Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות, הנוכחות של דיפוזיה פוטנציאליים מפריע את המידה המדויקת של הפוטנציאל הפוכה על ידי שינוי האלקטרודה פוטנציאליים. באמצעות גשר המלח מיקרו-אגר, ההשפעה של פעפוע פוטנציאליים ממוזער, מה שמאפשר מדידה מדויקת יותר של המצע מספרים תחלופה של חלבוני ממברנה רקומביננטי משוקם.

Abstract

נכון להיום, למעלה מ-50% של כל התרופות תרופתי יעד את התחבורה קינטיקה של קרום חלבונים. אפיון הממברנה המוביל חלבונים מחדש השומנים bilayer ממברנות אלקטרופיזיולוגיות היא שיטה חזק אבל עדין להערכה של הנכסים שלהם physicochemical ולא תרופתי. המספר מחזור המצע הוא פרמטר ייחודי המאפשר ההשוואה של הפעילות של חלבוני ממברנה שונים. בהעברה electrogenic, מעבר הצבע של המצע translocated יוצר פוטנציאל קרום זה לא מופיע ישירות קצב תחלופת המצע של החלבון. באמצעות אלקטרודות כסף כלוריד, פוטנציאל דיפוזיה, הנקרא גם צומת נוזלי פוטנציאל, מושרה, אשר משנה את פוטנציאל אלקטרודה ומטרידה באופן משמעותי מדידות פוטנציאל ממברנה מדויק. ניתן למזער דיפוזיה פוטנציאליים באמצעות גשר מלח, אשר מאזן את פוטנציאל אלקטרודה. במאמר זה, גשר המלח מיקרו-אגר נועד לשפר את הסידור אלקטרופיזיולוגיות, אשר משתמשת micropipettes על היווצרות קרום. תמיסת מלח מלא לתוך טיפ פיפטה microcapillary, התייצב על ידי התוספת של agarose, יכול להיות מותקן בקלות אלקטרודה סטנדרטי. פוטנציאל אלקטרודה של אלקטרודה מיקרו-מלח גשר יציב יותר בהשוואה אלקטרודה סטנדרטי היישום של מערכת זו מייצבת אלקטרודה פוטנציאליים ומאפשרת מידות מדויקות יותר של פוטנציאל ממברנה שנוצרו על-ידי מעבר הדרגתי pH. באמצעות מערכת זו, שיעור תחלופה פרוטון של נשאים מיטוכונדריאלי UCP1, UCP3 reinvestigated, לעומת מדידות מוקדמות יותר.

Introduction

קרום חלבונים הם מטרה עד 60% של תרופות ידועות כל1. מדידות אלקטרופיזיולוגיות של חלבוני ממברנה הם כלי רב עוצמה אך עדינה כדי לנתח התעבורה electrogenic של סובסטרטים מתווכת על-ידי קרום המוביל חלבונים. מודולציה של הזרם transmembrane על-ידי היישום של מתח קבוע או מתח רמפות מאפשר להעריך את תרופתי והפיזיקליות של נשאים, למשל, הפעלת וניגוד סובסטרטים או בתחבורה קינטיקה. עניין מיוחד הוא מספר מחזור המצע, אשר מציג את כמות המצע כי הוא translocated על ידי חלבון ממברנה ליחידת זמן. זה פרמטר מרכזי כאשר משווים את קינטיקה של חלבוני ממברנה שונים. יצירת שיפוע ריכוז של המצע טעון על פני הקרום יוצר כוח אלקטרו מניע שמהם הסיק המספר תחלופה של המצע.

באמצעות אלקטרודה AgCl, הנוכחות של מאגר ללא כלוריד יוצר פוטנציאל דיפוזיה הפיצולים אלקטרודה פוטנציאליים, גורמת לשינוי מתח זרם מדידות2. אמנם תמיד נוכח, זה זניח עבור מוליכות סטנדרטי ומדידות קיבולת מאז פרמטרים אלה הם גם התלויים על המדרון של זרם-מתח הקלטה (מוליכות) או האם ההבדל של הקלטה יחיד (קיבולת), אשר מבטל את הפוטנציאל. עם זאת, ההקלטה של הפוטנציאל הפוכה, אשר נוצר על-ידי התעבורה של מצע, יכול מופרע באופן משמעותי על ידי פעפוע פוטנציאליים. לפיכך, עבור מדידות מדויקות של הפוטנציאל הפוכה, פוטנציאל אלקטרודה יש להישמר קבוע.

פעפוע פוטנציאליים ניתן למזער על ידי שתי שיטות: (i) רכוש קרום bilayer, ריכוז המצע צריך להיות מוגברת בצד אחד של הממברנה3,4, או (ii) גשר המלח מאזן את האלקטרודה פוטנציאליים 5-השיטה הראשונה תלויה מאוד יציבות המדידות. הקרום יש לשרוד למשך מספר דקות, מהתוספת של המצע מתחת תוך ערבוב עד המצע מופץ כמעט באותה מידה הפתרון. אם הקרום ציסטות נקרעות בין, מעבר הצבע המצע היא שונה על ידי חילופי חינם מולקולות טעונות, ופנו מדידות לא מדויק. השיטה השנייה מאזנת פעפוע פוטנציאל אך הוא מוגבל על ידי גודל הסידור. יישום קטן אבל מתפקד גשר המלח במגוון מיקרו שיבנו אלקטרופיזיולוגיות הוא מאתגר6. עבור השיטה השנייה, תמיסת מלח מלא לתוך טיפ microcapillary, התייצב על ידי התוספת של agarose כדי למנוע דיפוזיה של הפתרון מלח בופר.

ב פרוטוקול זה, מתואר הפקה ישירה של מיקרו-אגר גשר המלח וכן יישום לתוך הגדרת אלקטרופיזיולוגיות בהתבסס על הגדרת פיפטה7 . טיפ microcapillary מותאמת להכיל פתרון אשלגן כלורי 3 מ' עם 1 mol % (w/v) agarose והן לגשר פתרון אלקטרודה ומאגר AgCl. היתרון של הגשר מיקרו-מלח מוצג על ידי הקלטות זמן המשמרת פוטנציאל אלקטרודה את מידות מדויקות יותר של קרומית אפשרית ב- pH מדרגים שונים. במערכת מודל של חומרים מחדש לתוך ליפוזומים, שיעור תחלופה של נשאים מיטוכונדריאלי UCP1 ו- UCP3 המיוצר תנאים דומים reinvestigated, לעומת תוצאות קודמות3,8.

Protocol

1. ייצור החלבונים Uncoupling רקומביננטי (UCPs) ואת היווצרות קרום מישוריים Bilayer

  1. לייצר UCP1 רקומביננטי, UCP3 כפי שתואר על ידי רופרכט. et al. 9 ו. Hilse et al. 10
  2. טופס bilayer מישורי ממברנות על קצות קונבנציונאלי פיפטות פלסטיק לוותר, כפי שתואר על ידי בק. ואח 7

2. הכנת האלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר

  1. התאם פיפטה microcapillary עצה (ראה טבלה של חומרים) באורך המתאים.
    1. סמן את המיקום על עצה ריק שבו הטיפ המכיל מאגר תצורף ולהשתמש של caliper הזזה כדי למדוד את האורך של האלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר.
      התראה: הטיפ microcapillary חייב להיות מספיק כדי להזין את בופר המדידות.
    2. לחתוך את הקצה microcapillary עם סכין חדה או להב ו לנקות את השטח לחתוך עם אתנול ומים.
  2. להכין את האלקטרודה מצופים AgCl.
    1. חתכו כבל Ag של-8 ס"מ אורך ולנקות את זה עם אתנול ומים.
    2. קחי פיסה של נייר זכוכית וחלק את פני השטח של 1 ס מ אורך בקצה של החוט, שאמור להיות בקשר עם הפתרון מלח.
    3. טבלו את הקצה מוחלקים פתרון אשלגן כלורי 3 מ', מעיל זה electrochemically כלוריד באמצעות היצע DC ב- 1.5 V עבור 10 s.
    4. לנקות את האלקטרודה עם מים, לייבש אותו, להתאים את האורך של האלקטרודה AgCl מהצד ללא ציפוי כך הוא חודר את הטיפ microcapillary עמוק ככל האפשר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
  3. להכין פתרון מלח אשלגן כלורי 3 מ' עם agarose 1% (v/v).
    1. שוקלים לצאת 4.47 g של אשלגן כלורי, לפזר זאת בתוך 20 מיליליטר מים על ידי ערבוב זה בבקבוקון.
    2. הסר את קדירות שוקל לצאת 0.2 גר' agarose, להוסיף את הבקבוק.
    3. לחמם את פתרון 100 ° C כדי להמיס את agarose ולמנוע ממנו קרישה.
      התראה: הבקבוקון יהיה חם מאוד. לא לגעת בו בידיים חשופות. להשתמש בכפפות לטיפול.
  4. למלא את הטיפ microcapillary עם תמיסת מלח agarose.
    התראה: הפתרון הוא חם. להגן על הידיים ועבודה בקפידה כדי להימנע פרצים.
    1. אם agarose מתחיל קרישה, לחמם את תמיסת מלח מלא להמיס את agarose שוב.
    2. משרים 10 µL של הפתרון מלח אגר לתוך קצה microcapillary. משרים אותו לאט לאט, בזהירות כדי למנוע אוויר בועות בקצה.
    3. הסר את הטיפ פיפטה, לדחוף פנימה האלקטרודה AgCl מהצד הרחב יותר של הקצה. ודא כי האלקטרודה חודר את תמיסת מלח.
    4. לקרר האלקטרודה לטמפרטורת החדר וחבר אותו לתוך המגבר.
  5. להכין את החומר הממתן המידות.
    1. שוקלים לצאת 0.710 גר' נה2אז4, 0.195 גר' MES, 0.121 g של טריס, 0.023 גר' EGTA, להוסיף 100 מ של מים מזוקקים גביע ואז מערבבים את הפתרון.
    2. בדוק ערך ה-pH של המאגר באמצעות אלקטרודת pH ולהתאים את ערך ה-pH 7.32.
    3. בדוק כי האלקטרודה הפניה האלקטרודה גשר המלח אגר הם מגע חשמלית.
      1. להוסיף 1 מ"ל של מאגר במיכל פלסטיק.
      2. טובלים האלקטרודה הפניה, האלקטרודה גשר המלח אגר ולבדוק לתגובה אות. אם התגובה האות הנכונה, המשך לשלב 2.7.
  6. אם אין תגובה אות כוזב או בלי קשר חשמל בכלל, לבצע פתרון הבעיות הבאות.
    1. בדוק אם האלקטרודה היא בקשר עם הפתרון מלח, דחפו את האלקטרודה הפתרון.
      הערה: אם הפתרון כבר יותר מדי בעייתי, להסיר את הגשר מלח מיקרו-אגר והכן טיפ microcapillary חדש.
    2. בדוק אם יש בועות אוויר בתוך תמיסת מלח. אם כן, להכין טיפ microcapillary חדש.
    3. בדוק אם הפתרון מלח הוא קשר בופר. אם לא, ואז לחתוך עוד 1 מ מ בקצה צינור של הקצה.
      התראה: ודא כי הטיפ הוא עדיין מספיק זמן. כדי לחדור את הטיפ המכיל מאגר. אם יש עדיין אין קשר, להכין טיפ microcapillary חדש.
    4. אם אף אחד השלבים הבאים לסייע, להכין טיפ microcapillary חדש.
  7. לאחסון, טבלו האלקטרודה גשר המלח אגר פתרון אשלגן כלורי 3 מ'.
    הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן. עבור הפסקה ללילה, לאחסן האלקטרודה תמיסת מלח אשלגן כלורי 3 מ' על 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכינו את הטיפ פלסטיק המכיל מאגר.
    הערה: אם האלקטרודה אוחסן בן לילה, תוציא את זה ולתת לו חום עד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    1. קח טיפ microcapillary, לכופף את הצינור, 2 ס"מ מהקצה של החלק הצר, כ- 90 מעלות באמצעות חוט חימום.
    2. להשתמש בסכין חדה מאוד או להב, לחתוך את הצינור בסביבות 5 מ מ העיקול.
    3. לנקות את השטח לקראת הסוף עם אתנול ומים ולמדוד את הקוטר של החור של הקצה. מכאן, לחשב את השטח של פני השטח.
    4. המעיל השטח של הקצה עם 85:15 (v: v) הקסאן: hexadecane.
      1. פיפטה 3 µL של הממס ולהסיר אותו מהקצה.
      2. חכו 1 דקות, כך כל של הממס שיורית בקצה התאדו.
    5. למלא את הטיפ מדידה עם 3 µL מאגר וחבר אותו על גבי האלקטרודה גשר מלח.
      הערה: בדוק שוב אם האלקטרודה גשר המלח האלקטרודה הפניה הם מגע חשמלית על-ידי ביצוע שלב הנגן 2.5.3.
    6. אם אין מגעים חשמליים, בדוק לדברים הבאים:
      1. לבדוק אם האלקטרודה גשר המלח בקשר עם בופר. אם לא, אז להגדיל את נפח המאגר בקצה או להכין טיפ microcapillary יותר.
      2. אם יש בועת אוויר, להסיר את הטיפ של האלקטרודה גשר מיקרו-מלח, למלא את מאגר המידע, וחבר אותו לתוך האלקטרודה שוב.

3. מדידה של הפרמטרים החשמלי של קרום מחדש עם חלבון רקומביננטי

  1. החלת אות מתח מתחלפים משולש עם מתח מקסימלי Umax = mV וΔT 50הרמפה = 50 מילישניות, אשר יוצר תגובה מלבני זרם חילופין. מתוך הערכים אכזרי של הזרמים חיוביים ושליליים (+ ואני), לחשב את הקיבולת של הקרום על פי הנוסחה הבאה:
    Equation 1
  2. החלת רמפה מתח החל מ-50 mV +50 mV, הרשומה הנוכחית. להכניס פונקציה קווית - השיפוע הוא מוליכות - על הנתונים ולחשב את נקודת ההצטלבות של ציר ה-x של התאים.
  3. הפרשות הפתרון בקצה פלסטיק ומלא אחד חדש עם מאגר המכיל ריכוז המצע מוגבר.
    1. אם אין קרום נוצר בתוך ה-20-30 s הראשון, לשחרר את עוצמת הקול, למלא אותו. זה מבטיח כי מעבר הצבע ריכוז על פני הקרום לא לשנות באופן משמעותי במהלך היווצרות קרום.
    2. לאחר היווצרות קרום, לבצע שלבים 3.1 ו- 3.2 שוב כדי לוודא היווצרות קרום נכונה וכדי לקבל את נקודת ההצטלבות של ציר ה-x.

4. חישוב של שיעור תחלופה המצע

הערה: ראה עבודה קודמות עבור פרטים3,7.

  1. להעריך את כמות חלבון ממברנה מן המסה המולקולרית של השומנים חלבון (מ'השומנים Mחלבון), האזור של הקרום של השומנים אחד ראש קבוצה (קרום ,שומנים בדם), ואת היחס המונית של החלבון לכל השומנים (r).
    Equation 2
  2. לחשב את פוטנציאל המצע מועבר נרנסט. R הוא קבוע הגז, T הטמפרטורה, z המטען של המצע מועבר, F של פאראדיי קבועה, ו- c1 ו- c2 ריכוז המצע של שני צידי הקרום.
    Equation 3
  3. מ ההקלטות זרם-מתח, לקחת את ההפך פוטנציאליים מחושב עם ההבדל של נקודות צומת ציר ה-x מ. מתאים ליניארי נוכחות, היעדרות של המילוי ההדרגתי המצע.
  4. לחשב את הפרופורציה של המצע מוליכות, Gהמצע, כדי מוליכות הממברנה הכולל, Gהכולל, לפי היחס של הפוטנציאל להפוך פוטנציאל נרנסט11.
    Equation 4
  5. לחשב את המצע מחזור ΔN מספרהמצע לכל ΔT יחידת זמן מוליכות את המצע (Gהמצע), המתח יישומית U, המטען של z המצע:
    Equation 5
  6. של היחס של המצע מועבר בכל פעם על מספר חלבונים, לחשב את κ קצב תחלופת.
    Equation 6

Representative Results

כדי לוודא צמצום פעפוע פוטנציאליים, נמדדה יציבות המדידות זרם-מתח של קרום שלם. איור 2א, הקלטות נציג-זרם מתח מתוארים נוכחות (נקודות לבנות), היעדר הדרגתי pH (נקודות שחורות). על פי משוואת נרנסט, מעבר הצבע pH גורם מפנה מתח. מנקודת לצומת ציר ה-x של התאמה לינארית בנתונים, מחושבת משמרת פוטנציאליים. על מנת לבדוק שתי אלקטרודות, המשמרת בנקודת ההצטלבות של ציר ה-x היה ניתח אלקטרודה סטנדרטי של AgCl (איור 2B; נקודות לבנות), מיקרו-אגר גשר מלח (איור 2B; נקודות שחורות). רמפה מתח הוקלט עשר פעמים ברציפות ומתואר משמרת רשע על ציר ה-x נגד הזמן. ואילו האלקטרודה גשר המלח אגר היה שינוי מרבי של פחות מ-5 mV אפילו לאחר 300 שניות של המדידה, האלקטרודה סטנדרטי מגוונות עד 30 mV בהתנהגות לא צפוי, אקראי,.

לאחר מכן, שתי אלקטרודות נבדקו ב- pH שונים מעברי צבע (איור 3א). עבור אלקטרודה סטנדרטי, נוצר שיפוע pH של 0.35 ו- 1.0 (נקודות לבנות); אגר גשר המלח אלקטרודה, מעברי צבע pH של 0.35, 0.7 ו- 1.0 (נקודות שחורות). המשמרת בפוטנציאל נותחו ב שלוש מדידות עצמאי. בניגוד הדרגתי של 0.35, איפה משמרת נמדד רק משתנה מעט, משמרת מתח משמעותי משנה ב ה גרדיאנט pH 1.0 בהיעדרו של הגשר מלח מיקרו-אגר. מתוך התאמה לינארית בנתונים, השיפוע של הפונקציה היא 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH עבור האלקטרודה סטנדרטי 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH עבור האלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר. לפי משוואת נרנסט, משמרת פוטנציאליים מחושב הוא 60.7 mV ΔpH ב T = 32 ° C.

באמצעות הגשר מלח מיקרו-אגר, המספר מחזור פרוטון, κ, UCP1 מיטוכונדריאלי, UCP3 היה נמדד, לעומת מדידות הקודם (איור 3ב). איור 3א, ΔpH דומה = 1.0 הופקה, נמדד הפוטנציאל הפוכה. כמות חלבון ממברנה הוערך בהתאם לנוסחה המפורטת בסעיף 4 של הפרוטוקול, עם חלבון השומנים יחס של 4 µg / (מ ג של שומנים בדם), מסה מולקולרית של Da 33,000 ולאחר 750 חלבונים, שומנים בדם, פני שטח הממברנה של 3.53 x 10 -4 ס מ2, ואזור לכל השומנים של 7.8 x 10-15 ס מ2. השיג κwas 5.56 ± 0.38 s-1 ו ± 0.71 4.10 s-1 עבור UCP1 ו- UCP3, בהתאמה (איור 3ב).

Figure 1
איור 1 : הסידור אלקטרופיזיולוגיות עם גשר המלח מיקרו-אגר. (א) בלוח זה הופעות סקיצה של הסידור. הטיפ microcapillary המכיל את תמיסת מלח אגר (מתואר ב orange) ממוקמת בין האלקטרודה (שחור) הטיפ המכיל מאגר (כחול). הקרום נוצר על פני השטח בקצה של הקצה המכיל מאגר (שצוין על-ידי החץ). (B) לוח זה מראה תמונה של הסידור אלקטרופיזיולוגיות מימוש הגשר מלח מיקרו-אגר. החצים הצבע האלקטרודה, הגשר מלח מיקרו-אגר, האלקטרודה הפניה של המכולה עם בופר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ההשוואה של גשר המלח מיקרו-אגר, אלקטרודה סטנדרטי של AgCl. (א) לוח זה מראה זרם-מתח נציג מדידה נוכחות (נקודות אפור), היעדר הדרגתי pH 1 (נקודות לבנות). הקווים מייצגות התאמה לינארית על הנתונים, אשר מוליכות לבין ציר ה-x לצומת הערכים מתקבלים. משמרת מתח מוערך על-ידי ההפרש בין הערכים החיתוך של שתי הקלטות. (B) לוח זה מראה את המשמרת של הממברנה פוטנציאלי של תקן אלקטרודה AgCl (נקודות לבנות) אלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר (נקודות שחורות) בזמן. 10 מדידות מתח זרם הוקלטו ברצף, משמרת מתח רע על ידי דיפוזיה פוטנציאליים מותווים נגד הזמן. בניסויים כל, הקרום היה עשוי 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL מחדש עם mol 15% חומצה ארכידונית-ריכוז של 1.5 mg/mL. המאגר מכיל 50 מ מ נה2אז4, 10 מ מ MES, 10 מ מ טריס ו 0.6 מ"מ EGTA ב- pH = 7.34 ו- T = 32 ° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : פרוטון מחזור מספר UCP1 UCP3 מחושב מתוך הפוטנציאל הפוכה בנוכחות הדרגתי pH. (א) לוח זה מציג את המשמרת הפוטנציאל של קרום המכילות UCP1 של מעברי צבע pH שונים של אלקטרודה סטנדרטי של AgCl (נקודות לבנות), עם גשר המלח מיקרו-אגר אלקטרודה (נקודות שחורות). הקווים מייצגות התאמה לינארית על הנתונים. (B) לוח זה מציג את מספר מחזור פרוטון UCP1 (קבוצת הנתונים הראשונה) ו UCP3 (קבוצת הנתונים השניה) מחושב כמו מן היחס של מתח shift פוטנציאל נרנסט לפי הנוסחאות בסעיף 4 של הפרוטוקול. הבר הראשון של כל קבוצה מייצגת המחירים מחזור נמדד עם הגשר מלח מיקרו-אגר. הבר השני של כל ערכת נתונים מייצג הקודם מדידות באמצעות אלקטרודה סטנדרטי של AgCl. ערכים עבור UCP1 ו- UCP3 נלקחו Urbankova.et al. 3 ו. Macher et al. 8. בכל המדידות, הקרום היה עשוי 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL מחדש עם 15 mol % AA ו UCP1/UCP3. הריכוז של שומנים וחלבונים היה 1.5 mg/mL, µg/מ ג של השומנים, בהתאמה. המאגר מכיל 50 מ מ נה2אז4, 10 מ מ MES, 10 מ מ טריס ו 0.6 מ"מ EGTA ב- pH = 7.34 ו- T = 32 ° C. ה-pH של המאגר המדידות הדרגתיות הוגדל 7.66, 8.00 או 8.33 על-ידי הוספת טריס, השתנה ב- פיפטה המכילות פתרון. הערכים הם הממוצע ± סטיית התקן של שלוש מדידות עצמאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

היישום של הגשר מלח מיקרו-אגר עם האלקטרודה ממזער שלה דיפוזיה פוטנציאליים ומאפשרת מידות מדויקות יותר של פוטנציאל ממברנה שנוצרו על-ידי מעבר הדרגתי pH. בנוכחות מדרגים שונים transmembrane pH, משמרת פוטנציאלי של שתי אלקטרודות היה מקובל-ΔpH = 0.35 בהשוואת לערך תיאורטי של המאזן נרנסט פוטנציאליים (באופן כללינרנסט = 23.8 mV עבור ΔpH = 0.4). עם זאת, ב יותר pH פיזיולוגיים הדרגתיים, כמו עבור מופע בתוך המיטוכונדריה בין המטריקס ומרחב intermembrane, האלקטרודה AgCl רגיל לא הצליח למדוד במדויק את המשמרת פוטנציאליים-ΔpH = 1 (איור 3א). האלקטרודה גישור עם מיקרו-אגר מלח נמסר הערכים שהיו הרבה יותר להשוות התיאוריה.

דיפוזיה פוטנציאלי עלול להתרחש גם על האלקטרודה הפניה AgCl אם הפתרון המאגר משתנה במהלך הניסוי. בופר ללא כלוריד שימש בניסויים כיוון חלבונים uncoupling הוצעו כדי להעביר כלורידים, ה-pH הותאם באמצעות טריס או MES. האלקטרודה פוטנציאל, בהיעדרו של ריכוז משמעותי של כלוריד, תלוי בעיקר זיהומים כלוריד בופר. כפי הקומפוזיציה שלה לא השתנתה במהלך הניסויים, זה פשוט יגרום פוטנציאל הסטת מתמדת. עם זאת, מדידות הפרש הפוטנציאלים מוחלט בין שתי אלקטרודות, מערכת מלח-גשר אגר פשוטה (Ag/AgCl 3 מ' אשלגן) יכול לשמש גם עבור האלקטרודה הפניה.

גשר המלח מיקרו-אגר מאזנת פעפוע פוטנציאליים על ידי equilibration של האלקטרודה פוטנציאליים. על מנת לייצב את תמיסת מלח, agarose 1% (w/v) נוספה כדי למנוע ערבוב של הפתרון מלח עם הפתרון מאגר. היונים מלח K+ ו- Cl יש mobilities דומה בנוזל, לאזן את האלקטרודה פוטנציאליים. כדי להתקין כראוי את הגשר מלח, אגר מלח שהפתרון צריך להיות מחומם מספיק כדי למלא את הטיפ microcapillary ללא בועות אוויר, כדי לכסות את האלקטרודה AgCl. לפני עוד שימוש, קשר חשמלי בין האלקטרודה גשר המלח האלקטרודה הפניה יש להיבדק. העשל שהגשר מלח משמש מלח שהפתרון צריך להיות מספיק הג'לי כדי למנוע כל ערבוב של הפתרון מלח עם המאגר. . זה קריטי במיוחד, אם K+ או מובילי Cl נחקרות. הגשר מלח שימש במשך זמן קצר, • תנאי של agarose היא זניחה בטווח זמן זה. ריכוז גבוה יותר של agarose של עד 5%, או של אגר (3% - 5%), מאפשרת באמצעות הגשר מלח לתקופה ארוכה יותר של זמן6,12.

שיטה זו מאפשרת לקבוע את התחבורה קינטיקה של נהג ממברנה (i) במחירים תחלופה נמוכה, (ii) של חלבונים מיטוכונדריאלי הקרומית הפנימית, אשר בקושי יכול ייחקרו set-ups מלחציים תיקון תקן13. הדיוק שלה תלויה בעיקר המדידה פוטנציאליים הפוכה, איזה דיוק הוא ירד של מוליכות הממברנה הכולל נמוך ומילויים הדרגתיים ריכוז קטן אשר זירוז קרום פוטנציאליים מתחת הרעש של הקלטה.

שימוש זה, שיעור תחלופה של UCP1 ו- UCP3 מיוצר תחת באותם התנאים נמדדו. עקב מעבר הצבע pH גבוה יותר, שיעור שהושג נראה בשלוות נפש מאת חפצי הנובע משמרת פוטנציאל אלקטרודה קטנה ומדויק יותר. זה יכול לשמש עוד לנתח ולהשוות בין מובילי ממברנה מיטוכונדריאלי מיוצר בתנאים דומים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר האוסטרי (P31559-B20 כדי E.E.P.). המחברים תודה שרה Bardakji לסיוע טכני מעולה בתחום הייצור, בנייתו מחדש של העכבר UCP1 ו- UCP3 לתוך proteoliposomes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter