Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En mikro-agar Salt Bridge elektrod för att analysera Proton Omsättningshastigheten av rekombinant membranproteiner

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

I elektrofysiologiska mätningar stör närvaron av en diffusion potentiella exakt mätning av omvänd potential genom att ändra elektroden potentiella. Med en mikro-agar salt bridge minimeras effekterna av diffusion potentiella, vilket ger en mer exakt mätning av substrat omsättning antalet ombildade rekombinant membranproteiner.

Abstract

Hittills har rikta mer än 50% av alla farmakologiska läkemedel transport kineticsen av membranproteiner. Elektrofysiologiska karakterisering av membran bärarproteiner beredas i lipid lipidens membran är en kraftfull men känslig metod för bedömning av sina fysikalisk-kemiska och farmakologiska egenskaper. Omsättning är substrat en unik parameter som tillåter jämförelse av aktiviteten av olika membranproteiner. I en electrogenic transport skapar gradient flyttade substratet en membranpotential som direkt korrelerar till substrat Omsättningshastigheten av protein. Med hjälp av silverklorid elektroder, induceras en diffusion potential, även kallad flytande junction potentiella, vilket förändrar elektrod potential och avsevärt stör exakt membran potentiella mätningar. Diffusion potentiella kan minimeras genom en salt bro, som balanserar elektrod potential. I den här artikeln är en mikro-agar salt bro för att förbättra elektrofysiologiska set-up, som använder Mikropipetter för membran bildandet. Saltlösningen är fylld till en microcapillary pipettspetsen, stabiliseras genom tillsats av agaros, och kan enkelt monteras till en standard elektrod. Elektrod potential av en mikro-salt bridge elektrod är stabilare jämfört med en standard elektrod. Genomförandet av detta system stabiliserar elektrod potential och ger mer exakta mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. Med detta system, är proton omsättning de mitokondriella trafikföretag UCP1 och UCP3 föremål för en förnyad och jämfört med tidigare mätningar.

Introduction

Membranproteiner är riktade med upp till 60% av alla kända läkemedel1. Elektrofysiologiska mätningar av membranproteiner är en kraftfull men känsliga verktyg för att analysera electrogenic transport av substrat som medieras av transportören membranproteiner. Moduleringen av transmembrana strömmen genom tillämpning av konstant spänningar eller spänning ramper tillåter bedömning av de farmakologiska och fysiska egenskaperna hos bärarna, exempelvis aktivering och hämning av substrat eller transport kinetik. Av särskilt intresse är numret för omsättning substrat, som visar mängden substrat som är flyttad av ett membranprotein per tidsenhet. Det är en viktig parameter när man jämför kineticsen av olika membranproteiner. Om inrättande av en koncentrationsgradient laddade substratets över membranet genererar en elektromotorisk kraft som omsättning antalet substratet härleds.

Med en Granulatfyllda elektrod, skapar förekomsten av klorid-fri buffert en diffusion potential som förändrar elektrod potential och leder till en förskjutning i ström-spänning mätningar2. Även om det är alltid närvarande, är försumbara för standard konduktans och kapacitet mätningar eftersom dessa parametrar är antingen beroende på lutningen på den ström-spänning inspelning (konduktans) eller är skillnaden mellan en enda inspelning (kapacitet), som avbryter potential. Inspelningen av den omvända potential som skapas genom transport av substrat, kan dock störas betydligt av diffusionen potentiella. För exakta mätningar av omvänd potential alltså elektrod potential kan hållas konstant.

Diffusionen potentiella kan minimeras genom två metoder: (i) i närvaro av en lipidens membran, har ett substrat koncentrationen ökas på ena sidan av membranet3,4, eller (ii) en salt bro balanserar elektroden potentiella 5. den första metoden är starkt beroende av stabiliteten i mätningarna. Membranet måste överleva i flera minuter, från tillägg av substrat under omrörning tills underlaget är nästan jämt fördelad i lösningen. Om membranet spricker i mellan, substrat lutningen ändras genom ett fritt utbyte av laddade molekyler och mätningar slår felaktig. Den senare metoden balanserar diffusion potentiella men begränsas av storleken på set-up. Genomföra en liten men fungerande salt bridge i micro intervallet till en Elektrofysiologisk set-up är utmanande6. För den senare metoden, saltlösningen fylls i en microcapillary spets och stabiliseras genom tillsats av agaros att förhindra spridning av saltlösningen till buffertlösningen.

I detta protokoll beskrivs en enkel produktion av en mikro-agar salt bro och genomförandet i en Elektrofysiologisk set-up baserat på pipetten set-up7 . En microcapillary spets justeras både innehåller en 3 M KCl-lösning med 1 mol % (w/v) agaros och överbrygga en Granulatfyllda elektrod och buffert lösning. Fördelen med mikro-salt bron visas tid inspelningar av elektroden potentiella skiftet och mer exakta mätningar av membranpotential som vid olika pH lutningar. I modell-systemet av rekombinanta proteiner beredas i liposomer är omsättning mitokondriell transportföretag UCP1 och UCP3 produceras under liknande förhållanden förnyad undersökning och jämfört med tidigare resultat3,8.

Protocol

1. produktion av rekombinant Uncoupling proteiner (UCPs) och bildandet av Planar lipidens membran

  1. Producera rekombinant UCP1 och UCP3 som beskrivs av Rupprecht o.a. 9 och Hilse o.a. 10
  2. Bilda planar lipidens membran på tips av konventionella dispensable plast pipetter som beskrivs av Beck et al. 7

2. beredning av mikro-agar Salt Bridge elektroden

  1. Justera microcapillary pipett spets (se Tabell för material) till lämplig längd.
    1. Markera en tom spets som buffert innehållande spetsen kommer att knytas till och använda en glidande skjutmått mäta längden på mikro-agar salt bridge elektroden.
      Varning: Microcapillary tipset måste vara tillräckligt lång för att ange buffertlösningen för mätningarna.
    2. Skär microcapillary spetsen med en vass kniv eller ett blad och rengör den skurna ytan med etanol och vatten.
  2. Förbered Granulatfyllda-belagda elektroden.
    1. Skär av en Ag binder av ca 8 cm i längd och rengör den med etanol och vatten.
    2. Ta en bit sandpapper och jämna ner ytan av 1 cm längd i slutet av tråden, som bör vara i kontakt med saltlösningen.
    3. Doppa jämnas ut slutet i en 3 M KCl-lösning och päls det elektrokemiskt med klorid med likström 1,5 V för 10 s.
    4. Rengöra elektroden med vatten, torka den och justera längden på Granulatfyllda elektroden från obestruket sida så att det tränger igenom microcapillary spetsen så djupt som möjligt.
      Obs: Protokollet kan pausas här.
  3. Bered en 3 M KCl salt med 1% (v/v) agaros.
    1. Väg upp 4,47 g av KCl och lös upp det i 20 mL vatten genom omrörning det i en kolv.
    2. Ta bort omröraren, väg upp 0,2 g av agaros och lägga till kolven.
    3. Hetta upp lösningen till 100 ° C för att smälta Agarens och förhindra det från att levra.
      Varning: Kolven kommer att vara mycket heta. Inte röra den med händerna. Använd handskar för hantering.
  4. Fyll microcapillary spets med agarosgelelektrofores saltlösningen.
    FÖRSIKTIGHET: Lösningen är heta. Skydda händer och arbete noggrant för att undvika stänk.
    1. Om Agarens börjar koagulering, värma upp salt lösningen att helt smälta Agarens igen.
    2. Blötlägg 10 µL agar saltlösningen i microcapillary spets. Blötlägg det långsamt och försiktigt att undvika luft bubblor i spetsen.
    3. Ta bort spetsen från pipetten och tryck i Granulatfyllda elektroden från den bredare sidan av spetsen. Säkerställa att elektroden tränger saltlösningen.
    4. Kyla ner elektroden till rumstemperatur och Anslut det till förstärkaren.
  5. Förbereda bufferten för mätningarna.
    1. Väg upp 0.710 g Na2SO4, 0,195 g mes, 0.121 g TRIS, och 0.023 g EGTA, sedan lägga till 100 mL destillerat vatten i en bägare och rör om lösningen.
    2. Kontrollera pH värdet i bufferten med hjälp av en pH-elektrod och justera pH-värdet till 7,32.
    3. Kontrollera att referenselektroden och agar salt bridge elektroden är i elektrisk kontakt.
      1. Tillsätt 1 mL buffert en plastdunk.
      2. Doppa i referenselektroden och agar salt bridge elektroden och kolla på en signal svar. Om signalen svaret är korrekt, Fortsätt till steg 2,7.
  6. Om det finns en falsk signal svar eller ingen elektrisk kontakt alls, utför följande felsökning.
    1. Kontrollera om elektroden är i kontakt med saltlösningen och skjut elektroden i lösningen.
      Obs: Om lösningen redan är alltför klibbig, ta bort mikro-agar salt bron och förbereda en ny microcapillary spets.
    2. Kontrollera om det finns luftbubblor i saltlösningen. Om ja, förbereda en ny microcapillary spets.
    3. Kontrollera om saltlösningen är i kontakt med buffertlösningen. Om så inte är fallet, sedan skära av en annan 1 mm tube ände spetsen.
      Varning: Glöm inte att spets är fortfarande tillräckligt länge för att penetrera buffert innehållande spetsen. Om det finns fortfarande ingen kontakt, förbereda en ny microcapillary spets.
    4. Om inget av dessa steg hjälpa, förbereda en ny microcapillary spets.
  7. Förvaring, doppa agar salt bridge elektroden i ett 3 M KCl-lösning.
    Obs: Protokollet kan stoppas här. För en paus över natten, lagra elektroden i 3 M KCl salt lösning vid 4 ° C.
  8. Förbereda den buffert innehållande plastspets.
    Obs: Om elektroden lagrat över natten, ta ut och låt den värma upp till rumstemperatur i 30 min.
    1. Ta en microcapillary spets och böj röret, 2 cm från kanten av den smala delen, ungefärligt 90 grader med hjälp av en värme-tråd.
    2. Använder en mycket vass kniv eller ett blad och skär av röret runt 5 mm från böjen.
    3. Rengör ytan i slutet med etanol och vatten och Mät diametern på hålet i spetsen. Från detta, beräkna hur mycket av ytan.
    4. Täck ytan av spetsen med 85:15 (v: v) hexan: hexadecane.
      1. Pipettera 3 µL av lösningsmedlet och ta bort den från spets.
      2. Vänta 1 minut så att allt återstående lösningsmedel i spetsen har avdunstat.
    5. Fyll mätning spetsen med 3 µL buffert och Anslut den på salt bridge elektroden.
      Obs: Kontrollera igen om salt bridge elektroden och referenselektroden är i elektrisk kontakt genom att utföra steg 2.5.3.
    6. Om det finns ingen elektrisk kontakt, kontrollera följande:
      1. Kontrollera om salt bridge elektroden är i kontakt med buffertlösningen. Om inte, sedan antingen öka volymen av bufferten i spetsen eller förbereda en längre microcapillary spets.
      2. Om det finns en luftbubbla, bort spetsen från mikro-salt bridge elektroden, fylla bufferten i spetsen och Anslut den till elektroden igen.

3. mätning av de elektriska parametrarna av membranet rekonstitueras med rekombinant Protein

  1. Tillämpa en triangulär alternerande spänningssignal med maximal spänning Umax = 50 mV och ΔTramp = 50 ms, vilket skapar en rektangulär växelström svar. Från medelvärdena av de positiva och negativa strömmarna (jag+ och jag), beräkna kapaciteten av membranet enligt följande formel:
    Equation 1
  2. Tillämpa en spänning ramp alltifrån -50 mV + 50 mV och post nuvarande. Passar en linjär funktion till data - backen är konduktans - och beräkna x-axeln skärningspunkten av passformen.
  3. Fullgöra lösningen i plast spets och fylla en ny med en buffert som innehåller en ökad substrat koncentrationen.
    1. Om ingen membran bildas inom den första 20-30 s, ansvarsfrihet volymen och fylla den. Detta garanterar att koncentrationsgradient över membranet inte väsentligt förändras under membranet bildandet.
    2. Efter bildandet av ett membran, utför steg 3.1 och 3.2 igen för att bekräfta korrekt membran bildas och för att få x-axeln skärningspunkten.

4. beräkning av substrat Omsättningshastigheten

Obs: Se tidigare arbete för detaljer3,7.

  1. Uppskatta mängden protein i membranet från det molekylära samlas av lipider och protein (MLipid och MProtein), området av membranet och av en lipid huvud grupp (ettmembran och enLipid) och massa förhållandet av protein per lipid (r).
    Equation 2
  2. Beräkna Nernst potential för transporteras substratet. R är gaskonstanten, T temperaturen, z laddningen av transporterade substratet, F i Faradays konstant, och c1 och c2 koncentrationerna av substrat för båda sidor av membranet.
    Equation 3
  3. Av ström-spänning inspelningar, ta omvänt potentiella beräknas med skillnaden av x-axeln korsningen punkter från den linjära passar i närvaro och frånvaro på toningen som substrat.
  4. Beräkna andelen substrat konduktans, Gsubstrat, att den totala membran konduktans, Gtotalt, av förhållandet mellan omvänd potential att Nernst potentiella11.
    Equation 4
  5. Beräkna de substrat omsättning nummer ΔNsubstrat per tid enhet ΔT från de substrat konduktans (G-substrat), spänningen U och laddningen av de substrat z:
    Equation 5
  6. Från förhållandet av transporterade substrat per gång till numrera av proteiner, beräkna den omsättning rate κ.
    Equation 6

Representative Results

För att verifiera minimering av diffusionen potentiella, mättes stabiliteten av ström-spänning mätningar av ett intakt membran. Figur 2Askildras representant-ström spänning inspelningar i närvaro (vita prickar) och frånvaro (svarta prickar) av en pH-gradient. Enligt Nernst ekvation inducerar pH gradient en förskjutning i spänning. Från x-axeln skärningspunkten för en linjär passform till data beräknas det potentiella skiftet. För att testa båda elektroderna, analyserades förskjutningen i x-axeln skärningspunkten för en standard Granulatfyllda elektrod (figur 2B; vita prickar) och en micro-agar salt bro (figur 2B, svarta prickar). En spänning ramp spelades tio gånger i rad och förskjutningen mot x-axeln är avbildad mot tiden. Medan den agar salt bridge elektroden hade en maximal förskjutning av mindre än 5 mV även efter 300 sekunder av mätning, standard elektroden varierade upp till 30 mV i oförutsägbara, slumpmässiga beteende.

Därefter testades båda elektroderna vid olika pH lutningar (figur 3A). För standard elektroden genererades en pH gradient av 0,35 och 1,0 (vita prickar); för agar salt bridge elektrod, pH övertoningar 0,35, 0,7 och 1,0 (svarta prickar). Förskjutningen i potential analyserades i tre oberoende mätningar. I motsats till en gradient av 0,35, där det uppmätta skiftet endast varierar något, förändrar spänning skiftet betydligt på pH gradient 1.0 i avsaknad av mikro-agar salt bron. Från en linjär passform till data är lutningen av funktionen 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH för standard elektroden och 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH för mikro-agar salt bridge elektroden. Enligt Nernst ekvation, det beräknade potentiella skiftet är 60,7 mV/ΔpH vid T = 32 ° C.

Med hjälp av mikro-agar salt bron, numret för proton-omsättning, var κ, mitokondriella UCP1 och UCP3 mätt och jämfört med tidigare mätningar (figur 3B). Liknar figur 3A, ΔpH = 1.0 genererades och omvänd potential mättes. Mängden protein i membranet var beräknad enligt formeln i avsnitt 4 i protokollet, med ett protein-lipid-förhållande på 4 µg / (mg lipid), ett molekylärt samlas av 33.000 och 750 Da för protein och lipid, en membran yta 3,53 x 10 -4 cm2, och ett område per lipid på 7,8 x 10-15 cm2. Den erhållna κwas 5,56 ± 0,38 s-1 och 4,10 ± 0,71 s-1 för UCP1 och UCP3, respektive (figur 3B).

Figure 1
Figur 1 : Elektrofysiologiska set-up med mikro-agar salt bron. (A) denna panel visar en skiss av set-up. Microcapillary spets som innehåller den agar salt lösning (skildras i orange) placeras mellan elektroden (svart) och buffert innehållande spetsen (blå). Membranet bildas på ytan i slutet av buffert innehållande spetsen (indikeras av pilen). (B) denna panel visar en bild av elektrofysiologiska set-up med genomförandet av mikro-agar salt bron. Pilarna pekar på elektroden, mikro-agar salt bron, referenselektroden och behållaren med buffertlösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Jämförelse av en mikro-agar salt bro och en standard Granulatfyllda elektrod. (A) denna panel visar en representativ ström-spänning mätning i närvaro (grå prickar) och frånvaro (vita prickar) av en pH-gradient av 1. Linjerna representerar en linjär passform till data, från vilka konduktans och x-axeln korsningen värden erhålls. Spänning skiftet utvärderas av skillnaden av båda inspelningarna korsningen värden. (B) denna panel visar förskjutningen av membranet potential av en standard Granulatfyllda elektrod (vita prickar) till en mikro-agar salt bridge elektrod (svarta prickar) i tid. Tio ström-spänning mätningar registrerades i rad och medelvärdet spänning övergången genom diffusion potentiella plottas mot tiden. I alla experiment, var membranet gjord av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueras med 15 mol % arakidonsyra vid en koncentration på 1,5 mg/mL. Bufferten innehöll 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS och 0.6 mM EGTA vid pH = 7.34 och T = 32 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Proton omsättning antal UCP1 och UCP3 beräknas från omvänd potential i närvaro av en pH-gradient. (A) denna panel visar övergången i potentialen av UCP1-innehållande membran av olika pH lutningar av en standard Granulatfyllda elektrod (vita prickar) och en micro-agar salt bridge elektrod (svarta prickar). Linjerna representerar en linjär passform till data. (B) denna panel visar proton omsättning antalet UCP1 (första datauppsättningen) och UCP3 (andra data set) som beräknas från förhållandet mellan spänning Skift till Nernst potential enligt formlerna i avsnitt 4 i protokollet. Den första stapeln av varje uppsättning representerar omsättning priser mätt med mikro-agar salt bron. Det andra fältet av varje datauppsättning representerar tidigare mätningar med en standard Granulatfyllda elektrod. Värden för UCP1 och UCP3 togs från Urbankovaet al. 3 och Macher o.a. 8. i alla mätningar, membranet var gjord av 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL rekonstitueras med 15 mol % AA och UCP1/UCP3. Koncentrationen av lipider och protein var 1,5 mg/mL och 4 µg/mg lipid, respektive. Bufferten innehöll 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS och 0.6 mM EGTA vid pH = 7.34 och T = 32 ° C. PH-värdet i bufferten för gradient mätningar ökades till 7,66, 8.00 eller 8,33 genom att lägga till TRIS och bytte i lösning innehållande pipetten. Värdena är medelvärde ± standardavvikelsen för tre oberoende mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Genomförandet av mikro-agar salt bron med elektroden minimerar dess potentiella diffusion och tillåter mer precisa mätningar av membranpotentialen genereras av en pH-gradient. I närvaro av olika transmembrana pH övertoningar, potentiella förskjutningen av båda elektroderna var acceptabelt på ΔpH = 0,35 när jämförande till det teoretiska värdet av Nernst equilibriumen potentiella (ΦNernst = 23,8 mV för ΔpH = 0,4). Men på mer Fysiologiskt pH lutningar, som för instans i mitokondrier mellan matrisen och intermembrane utrymme, standard Granulatfyllda elektroden misslyckades att exakt mäta det potentiella skiftet på ΔpH = 1 (figur 3A). Elektroden överbryggas med mikro-agar salt levereras de värden som var mycket mer jämförbara med teorin.

Diffusion potentiella kan också uppstå vid Granulatfyllda referenselektroden om buffertlösningen ändras under experimentet. Klorid-fri buffertlösning användes i experimenten sedan uncoupling protein föresloggs för att transportera kloridjoner, och pH justerades med Tris eller MES. Elektroden potential, i avsaknad av en betydande koncentration av klorid, beror främst på klorid orenheter i buffertlösningen. Dess sammansättning är oförändrad under experimenten, kommer det bara resultera i en konstant offset potential. För mätning av en absolut potentialskillnaden mellan de två elektroderna, kunde dock en enkel agar salt-bridge systemet (Ag/Granulatfyllda 3 M KCl) även användas för referenselektroden.

En mikro-agar salt bro balanserar den potentiella spridningen genom en Jämviktstiden av elektroden potentiella. För att stabilisera saltlösningen, lades 1% (w/v) agaros till förhindra blandning av saltlösningen med buffertlösningen. Salt jonerna K+ och Cl har liknande mobiliteter i vätska och balansera elektroden potentiella. För att korrekt installera salt bron, har agar salt lösningen till vara tillräckligt värms upp att fylla den microcapillary spetsen utan eventuella luftbubblor och för att täcka Granulatfyllda elektroden. Innan ytterligare användning har elektrisk kontakt mellan salt bridge elektroden och referenselektroden skall kontrolleras. Beroende på vilken tid de salt överbryggar används, måste saltlösningen vara tillräckligt geléartad för att förhindra någon blandning av saltlösningen med bufferten. Detta är särskilt viktigt om K+ eller Cl transportörer undersöks. Salt bron användes för en mycket kort tid och elueringen av agaros är försumbar i detta tidsintervall. En högre koncentration av agaros av upp till 5%, eller agar (3% - 5%), tillåter använder salt bron längre tid6,12.

Denna metod tillåter att fastställa transport kineticsen av membran transportör (i) med låg omsättning priser och (ii) mitokondrie proteiner av den inre membran, som knappast kan undersökas i standard patch clamp uppställningar13. Dess precision är främst beroende av omvänd potentiella mätning, vilken noggrannhet är minskade vid en låg total membran konduktans och liten koncentration övertoningar som inducerar en membranpotential nedanför bullret från inspelningen.

Med detta upplägg, mättes omsättning andelen UCP1 och UCP3 som producerats under samma förhållanden. På grund av den högre pH gradienten verkar de erhållna priserna vara mer exakt och ostörda av artefakter som följd av det mindre elektrod potentiella skiftet. Det kan användas för att ytterligare analysera och jämföra mitokondriella membranet transportörer produceras under liknande förhållanden.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den österrikiska forskningsfond (P31559-B20 till E.E.P.). Författarna tackar Sarah Bardakji med utmärkta tekniska bistånd inom produktion och beredning av mus UCP1 och UCP3 i proteoliposomes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
En mikro-agar Salt Bridge elektrod för att analysera Proton Omsättningshastigheten av rekombinant membranproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter