse potentielle måling, hvor nøjagtighed er faldet på en lav samlede membran ledningsevne og lille koncentration forløb, som inducerer en membran potentiale under støj af optagelse.

Med dette set-up, blev omsætning satser af UCP1 og UCP3 som produceres under samme betingelser målt. På grund af den højere pH gradient synes de opnåede priser at være mere præcise og uforstyrrede af artefakter som følge af mindre elektrode potentielle Skift. Det kan bruges til yderligere analysere og sammenligne mitokondrielle membran transportvirksomheder produceres under lignende forhold.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den østrigske forskningsfond (P31559-B20 til E.E.P.). Forfatterne takke Sarah Bardakji for den fremragende teknisk bistand i produktionen og rekonstituering af mus UCP1 og UCP3 i proteoliposomes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
En mikro-agar Salt bro elektrode til at analysere Proton omsætning sats af rekombinant Membranproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter