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Neuroscience

Une électrode de pont de sel Micro-agar pour analyser le taux de rotation du Proton des protéines membranaires Recombinant

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

Dans des mesures électrophysiologiques, la présence d’une potentiel de diffusion perturbe la mesure précise du potentiel inverse en modifiant le potentiel de l’électrode. À l’aide d’un pont de sel micro-agar, l’impact de la diffusion potentielle est réduite, ce qui permet une mesure plus précise des nombres de chiffre d’affaires de substrat des protéines membranaires recombinant reconstitué.

Abstract

A ce jour, plus de 50 % de toutes les drogues pharmacologiques ciblent la cinétique du transport des protéines membranaires. La caractérisation électrophysiologique des protéines porteuses de membrane reconstituée dans les membranes de bicouche lipidique est une méthode puissante mais délicate pour l’évaluation de leurs propriétés physico-chimiques et pharmacologiques. Le nombre de chiffre d’affaires de substrat est un paramètre unique qui permet la comparaison de l’activité des protéines membranaires différents. Dans un transport électrogène, le gradient du substrat transloqué crée un potentiel de membrane directement corrélé au taux de chiffre d’affaires de substrat de la protéine. En utilisant des électrodes de chlorure d’argent, un potentiel de diffusion, également appelé jonction liquide potentielle, est induit, qui altère le potentiel de l’électrode et perturbe considérablement mesures potentielles de membrane précis. Potentiel de diffusion peut être minimisée par un pont salin, qui équilibre le potentiel de l’électrode. Dans cet article, un pont de sel micro-agar est conçu pour améliorer la mise en place électrophysiologique, qui utilise des micropipettes pour la formation de la membrane. La solution saline est remplie dans un cône de pipette microcapillaire, stabilisé par l’ajout d’agarose et peut être facilement montée sur une électrode standard. Le potentiel de l’électrode d’une électrode de pont micro-sel est plus stable par rapport à une électrode standard. La mise en œuvre de ce système stabilise le potentiel de l’électrode et permet des mesures plus précises du potentiel membranaire généré par un gradient de pH. Grâce à ce système, le taux de rotation du proton des transporteurs mitochondries UCP1 et UCP3 est réétudié et par rapport aux mesures précédentes.

Introduction

Les protéines membranaires sont ciblés par jusqu'à 60 % de tous les médicaments pharmaceutiques connus1. Des mesures électrophysiologiques des protéines membranaires sont un outil puissant mais délicat à analyser le transport électrogène des substrats médiée par les protéines porteuses de membrane. La modulation du courant par l’application de tensions constantes ou rampes de tension transmembranaire permet d’évaluer les propriétés pharmacologiques et physiques des transporteurs, par exemple, l’activation et inhibition par le substrat ou le transport cinétique. D’un intérêt particulier est le nombre de chiffre d’affaires de substrat, qui affiche la quantité de substrat qui est transloqué par une protéine de la membrane par unité de temps. C’est un paramètre majeur lors de la comparaison de la cinétique de diverses protéines de la membrane. Création d’un gradient de concentration du substrat chargé à travers la membrane génère une force électromotrice dont est déduit le nombre de chiffre d’affaires du substrat.

En utilisant une électrode de AgCl, la présence d’un tampon sans chlorure crée un potentiel de diffusion qui altère le potentiel de l’électrode et conduit à un changement dans les mesures de courant-tension2. Bien que toujours présente, elle est négligeable pour les mesures de capacité et de conductance standard étant donné que ces paramètres sont soit dépend de la pente de l’enregistrement courant-tension (conductance) ou la différence d’un seul enregistrement (capacité), qui annule le potentiel. Toutefois, l’enregistrement du potentiel inverse, qui est créé par le transport du substrat, peut être considérablement perturbée par la diffusion potentielle. Ainsi, pour obtenir des mesures exactes du potentiel inverse, les potentiels d’électrode doivent être maintenue constante.

La diffusion potentielle peut être minimisée par deux méthodes : (i) en présence d’une membrane bi-couche, une concentration de substrat doit être augmenté d’un côté de la membrane3,4, ou (ii) un pont de sel équilibre le potentiel de l’électrode 5. la première méthode est fortement tributaire de la stabilité des mesures. La membrane doit survivre pendant plusieurs minutes, de l’addition du substrat sous en remuant jusqu'à ce que le substrat est presque également réparti dans la solution. Si la membrane se rompt dans l’intervalle, le gradient de substrat est altéré par le libre échange des molécules chargées et mesures tourner inexactes. Cette dernière méthode soldes la diffusion potentielle mais est limitée par la taille de l’installation. Mise en œuvre d’une petite mais fonctionnement pont salin dans une gamme de micro à un montage électrophysiologique est difficile6. Pour cette dernière méthode, la solution saline est remplie dans une extrémité microcapillaire et stabilisée par l’ajout d’agarose pour empêcher la diffusion de la solution saline à la solution tampon.

Dans ce protocole, une production directe d’un micro-agar pont salin et la mise en œuvre dans un montage électrophysiologique basé sur la mise en place de pipette7 est décrite. Une astuce microcapillaire est ajustée pour contenir une solution de KCl 3m avec 1 mol % (p/v) d’agarose et de combler une solution d’électrode et de la mémoire tampon de AgCl. L’avantage du pont micro-sel est affiché par les enregistrements de temps de changement potentiel de l’électrode et des mesures plus précises de membrane potentielle à différents gradients de pH. Dans le système de modèle de protéines recombinantes reconstituée dans des liposomes, le taux de roulement des transporteurs mitochondries UCP1 et UCP3 produites dans des conditions similaires est réexaminés et par rapport aux précédents résultats3,8.

Protocol

1. la production de protéines recombinantes dételage de la remorque (UCPs) et la Formation de Membranes planes bicouche

  1. Produit recombinant UCP1 et UCP3 décrits par Rupprecht et al. 9 et Hilse et al. 10
  2. Former les membranes planes bicouche sur les pointes des pipettes en plastique jetables classiques tel que décrit par Beck et al. 7

2. préparation de l’électrode de pont de sel Micro-agar

  1. Ajuster une pipette microcapillaire astuce (voir Table des matières) à la longueur appropriée.
    1. Marquer la position sur une vide pointe au cours de laquelle l’extrémité contenant du tampon sera attaché à un étrier coulissant permet de mesurer la longueur de l’électrode de micro-agar pont salin.
      Attention : La pointe microcapillaire doit être suffisamment longue pour entrer dans la solution tampon pour les mesures.
    2. Couper la pointe microcapillaire avec un couteau ou une lame et nettoyer la surface coupée à l’eau et l’éthanol.
  2. Préparer l’électrode enduit de AgCl.
    1. Couper un fil Ag d’environ 8 cm de longueur et nettoyez-le à l’eau et l’éthanol.
    2. Prenez un morceau de papier de verre et lissent la surface de 1 cm de longueur à l’extrémité du fil, qui devrait être en contact avec la solution saline.
    3. Trempez l’extrémité lissée dans une solution de KCl 3M et l’enduire électrochimiquement chlorurées en utilisant une alimentation DC à 1,5 V pour 10 s.
    4. Nettoyer l’électrode avec de l’eau, sécher et ajuster la longueur de l’électrode de AgCl du côté non revêtu, afin qu’elle pénètre la pointe microcapillaire aussi profondément que possible.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
  3. Préparer une solution de sel de KCl 3m avec agarose à 1 % (v/v).
    1. Peser avec 4,47 g de KCl et dissoudre dans 20 mL d’eau en remuant dans une fiole.
    2. Enlever l’agitateur, peser 0,2 g d’agarose et ajoutez-le dans le ballon.
    3. Chauffer la solution à 100 ° C pour faire fondre l’agarose et empêchez-le de coagulation.
      Attention : Le ballon sera très chaud. Ne pas toucher avec les mains nues. Utiliser des gants pour la manutention.
  4. Remplir la pointe microcapillaire avec la solution de sel d’agarose.
    Attention : La solution est chaude. Protéger les mains et le travail avec précaution pour éviter les éclaboussures.
    1. Si l’agarose commence la coagulation, chauffer la solution de sel entièrement fondre l’agarose à nouveau.
    2. Imbiber la pointe microcapillaire de 10 µL de la solution saline gélose. Faire tremper lentement et avec précaution pour éviter l’air des bulles dans la pointe.
    3. Retirez l’embout de la pipette et l’électrode de AgCl pousser sur le côté plus large de la pointe. S’assurer que l’électrode pénètre dans la solution saline.
    4. Refroidir l’électrode à la température ambiante et branchez-le sur l’amplificateur.
  5. Préparer le tampon pour les mesures.
    1. Peser avec 0,710 g de Na2SO4, 0,195 g du MES, 0,121 g de TRIS et de 0,023 g de EGTA, puis ajouter 100 mL d’eau distillée dans un bécher et agiter la solution.
    2. Vérifier le pH physiologique de la mémoire tampon en utilisant une électrode de pH et ajuster le pH à 7,32.
    3. Vérifier que l’électrode de référence et l’électrode de pont salin agar sont en contact électrique.
      1. Ajouter 1 mL de tampon dans un récipient en plastique.
      2. Trempez-les dans l’électrode de référence et l’électrode de pont salin agar et vérifier une réponse de signal. Si la réponse de signal est correcte, passez à l’étape 2.7.
  6. S’il y a une réponse signal erroné ou pas de contact électrique du tout, effectuer le dépannage suivant.
    1. Vérifiez si l’électrode est en contact avec la solution saline et pousser l’électrode dans la solution.
      Remarque : Si la solution est déjà trop collante, enlever le pont salin micro-agar et préparer un nouvel embout microcapillaire.
    2. Vérifier s’il y a des bulles d’air dans la solution saline. Dans l’affirmative, préparer un nouvel embout microcapillaire.
    3. Vérifiez si la solution de sel est en contact avec la solution tampon. Si ce n’est pas le cas, puis coupez une autre 1 mm de l’extrémité du tube de l’embout.
      Attention : Assurez-vous que l’embout est toujours assez long à pénétrer la pointe contenant du tampon. S’il n’y a toujours aucun contact, préparer un nouvel embout microcapillaire.
    4. Si aucune de ces étapes aide, préparer un nouvel embout microcapillaire.
  7. Pour le stockage, plongez l’électrode de pont salin d’agar dans une solution de KCl 3M.
    Remarque : Le protocole peut être arrêté ici. Pour une pause pendant la nuit, conserver l’électrode dans une solution de sel de KCl 3M à 4 ° C.
  8. Préparer le bout en plastique contenant du tampon.
    Remarque : Si l’électrode a été stocké durant la nuit, sortez-le et laissez-le chauffer à température ambiante pendant 30 min.
    1. Prenez un bout de microcapillaire et plier le tube, 2 cm du bord de la partie étroite, environ 90 degrés à l’aide d’un câble chauffant.
    2. Utiliser un couteau bien aiguisé ou une lame et couper le tube autour de 5 mm le coude.
    3. Nettoyer la surface à la fin à l’eau et l’éthanol et mesurer le diamètre du trou de l’embout. Sur cette base, calculer l’aire de la surface.
    4. Enduire la surface de la pointe contre 85:15 (v : v) hexane : hexadécane.
      1. Distribuer 3 µL du solvant et retirez-la de la pointe.
      2. Attendre 1 min pour que tout le solvant résiduel dans la pointe s’est évaporée.
    5. Remplissez la pointe de mesure avec 3 µL de tampon et branchez-le sur l’électrode de pont salin.
      Remarque : Vérifiez à nouveau si l’électrode de pont salin et l’électrode de référence sont en contact électrique en effectuant l’étape 2.5.3.
    6. Si il n’y a aucun contact électrique, vérifiez ce qui suit :
      1. Vérifier si l’électrode de pont salin est en contact avec la solution tampon. Si non, puis augmenter le volume de la mémoire tampon dans la pointe ou préparer une astuce microcapillaire plus longtemps.
      2. S’il y a une bulle d’air, retirer l’extrémité de l’électrode de pont micro-sel, remplir la mémoire tampon dans la pointe et branchez-le sur l’électrode à nouveau.

3. mesure des paramètres électriques de la Membrane reconstitué avec la protéine recombinante

  1. Appliquer un signal de tension alternative triangulaire avec la tension maximale Umax = 50 mV et ΔTrampe = 50 ms, ce qui crée une réponse rectangulaire courant alternatif. À partir des valeurs moyennes des courants positifs et négatifs (j’ai+ et je), calculer la capacité de la membrane selon la formule suivante :
    Equation 1
  2. Appliquer une rampe de tension allant de -50 mV à + 50 mV et enregistrer le courant. Placer une fonction linéaire aux données - la pente est la conductance - et calculer le point d’intersection axe x de l’ajustement.
  3. Évacuera la solution dans l’embout en plastique et remplir un nouveau avec un tampon contenant une concentration de substrat accrue.
    1. Si aucune membrane n’est formée au sein de la première 20-30 s, décharger le volume et remplissez-le. Cela garantit que le gradient de concentration à travers la membrane ne change pas significativement au cours de la formation de la membrane.
    2. Après la formation d’une membrane, effectuez les étapes 3.1 et 3.2 pour vérifier la formation adéquate de membrane et d’obtenir le point d’intersection de l’axe des abscisses.

4. calculer le taux de roulement du substrat

Remarque : Voir les travaux antérieurs pour détails3,7.

  1. Estimer la quantité de protéines dans la membrane de la masse moléculaire de lipides et protéines (Mlipidiques etprotéiquesde la M), la zone de la membrane et du groupe de tête un lipide (uneMembrane et unlipide) et le rapport de masse de la protéine par lipides (r).
    Equation 2
  2. Calculer le potentiel pour le substrat transporté de Nernst. R est la constante des gaz, T la température, z l’accusation du substrat transporté, F de la Faraday constant et c1 et c2 les concentrations du substrat de part et d’autre de la membrane.
    Equation 3
  3. Partir des enregistrements de courant-tension, prendre le revers potentiel calculé avec la différence de points d’intersection de l’axe x de l’ajustement linéaire en présence et en absence du gradient du substrat.
  4. Calculer la proportion de la conductance de substrat, Gsubstrat, de la conductance membranaire total, Gtotal, par le rapport inverse potentiel au potentiel de Nernst11.
    Equation 4
  5. Calculer le ΔN nombre de chiffre d’affaires de substratsubstrat par temps unité ΔT de la conductance de substrat (substratde G), la tension appliquée U et la charge du substrat z:
    Equation 5
  6. Le rapport de substrat transporté par le temps pour le nombre de protéines, calculer le chiffre d’affaires taux κ.
    Equation 6

Representative Results

Pour vérifier la minimisation de la diffusion potentielle, la stabilité de la mesure de courant-tension d’une membrane intacte a été mesurée. Dans la Figure 2A, enregistrements représentant-courant tension sont dépeints en présence (points blancs) et en absence (points noirs) d’un gradient de pH. Selon l’équation de Nernst, le gradient de pH induit un changement de tension. Le point d’intersection axe des abscisses d’un ajustement linéaire pour les données, le changement potentiel est calculé. Afin de tester les deux électrodes, le passage au point d’intersection axe x a été analysé pour une électrode standard de AgCl (Figure 2B; points blancs) et un pont de sel micro-agar (Figure 2B, points noirs). Une rampe de tension a été enregistrée dix fois d’affilée et le décalage dans l’axe des abscisses est représenté en contre la montre. Considérant que l’électrode de pont salin agar avait un déplacement maximum de moins de 5 mV même après 300 secondes de mesure, l’électrode standard varié jusqu'à 30 mV au comportement imprévisible, aléatoire,.

Ensuite, les deux électrodes ont été testés à des gradients de pH différents (Figure 3A). Pour l’électrode standard, un gradient de pH de 0,35 et 1.0 (points blancs) a été généré ; pour l’électrode de pont salin agar, des gradients de pH de 0,35, 0,7 et 1,0 (points noirs). Le changement de potentiel a été analysé en trois mesures indépendantes. Contrairement à un gradient de 0,35, où le décalage mesuré seulement varie légèrement, le changement de tension modifie significativement dans le gradient de pH 1.0 en l’absence du pont sel micro-agar. D’un ajustement linéaire pour les données, la pente de la fonction est de 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH pour l’électrode standard et 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH pour l’électrode de micro-agar pont salin. Selon l’équation de Nernst, le changement de potentiel calculé est de 60.7 mV/ΔpH à T = 32 ° C.

En utilisant le pont salin micro-agar, le nombre de chiffre d’affaires de proton, κ, UCP1 mitochondriale et UCP3 a été mesuré et par rapport aux mesures précédentes (Figure 3B). Semblable à la Figure 3A, ΔpH = 1.0 a été généré et le potentiel inverse a été mesuré. La quantité de protéines dans la membrane a été estimée selon la formule prévue à l’article 4 du protocole, avec une protéine à 4 µg de lipides / (mg de lipides), une masse moléculaire de 33 000 et 750 Da pour les protéines et les lipides, une surface de membrane de 3,53 x 10 -4 cm2et une surface / lipides de 7,8 x 10-15 cm2. L’acquis κwas 5,56 ± 0,38 s-1 et 4,10 ± 0,71 s-1 pour UCP1 et UCP3, respectivement (Figure 3B).

Figure 1
Figure 1 : Le set-up électrophysiologique avec le pont salin micro-GCRA. (A), ce panneau affiche un croquis de l’installation. La pointe de microcapillaire contenant la solution saline gélose (représentée en orange) est placée entre l’électrode (noir) et la pointe contenant du tampon (bleue). La membrane est formée à la surface à l’extrémité de la pointe contenant du tampon (indiquée par la flèche). (B), ce panneau affiche une image de l’installation électrophysiologique avec la mise en œuvre du pont sel micro-agar. Les flèches pointent à l’électrode, le pont salin micro-agar, l’électrode de référence et le récipient avec la solution tampon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La comparaison entre un pont salin micro-agar et une électrode standard de AgCl. (A), ce panneau indique une courant-tension représentante mesure en présence (points gris) et en absence (points blancs) d’un gradient de pH de 1. Les lignes représentent un ajustement linéaire pour les données, d'où la conductance et l’axe des x pour obtenir les valeurs de l’intersection. Le changement de tension est évalué par la différence des valeurs d’intersection de ces deux enregistrements. (B), ce panneau indique le déplacement de la membrane potentiel d’une électrode standard de AgCl (points blancs) sur une électrode de micro-agar pont salin (points noirs) dans le temps. Dix mesures de courant-tension ont été enregistrés dans une rangée et le changement de tension moyenne par diffusion potentielle est tracé en contre la montre. Dans toutes les expériences, la membrane a été faite de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstitué avec 15 mol % d’acide arachidonique à une concentration de 1,5 mg/mL. Le tampon contient 50 mM Na2SO4, 10 mM MES 10 mM TRIS et 0,6 mM EGTA à pH = 7.34 et T = 32 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Nombre de chiffre d’affaires de proton de l’UCP1 et UCP3 calculée à partir du potentiel inverse en présence d’un gradient de pH. (A), ce panneau indique le décalage dans le potentiel d’une membrane contenant de l’UCP1 des gradients de pH différents d’une électrode standard de AgCl (points blancs) et une électrode de micro-agar pont salin (points noirs). Les lignes représentent un ajustement linéaire pour les données. (B), ce panneau indique le nombre de chiffre d’affaires de proton de l’UCP1 (première série de données) et UCP3 (second ensemble de données) tel que calculé à partir du rapport de décalage de tension à potentiel de Nernst selon les formules utilisés à l’article 4 du protocole. La première mesure de chaque jeu représente le taux de roulement mesurés avec le pont salin micro-agar. La deuxième barre de chaque ensemble de données représente les mesures antérieures à l’aide d’une électrode standard de AgCl. Valeurs pour UCP1 et UCP3 proviennent de Urbankovaet al. 3 et Macher et al. 8. dans toutes les mesures, la membrane a été faite de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstitué avec 15 mol % AA et UCP1/UCP3. La concentration des lipides et des protéines était de 1,5 mg/mL et 4 µg/mg de lipides, respectivement. Le tampon contient 50 mM Na2SO4, 10 mM MES 10 mM TRIS et 0,6 mM EGTA à pH = 7.34 et T = 32 ° C. Le pH du tampon pour les mesures dégradés a été porté à 7,66, 8,00 ou 8.33 en ajoutant des TRIS et a été changé dans la pipette contenant de solution. Les valeurs sont la moyenne ± écart-type de trois mesures indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La mise en œuvre de la micro-agar de pont salin avec l’électrode minimise sa diffusion potentielle et permet des mesures plus précises du potentiel membranaire généré par un gradient de pH. En présence de différents gradients de pH transmembranaire, le changement potentiel des deux électrodes est acceptable à ΔpH = 0,35 lorsqu’on la compare à la valeur théorique du potentiel d’équilibre de Nernst (ΦNernst = 23,8 mV pour ΔpH = 0,4). Cependant, en plus des gradients de pH physiologique, comme pour l’instance dans les mitochondries entre la matrice et l’espace intermembranaire, l’électrode standard de AgCl impossible de mesurer avec précision le déplacement éventuel à ΔpH = 1 (Figure 3A). L’électrode pontée avec micro-agar sel envoyées aux valeurs qui ont été beaucoup plus comparables à la théorie.

Potentiel de diffusion peut également se produire à l’électrode de référence AgCl, si la solution tampon est modifiée pendant l’expérience. Solution tampon sans chlorure a été utilisée dans les expériences car protéines découplantes ont été proposées pour le transport des ions chlorure et le pH a été réglé à l’aide des Tris ou MES. Le potentiel, en l’absence d’une importante concentration de chlorure, de l’électrode dépend principalement de chlorure impuretés présentes dans la solution tampon. Comme sa composition est inchangée au cours des expériences, il en résultera tout simplement à un potentiel constant de décalage. Toutefois, pour la mesure d’une différence de potentiel absolue entre les deux électrodes, un système de sel-pont simple agar (Ag/AgCl 3 M KCl) pourrait également être utilisé pour l’électrode de référence.

Un pont de sel micro-agar soldes la diffusion potentielle par une équilibration du potentiel de l’électrode. Afin de stabiliser la solution saline, agarose à 1 % (p/v) a été ajouté pour empêcher le mélange de la solution de sel avec la solution tampon. Les ions de sels K+ et Cl ont des mobilités similaires dans un liquide et d’équilibrer le potentiel de l’électrode. Pour installer correctement le pont salin, la solution saline gélose doit être suffisamment réchauffée pour combler la pointe microcapillaire sans bulles d’air et pour couvrir l’électrode de AgCl. Avant d’être à nouveau utilisé, contact électrique entre l’électrode de pont salin et l’électrode de référence doit être vérifié. Selon l’heure, que le pont salin est utilisé, la solution saline doit être suffisamment gélifié pour éviter tout mélange de la solution saline avec le tampon. C’est particulièrement essentiel si K+ ou Cl transporteurs sont étudiées. Le pont salin a été utilisé pendant un temps très court et l’élution d’agarose est négligeable dans cet intervalle de temps. Une plus forte concentration d’agarose jusqu'à 5 %, ou de l’agar (3 % - 5 %), permet d’utiliser le pont salin à une plus longue période de temps6,12.

Cette méthode permet la détermination de la cinétique du transport d’un transporteur membranaire (i) avec des taux de roulement faible et (ii) des protéines mitochondriales de la membrane interne, qui peut difficilement être étudiées standard patch clamp set-up13. Sa précision dépend principalement de la mesure de potentielle inverse, quelle précision est réduite à une conductance membranaire total faible et de petits gradients de concentration qui induisent une potentiel sous le bruit de l’enregistrement de la membrane.

Avec cette installation, le taux de roulement de l’UCP1 et UCP3 comme produit dans les mêmes conditions ont été mesurés. En raison du gradient de pH plus élevé, les taux obtenus semblent être plus précis et non perturbé par des artefacts résultant de changement potentiel de l’électrode mineures. Il peut être utilisé pour davantage analyser et comparer les transporteurs de la membrane mitochondriale produites dans des conditions similaires.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le fonds de recherche autrichien (P31559-B20 à E.E.P.). Les auteurs tiennent à remercier Sarah Bardakji pour son aide technique dans la production et à la reconstitution des souris UCP1 et UCP3 dans des protéoliposomes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

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References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
Une électrode de pont de sel Micro-agar pour analyser le taux de rotation du Proton des protéines membranaires Recombinant
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Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

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