Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

In elektrofysiologische metingen stoort de aanwezigheid van een potentiële verspreiding de nauwkeurige meting van het omgekeerde potentieel door een wijziging van de potentiële elektrode. Met behulp van een micro-agar zoutbrug, is de impact van de potentiële verspreiding geminimaliseerd, waardoor een nauwkeuriger meting van substraat omzet aantallen gereconstitueerde recombinante membraaneiwitten.

Abstract

Tot op heden richten meer dan 50% van alle farmacologische drugs de vervoer-kinetiek van membraaneiwitten. Het elektrofysiologische karakterisering van membraaneiwitten vervoerder gereconstitueerd in lipide dubbelgelaagde membranen is een krachtige maar gevoelige methode voor de beoordeling van de fysisch-chemische en farmacologische eigenschappen. Het substraat omzet nummer is een unieke parameter waarmee de vergelijking van de activiteit van verschillende membraaneiwitten. In een electrogenic-vervoer creëert het verloop van het translocated substraat een membraanpotentiaal die direct met de Verwerkingsfrequentie van substraat van het eiwit correleert. Met behulp van zilverchloride elektroden, wordt een diffusie potentieel, een afkorting voor vloeibare kruising potentieel, veroorzaakt, die verandert elektrode potentieel en aanzienlijk verstoort precieze membraan potentiële metingen. Mogelijke verspreiding kan worden geminimaliseerd door een zoutbrug, die elektrode potentieel balanceert. In dit artikel wordt is een zoutbrug micro-agar ontworpen ter verbetering van het elektrofysiologische set-up, die gebruik maakt van micropipetten voor de vorming van het membraan. Het zout oplossing wordt in een microcapillary Pipetteer tip, gestabiliseerd door de toevoeging van agarose, afgevuld en kan eenvoudig worden gemonteerd op een standaard-elektrode. Het potentieel van de elektrode van een micro-zout brug elektrode is stabieler in vergelijking met een standaard-elektrode. De implementatie van dit systeem elektrode potentiële stabiliseert en laat meer nauwkeurige metingen van de membraanpotentiaal gegenereerd door een pH verloop. Met behulp van dit systeem, zijn de proton omzet tarieven van de mitochondriale vervoerders, UCP1 en UCP3 onderworpen en in vergelijking met eerdere metingen.

Introduction

Membraaneiwitten zijn doelwit van maximaal 60% van alle bekende farmaceutische geneesmiddelen1. Elektrofysiologische metingen van membraaneiwitten zijn een krachtige maar gevoelige instrument om het analyseren van het electrogenic vervoer van substraten gemedieerd door vervoerder membraaneiwitten. De modulatie van de transmembrane stroom door de toepassing van constante spanningen of spanning hellingen kunt beoordelen van de farmacologische en fysische eigenschappen van de vervoerders, bijvoorbeeld, de activering en de remming door substraten of het vervoer kinetiek. Van bijzonder belang is het substraat omzet nummer, waarin de hoeveelheid substraat dat is translocated door een membraan eiwit per tijdseenheid. Het is een belangrijke parameter bij het vergelijken van de kinetiek van de verschillende membraaneiwitten. Tot oprichting van een gradiënt van de concentratie van het geladen substraat over het membraan genereert een elektromotorische kracht waaruit het nummer van de omzet van het substraat wordt afgeleid.

Met behulp van een AgCl-elektrode, creëert de aanwezigheid van een buffer chloride-vrije een diffusie-potentieel dat verandert elektrode potentiële en leidt tot een verschuiving van stroom-spanning-metingen2. Hoewel altijd aanwezig is, is het te verwaarlozen voor standaard geleidingsvermogen en capaciteit metingen omdat deze parameters zijn afhankelijk van de helling van de stroom-spanning-opname (geleidbaarheid) of zijn het verschil van een enkele opname (capaciteit), die Hiermee annuleert u het potentieel. Echter, de opname van het omgekeerde potentieel, dat door het vervoer van substraat is gemaakt, kan aanzienlijk worden verstoord door de potentiële verspreiding. Dus, voor nauwkeurige metingen van het omgekeerde potentieel, het potentieel van de elektrode moeten constant worden gehouden.

De potentiële verspreiding kan worden geminimaliseerd door twee methoden: (i) in aanwezigheid van een dubbelgelaagde membraan, een substraat-concentratie moet worden verhoogd aan de ene kant van het membraan3,4, of (ii) een zoutbrug balanceert de elektrode potentiële 5. de eerste methode is sterk afhankelijk van de stabiliteit van de metingen. Het membraan heeft om te overleven voor enkele minuten, uit de toevoeging van substraat onder roeren totdat het substraat is bijna gelijk verdeeld over de oplossing. Als het membraan tussendoor breuken, het verloop van het substraat wordt gewijzigd door de vrije uitwisseling van geladen moleculen, en metingen schakelt onjuist. De laatste methode saldi van de potentiële verspreiding maar wordt beperkt door de grootte van de set-up. Uitvoering van een klein maar werking zoutbrug in een micro bereik tot een elektrofysiologische set-up is uitdagend6. Voor de laatste methode, is het zout oplossing in een microcapillary tip afgevuld en gestabiliseerd door de toevoeging van agarose ter voorkoming van verspreiding van het zout oplossing aan de bufferoplossing.

In dit protocol, wordt een eenvoudige productie van een micro-agar zoutbrug en uitvoering in een elektrofysiologische set-up op basis van de pipet set-up7 beschreven. Een tip van microcapillary wordt aangepast naar een 3 M KCl oplossing met 1 mol % (m/v) agarose bevatten zowel te overbruggen een AgCl-elektrode en buffer-oplossing. Het voordeel van de brug van de micro-zout wordt weergegeven door tijd-opnamen van de potentiële verschuiving van de elektrode en de exacte afmetingen van de membraanpotentiaal op verschillende pH verlopen. In het modelsysteem van recombinante eiwitten gereconstitueerd in liposomen, zijn de tarieven van de omzet van mitochondriale vervoerders, UCP1 en UCP3 geproduceerd onder soortgelijke voorwaarden onderworpen en in vergelijking met vorige resultaten3,8.

Protocol

1. productie van recombinante afkoppelen eiwitten (UCPs) en de vorming van vlakke dubbelgelaagde membranen

  1. Productie van recombinante UCP1 en UCP3 zoals beschreven door Rupprecht et al. 9 en Hilse et al. 10
  2. Vormen van vlakke dubbelgelaagde membranen op de toppen van conventionele overbodig plastic pipetten, zoals beschreven door Beck et al. 7

2. voorbereiding van de Micro-agar zout Bridge-elektrode

  1. Aanpassen van een pipet microcapillary tip (Zie Tabel van materialen) om de juiste lengte.
    1. Markeer de plaats op een lege tip waartegen de buffer-bevattende tip zal worden gehecht aan en een glijdende remklauw gebruiken voor het meten van de lengte van de micro-agar zoutbrug elektrode.
      Let op: Het microcapillary uiteinde moet lang genoeg om de bufferoplossing voor de metingen.
    2. Knip het uiteinde van de microcapillary met een scherp mes of blade en het snijvlak met ethanol en water schoon.
  2. Bereiden de AgCl beklede elektrode.
    1. Een Ag draad van ongeveer 8 cm in lengte afgesneden en schoon met ethanol en water.
    2. Neem een stukje schuurpapier en glad naar beneden het oppervlak van de lengte van 1 cm aan het einde van de draad, die in contact met het zout oplossing moet.
    3. Dompel de afgevlakte einde in een 3 M KCl oplossing en jas het elektrochemisch met chloride met behulp van een DC-aanbod op 1,5 V voor 10 s.
    4. De elektrode met water schoon en droog het aanpassen van de lengte van de AgCl-elektrode van de ongecoate kant, zodat het dringt door in de microcapillary tip zo diep mogelijk.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  3. Bereid een 3 M KCl zout oplossing met 1% (v/v) agarose.
    1. Weeg 4,47 g van KCl en los het door het roeren in een maatkolf van 20 ml water.
    2. Verwijderen van de roerder, weeg 0.2 g van agarose en toe te voegen aan de kolf.
    3. De oplossing tot 100 ° C verwarmen om te smelten de agarose en bloedstolling voorkomen.
      Let op: De kolf zullen erg warm. Raak het niet met blote handen. Gebruik handschoenen voor behandeling.
  4. Vul de microcapillary tip met het agarose zout oplossing.
    Let op: De oplossing is warm. Bescherm handen en werk zorgvuldig om te voorkomen dat spatten.
    1. Als de agarose stolling begint, opwarmen het zout oplossing volledig smelten de agarose opnieuw.
    2. Geniet van 10 µL van de agar zout oplossing in de microcapillary tip. Geniet van het langzaam en zorgvuldig om te voorkomen dat de lucht bubbels in de tip.
    3. Verwijderen van het uiteinde van de pipet en druk in de AgCl-elektrode van de bredere kant van de tip. Zorg ervoor dat de elektrode het zout oplossing doordringt.
    4. De elektrode tot kamertemperatuur afkoelen en sluit deze aan op de versterker.
  5. Stel in de buffer voor de meting.
    1. Weeg 0.710 g van nb2SO4, 0,195 g mes, 0.121 g van TRIS en 0.023 g EGTA, dan toevoegen van 100 mL gedestilleerd water in een bekerglas en roer de oplossing.
    2. Controleer voor de waarde van de pH van de buffer met behulp van een pH-elektrode en pas de pH-waarde tot 7.32.
    3. Controleer of de referentie-elektrode en de agar zoutbrug elektrode in elektrisch contact.
      1. Voeg 1 mL buffer tot een plastic container.
      2. Duik in de referentie-elektrode en de agar zoutbrug elektrode en controleren op de reactie van een signaal. Als het signaal antwoord juist is, gaat u verder met stap 2.7.
  6. Als er een reactie van de valse signaal of geen elektrisch contact helemaal is, voert u de volgende procedure voor probleemoplossing.
    1. Controleren of de elektrode in contact met het zout oplossing is en druk op de elektrode in de oplossing.
      Opmerking: Als de oplossing al te plakkerig is, verwijderen van de micro-agar zoutbrug en voorbereiden van een nieuwe microcapillary-tip.
    2. Controleer of er luchtbellen in het zout oplossing. Zo ja, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.
    3. Controleer of het zout oplossing in contact met de bufferoplossing is. Als dat niet het geval is, dan een ander 1 mm van het einde van de buis van de tip afgesneden.
      Let op: Zorg ervoor dat de tip nog lang genoeg om te penetreren de buffer-bevattende tip is. Als er nog steeds geen contact is, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.
    4. Als geen van deze stappen helpen, bereiden een nieuwe microcapillary-tip.
  7. Dompel de agar zoutbrug elektrode in een 3 M KCl oplossing voor opslag.
    Opmerking: Het protocol kan hier gestopt worden. Voor een pauze 's nachts, slaan de elektrode in 3 M KCl zoutoplossing bij 4 ° C.
  8. De buffer-bevattende plastic tip voor te bereiden.
    Opmerking: Als de elektrode 's nachts opgeslagen was, neem het uit en laat het warmte tot kamertemperatuur voor 30 min.
    1. Neem een microcapillary tip en buigen van de buis, 2 cm van de rand van het nauwe gedeelte, ongeveer 90 graden met behulp van een draad van de verwarming.
    2. Een zeer scherp mes of mes gebruiken en afgesneden van de buis ongeveer 5 mm uit de bocht.
    3. Reinig het oppervlak aan het eind met ethanol en water en meten van de diameter van het gat van de tip. Bereken de oppervlakte van het oppervlak van dit.
    4. Coat het oppervlak van het uiteinde met 85:15 (v: v) hexaan: hexadecane.
      1. Pipetteer 3 µL van het oplosmiddel en het verwijderen van de tip.
      2. 1 min wachten zodat al het resterende oplosmiddel in de tip is verdampt.
    5. Vul de tip voor het meten met 3 µL van buffer en sluit deze op de elektrode zoutbrug.
      Opmerking: Controleer opnieuw als de zoutbrug elektrode en de referentie-elektrode in elektrisch contact door het uitvoeren van stap 2.5.3.
    6. Als er geen elektrische contact is, Controleer de volgende punten:
      1. Controleer of de elektrode zoutbrug in contact met de bufferoplossing is. Als dat niet het geval is, dan Verhoog het volume van de buffer in de tip of een langere microcapillary tip voor te bereiden.
      2. Als er een luchtbel, verwijderen van de tip van de micro-zout brug elektrode, vullen de buffer in de tip, en steek de stekker in de elektrode opnieuw.

3. meting van de elektrische Parameters van het membraan gereconstitueerd met Recombinant eiwit

  1. Toepassing van een driehoekige afwisselend spanning signaal met maximale spanning Umax = 50 mV en ΔToprit = 50 ms, waardoor een rechthoekige wisselstroom-reactie. Bereken uit de gemiddelde waarden van de positieve en negatieve stromingen (I+ en ik-), de capaciteit van het membraan volgens de volgende formule:
    Equation 1
  2. Toepassing van een spanning helling variërend van -50 mV tot + 50 mV en de huidige record. Past een lineaire functie met de gegevens - de helling is de geleidbaarheid - en bereken het snijpunt van de x-as van de pasvorm.
  3. De oplossing in het kunststof uiteinde te ontladen en vullen van een nieuwe transactie met een buffer met een verhoogde substraat concentratie.
    1. Als geen membraan wordt gevormd binnen de eerste 20-30-s, het volume te ontladen en vullen het. Dit garandeert dat het verloop van de concentratie over het membraan aanzienlijk niet tijdens de vorming van het membraan verandert.
    2. Na de vorming van een membraan, voert u stap 3.1 en 3.2 opnieuw om te controleren of de vorming van de juiste membraan en om het snijpunt van de x-as.

4. berekening van het percentage van de omzet substraat

Opmerking: Zie vorige werk voor details3,7.

  1. Schatting van de hoeveelheid eiwitten in het membraan van de moleculaire massa van lipide en eiwit (Mlipide en M-eiwit), het gebied van het membraan en een lipide hoofd groep (eenmembraan en eenlipide) en de massaverhouding van het eiwit per lipide (r).
    Equation 2
  2. Bereken de potentiële voor de vervoerde substraat Nernst. R is de gasconstante, T de temperatuur, z de lading van het vervoerde substraat, F van de Faraday constant, en c1 en c2 de concentraties van het substraat van beide zijden van de membraan.
    Equation 3
  3. Uit de stroom-spanning-opnamen, nemen de omgekeerde potentiële berekend met het verschil tussen de snijpunten van de x-as van de lineaire past in de aanwezigheid en de afwezigheid van het verloop van het substraat.
  4. Bereken het percentage van substraat geleidingsvermogen, Gsubstraat, tot de totale membraan geleidingsvermogen, Gtotale, door de verhouding van omgekeerde potentieel Nernst potentiële11.
    Equation 4
  5. Berekenen van het substraat omzet nummer ΔNsubstraat per tijd eenheid ΔT van het substraat geleidbaarheid (Gsubstraat), de toegepaste spanning U en de lading van het substraat-z:
    Equation 5
  6. Bereken uit de verhouding van vervoerde substraat per keer aan het aantal eiwitten, de omzet tarief κ.
    Equation 6

Representative Results

Om te controleren of de minimalisering van de potentiële verspreiding, werd de stabiliteit van de stroom-spanning-metingen van een intact membraan gemeten. In Figuur 2,zijn vertegenwoordiger-stroom-spanning-opnamen afgebeeld in (witte puntjes) als zonder (zwarte puntjes) van een pH verloop. Volgens de vergelijking van Nernst induceert de pH verloop een verschuiving van spanning. Uit de x-as snijpunt van een lineaire aanpassen aan de gegevens, wordt de mogelijke verschuiving berekend. Om te testen beide elektroden, was de verschuiving in het snijpunt van de x-as geanalyseerd voor een standaard AgCl-elektrode (Figuur 2B; witte stippen) en een zoutbrug micro-agar (Figuur 2B; zwarte stippen). Een spanning helling tien keer werd opgenomen in een rij en de gemiddelde verschuiving in de x-as wordt afgebeeld tegen de klok. Overwegende dat de agar zoutbrug elektrode had een maximale verschuiving van minder dan 5 mV zelfs na 300 seconden van de meting, de standaard elektrode gevarieerd maximaal 30 mV in onvoorspelbare, random, gedrag.

Vervolgens werden beide elektroden getest op verschillende pH verlopen (Figuur 3A). Voor de standaard-elektrode, is een pH verloop van 0.35 en 1.0 (witte puntjes) gegenereerd; voor de agar zoutbrug elektrode, pH gradiënten van 0.35, 0.7 en 1.0 (zwarte puntjes). De verschuiving van potentieel werd geanalyseerd in drie onafhankelijke metingen. In tegenstelling tot een helling van 0.35, waar de gemeten verschuiving alleen enigszins verschilt, wijzigt de spanning verschuiving aanzienlijk op het verloop van de pH voor 1.0 in de afwezigheid van de micro-agar zoutbrug. Van een lineaire aanpassen aan de gegevens is de helling van de functie 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH voor de standaard elektrode en 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH voor de elektrode micro-agar zoutbrug. Volgens de Nernst-vergelijking, is de berekende potentiële verschuiving 60.7 mV/ΔpH op T = 32 ° C.

Met behulp van de micro-agar zoutbrug, het proton omzet nummer, werd κ, van mitochondriale UCP1 en UCP3 gemeten en vergeleken met eerdere metingen (Figuur 3B). Vergelijkbaar met Figuur 3A, ΔpH = 1.0 werd gegenereerd en het omgekeerde potentieel werd gemeten. De hoeveelheid eiwitten in het membraan was geraamd volgens de formule bedoeld in deel 4 van het protocol, met een eiwit lipide/ratio van 4 µg / (mg van lipide), een molecuulmassa van 33.000 en 750 Da voor de eiwitten en lipiden, de oppervlakte van een membraan van 3.53 x 10 -4 cm2inwoners en een oppervlakte per lipide van 7,8 x 10-15 cm2. De verkregen κwas 5,56 ± 0.38 s-1 en 4,10 ± 0.71 s-1 voor UCP1 en UCP3, respectievelijk (Figuur 3B).

Figure 1
Figuur 1 : Het elektrofysiologische set-up met de micro-agar zoutbrug. (A) dit paneel toont een schets van de set-up. Het uiteinde van de microcapillary met de agar-zoutoplossing (afgebeeld in oranje) wordt geplaatst tussen de elektrode (zwart) en de buffer-bevattende tip (blauw). Het membraan is gevormd aan de oppervlakte aan het einde van de buffer-bevattende tip (aangegeven door de pijl). (B) dit deelvenster bevat een afbeelding van het elektrofysiologische set-up met de uitvoering van de micro-agar zoutbrug. De pijlen wijzen naar de elektrode, de micro-agar zoutbrug, de referentie-elektrode en de container met bufferoplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : De vergelijking van een zoutbrug micro-agar en een standaard AgCl-elektrode. (A) dit paneel toont een representatieve stroom-spanning meten in de aanwezigheid (grijze stippen) en gebrek aan (witte stippen) de gradiënt van een pH van 1. De lijnen geven een lineaire pasvorm aan de gegevens, welke geleidbaarheid en de x-as snijpunt waarden zijn verkregen. De verschuiving van spanning wordt geëvalueerd door het verschil tussen de waarden van het snijpunt van beide opnames. (B) dit paneel toont de verschuiving van de membraan potentieel van een standaard AgCl-elektrode (witte puntjes) tot een micro-agar zoutbrug elektrode (zwarte puntjes) in tijd. Tien stroom-spanning-metingen werden opgenomen in een rij en de verschuiving van de gemiddelde spanning door diffusie potentiële wordt uitgezet tegen de tijd. In alle experimenten, is het membraan gemaakt van 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL gereconstitueerd met 15 mol % arachidonzuur bij een concentratie van 1,5 mg/mL. De buffer bevat 50 mM nb2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS en 0,6 mM EGTA bij pH = 7.34 en T = 32 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Proton omzet aantal UCP1 en UCP3 berekend op basis van het omgekeerde potentieel in de aanwezigheid van een pH verloop. (A) dit paneel toont de verschuiving in potentieel van een UCP1-bevattende membraan van verschillende pH gradiënten van een standaard AgCl-elektrode (witte stippen) en een zoutbrug micro-agar-elektrode (zwarte puntjes). De lijnen geven een lineaire pasvorm aan de gegevens. (B) dit paneel toont het proton omzet aantal UCP1 (eerste gegevensset) en UCP3 (tweede gegevensverzameling) zo berekend op basis van de verhouding van spanning verschuiving Nernst potentieel berekend volgens de formules in punt 4 van het protocol. De eerste balk van elke set geeft omzet tarieven gemeten met de micro-agar zoutbrug. De tweede staaf van elke gegevensset vertegenwoordigt eerdere metingen met behulp van een standaard AgCl-elektrode. Waarden voor UCP1 en UCP3 werden gehaald uit Urbankovaet al. 3 en Macher et al. 8. in alle maten, het membraan is gemaakt van 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL gereconstitueerd met 15 mol % AA en UCP1/UCP3. De concentratie van lipiden en eiwitten was 1,5 mg/mL en 4 µg/mg van lipide, respectievelijk. De buffer bevat 50 mM nb2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS en 0,6 mM EGTA bij pH = 7.34 en T = 32 ° C. De pH van de buffer voor de kleurovergang metingen werd verhoogd tot 7.66, 8,00 of 8.33 door toevoeging van TRIS en werd veranderd in de oplossing-bevattende pipet. De waarden zijn de gemiddelde ± standaardafwijking van drie onafhankelijke metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De uitvoering van de micro-agar Zoutbrug met de elektrode minimaliseert de potentiële verspreiding en kunt meer nauwkeurige metingen van de membraanpotentiaal gegenereerd door een pH verloop. In aanwezigheid van verschillende transmembraan pH verlopen, de mogelijke verschuiving van beide elektroden was aanvaardbaar op ΔpH = 0,35 wanneer het vergelijken bij de theoretische waarde van het potentiële Nernst-evenwicht (ΦNernst 23,8 = mV voor ΔpH = 0,4). Echter bij meer fysiologische pH verlopen, als voor aanleg in mitochondriën tussen de matrix en intermembrane ruimte, de standaard AgCl-elektrode niet precies meten de mogelijke verschuiving op ΔpH = 1 (Figuur 3A). De elektrode overbrugd met micro-agar zout geleverd de waarden die veel meer vergelijkbaar met de theorie waren.

Potentiële verspreiding kan ook optreden bij de AgCl-elektrode als bufferoplossing wordt gewijzigd tijdens het experiment. Chloride-vrije bufferoplossing werd gebruikt in de experimenten omdat ontkoppelingseiwit eiwitten werden voorgesteld voor het vervoer van chloride-ionen en de pH werd aangepast met behulp van Tris of MES. De elektrode potentiële, bij gebrek aan een aanzienlijke concentratie chloride, is voornamelijk afhankelijk van chloride onzuiverheden in de bufferoplossing. Als de samenstelling ongewijzigd tijdens de experimenten is, zal het simpelweg resulteren in een constante offset potentieel. Voor de meting van een absolute mogelijke verschil tussen de twee elektroden, kan een eenvoudige agar zout-brug systeem (Ag/AgCl 3 M KCl) echter ook worden gebruikt voor de referentie-elektrode.

Een micro-agar zoutbrug balanceert de potentiële verspreiding door een evenwichtsinstelling van de potentiële elektrode. Om te stabiliseren de zoutoplossing, is 1% (m/v) agarose toegevoegd om te voorkomen dat het mengen van het zout oplossing met de bufferoplossing. Het zout ionen K+ en Cl- hebben soortgelijke mobiliteiten in vloeistof en evenwicht van de potentiële elektrode. Als u wilt goed installeren de zoutbrug, moet de agar zoutoplossing worden voldoende opgewarmd te vullen de microcapillary tip zonder alle luchtbellen en ter dekking van de AgCl-elektrode. Voor verder gebruik moet elektrisch contact tussen de zoutbrug elektrode en de referentie-elektrode worden gecontroleerd. Afhankelijk van de tijd die de zoutbrug wordt gebruikt, moet de zoutoplossing worden voldoende gegeleerde om een vermenging van de zoutoplossing met de buffer te voorkomen. Dit is vooral essentieel als K+ of Cl- transporteurs worden onderzocht. De zoutbrug werd gebruikt voor een zeer korte tijd en de elutie van agarose is te verwaarlozen in deze periode. Een hogere concentratie van agarose van maximaal 5%, of agar (3% - 5%), kan met behulp van de zoutbrug voor een langere periode van tijd6,12.

Met deze methode kunt bepalen van de kinetiek van het vervoer van een membraan transportwagen (i) met lage omzet tarieven en (ii) van mitochondriale proteïnen van de binnenste membraan, dat nauwelijks in standaard patch klem set-ups13kunnen worden onderzocht. De precisie is voornamelijk afhankelijk van de omgekeerde potentiële meting, welke nauwkeurigheid bij een lage totale membraan geleidingsvermogen en kleine concentratie kleurovergangen die ertoe een membraanpotentiaal onder het geluid van de opname bewegen is afgenomen.

Met deze set-up, werden de tarieven van de omzet van UCP1 en UCP3 zoals geproduceerd onder dezelfde voorwaarden gemeten. Als gevolg van de hogere pH verloop, de verkregen tarieven lijken te zijn meer precieze en onverstoorbaar door artefacten als gevolg van de kleine elektrode potentiële verschuiving. Het kan worden gebruikt om verder te analyseren en vergelijken van de mitochondriale membraan vervoerders geproduceerd onder vergelijkbare omstandigheden.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Oostenrijkse onderzoeksfonds (P31559-B20 te E.E.P.). De auteurs Sarah Bardakji bedanken voor de uitstekende technische bijstand in de productie en reconstructie van muis UCP1 en UCP3 in proteoliposomes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
Een Micro-agar zout Bridge-elektrode voor het analyseren van de Proton Verwerkingsfrequentie van recombinante membraaneiwitten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter