Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

Elektrofizyolojik ölçümlerde ters potansiyel hassas ölçüm elektrot potansiyel değiştirerek bir difüzyon potansiyel varlığı rahatsız ediyor. Bir mikro-agar tuz Köprüsü kullanarak, potansiyel difüzyon etkisini, hangi Sulandırılan rekombinant membran proteinlerinin substrat ciro sayıda daha hassas bir ölçüm sağlar küçültülür.

Abstract

Bugüne kadar tüm farmakolojik ilaçlar % 50'den fazla membran proteinlerinin taşıma kinetik hedef. Membran taşıyıcı proteinler lipid bilayer membranlar içinde yeniden elektrofizyolojik karakterizasyonu fizikokimyasal ve farmakolojik özelliklerinin değerlendirilmesi için güçlü ama hassas bir yöntemdir. Substrat ciro numarası farklı membran proteinlerinin etkinliğinin karşılaştırma sağlar benzersiz bir parametredir. Bir electrogenic nakliyesi, protein substrat devir hızı için doğrudan ilişkili olan bir membran potansiyel translocated ham malzeme degrade oluşturur. Gümüş klorür elektrotları kullanarak, sıvı kavşak potansiyel, bilinen bir difüzyon potansiyel, hangi elektrot potansiyeli değiştirir ve önemli ölçüde hassas membran potansiyeli ölçümleri bozan indüklenen olduğu. Difüzyon potansiyel elektrot potansiyeli ayarlayan bir tuz köprü ile en aza indirilebilir. Bu makalede, bir mikro-agar tuz Köprüsü Mikropipetler membran oluşumu için kullanır elektrofizyolojik set-up artırmak için tasarlanmıştır. Tuz solüsyonu özel, ek tarafından stabilize bir microcapillary pipet ucu içine girilir ve kolayca standart elektrot için monte edilebilir. Bir mikro-tuz Köprüsü elektrot elektrot potansiyeli daha istikrarlı bir standart elektrot karşılaştırılır. Bu sistemin uygulanması elektrot potansiyel stabilize ve membran potansiyel pH degrade tarafından oluşturulan daha hassas ölçümler sağlar. Bu sistemi kullanarak, proton ciro oranları mitokondriyal taşıyıcı UCP1 ve UCP3 reinvestigated ve daha önceki ölçümleri karşılaştırıldığında.

Introduction

Membran proteinlerinin % 60 kadar tarafından tüm bilinen ilaç ilaçlar1hedeflenir. Elektrofizyolojik ölçümleri membran proteinlerinin membran taşıyıcı proteinler tarafından aracılı yüzeylerde electrogenic taşımacılığının analiz etmek için güçlü ama hassas araçlardır. Taşıyıcılar, örneğin, harekete geçirmek ve inhibisyon yüzeylerde veya taşıma farmakolojik ve fiziksel özelliklerinin değerlendirilmesi transmembran mevcut uygulama sabit voltaj veya voltaj rampaları tarafından modülasyon sağlar kinetik. Özel ilgi zaman birimi başına bir membran protein tarafından translocated substrat görüntüler substrat ciro numarası var. Çeşitli membran proteinlerinin kinetik karşılaştırırken bu önemli bir parametredir. Membran arasında bir ücret substrat konsantrasyonu degrade oluşturma hangi belgili tanımlık substrate devir sayısı çıkarılabilir bir elektromotor kuvvet oluşturur.

Bir AgCl elektrot kullanarak, klorür-Alerjik arabellek varlığı elektrot potansiyel değiştirir ve akım-gerilim ölçümleri2vardiyada yol açan bir difüzyon potansiyel oluşturur. Bu parametreler de olduğundan her zaman mevcut, standart gürültülerinden ve kapasite ölçümleri için ihmal edilebilir olsa da bağımlı olan tek kayıt (kapasite), fark veya akım-gerilim kaydı (gürültülerinden) yamacında hangi potansiyel iptal eder. Ancak, kayıt substrat taşıma ile oluşturulur, ters potansiyel önemli ölçüde potansiyel difüzyon tarafından rahatsız. Böylece, için kesin ölçümler ters potansiyel elektrot potansiyelleri sabit tutulması gerek.

Potansiyel difüzyon iki yöntemlerle en aza indirilebilir: bilayer membran (i) varlığı bir membran3,4tarafında artırılması bir substrat konsantrasyonu vardır veya (ii) bir tuz Köprüsü elektrot potansiyel dengeler 5. belgili tanımlık ilk yöntem son derece ölçüleri istikrar üzerinde bağlıdır. Membran birkaç dakika, substrat substrat çözümde neredeyse eşit olarak dağıtılır kadar karıştırma altında ek için hayatta kalmak için sahip. Arada membran yırtığı ham malzeme degrade şarj edilmiş molekülleri ücretsiz exchange tarafından değiştirilmez ve ölçüleri yanlış açın. İkinci yöntem potansiyel difüzyon dengeler ama set-up boyutuyla sınırlıdır. Küçük bir uygulama ama tuz Köprüsü elektrofizyolojik bir set-up mikro bir aralıktaki işleyen6meydan okuyor. İkinci yöntem için tuz solüsyonu microcapillary bahşiş dolu ve difüzyon tuz solüsyonu ve arabellek çözümü engellemek için özel eklenmesiyle stabilize.

Bu protokol için bir mikro-agar tuz Köprüsü ve uygulama üzerinde pipet set-up7 dayalı bir elektrofizyolojik set-up içine basit bir üretimin açıklanmıştır. Microcapillary bahşiş 1 mol % (w/v) özel bir 3 M KCl çözüm içeren ve AgCl elektrot ve tampon çözümünü köprü için ayarlanır. Mikro-tuz Köprüsü avantajı zaman kayıtları elektrot potansiyel Shift ve membran çeşitli pH degradeler potansiyel daha kesin ölçümler tarafından görüntülenir. Rekombinant proteinler lipozomlar yeniden modeli sisteminde mitokondriyal taşıyıcı UCP1 ve benzer koşullar altında üretilen UCP3 ciro oranları reinvestigated ve önceki sonuçları3,8' e göre.

Protocol

1. üretim Uncoupling rekombinant proteinlerin (UCPs) ve düzlemsel Bilayer membran oluşumu

  1. Rekombinant UCP1 ve UCP3 Rupprecht vd tarafından açıklandığı gibi üretmek 9 ve Hilse vd. 10
  2. Beck ve ark. tarafından açıklandığı gibi geleneksel gereksiz plastik pipetler ipuçları düzlemsel bilayer membranlar formu 7

2. mikro-agar tuz Köprüsü elektrodu hazırlanması

  1. Microcapillary pipet ayarlayın (bkz. Tablo reçetesi) uygun uzunluk için ipucu.
    1. Arabellek içeren ipucu takılacak ve mikro-agar tuz Köprüsü elektrot uzunluğunu ölçmek için sürgülü bir kumpas kullanın boş bir ucunda konumunu işaretlemek.
      Dikkat: Microcapillary ipucu arabellek çözüm için ölçümleri girmek yeterince uzun olmalıdır.
    2. Microcapillary ucu keskin bıçak veya bıçak ile kesme ve kesme yüzeyi etanol ve su ile temizleyin.
  2. AgCl kaplı elektrot hazırlayın.
    1. Yaklaşık 8 cm uzunluğunda bir Ag kablo kesilmiş ve etanol ve su ile temizleyin.
    2. Zımpara bir parça alın ve aşağı 1 cm uzunluk tuz solüsyonu ile temas halinde olmalıdır tel, sonunda yüzeyinin pürüzsüz.
    3. Düzgünleştirilmiş sonuna 3 M KCl çözüm daldırma ve mamüllerinin klorür ile 10 için 1,5 V DC kaynağı kullanarak kat s.
    4. Elektrot su ile temiz, Kuru ve microcapillary ucuna kadar derin nüfuz AgCl elektrot kaplamasız taraftan uzunluğunu ayarlayın.
      Not: Protokol burada duraklatılmış.
  3. %1 (v/v) özel ile 3 M KCl tuz solüsyonu hazırlayın.
    1. KCl 4,47 g ağırlığında ve bir şişeye karıştırarak tarafından 20 mL su geçiyoruz.
    2. Karıştırıcı kaldırın, özel 0.2 g tartmak ve şişesi için ekleyin.
    3. Özel eritmek ve pıhtılaşma gelen engellemek için çözüm 100 ° c kadar ısı.
      Dikkat: Şişeye çok sıcak olacak. Çıplak elle sakın dokunma. Eldiven işleme için kullanın.
  4. Microcapillary ipucu özel tuz solüsyonu ile doldurun.
    Dikkat: Sıcak çözümdür. Eller ve iş dikkatle su sıçramasına önlemek için korumak.
    1. Özel pıhtılaşma başlarsa, tamamen özel tekrar eritmek için tuz solüsyonu kadar ısı.
    2. 10 µL agar tuz solüsyonu, microcapillary ucunu emmek. Yavaş yavaş emmek ve dikkatle hava önlemek için belgili tanımlık uç kabarcıklar.
    3. Pipet Ucu kaldırmak ve AgCl elektrot ucunu daha geniş taraftan itin. Elektrot tuz solüsyonu nüfuz sağlamaya.
    4. Oda sıcaklığına elektrot sakin ve amplifikatör takın.
  5. Arabellek ölçümleri için hazırlayın.
    1. 0.710 g Na2SO4, MES 0.195 g ağırlığında, 0.121 g TRIS ve 0.023 g EGTA, sonra bir ölçek için 100 mL distile su ekleyin ve çözüm karıştırın.
    2. PH elektrodu kullanarak arabellek pH değeri için kontrol edin ve 7,32 pH değerine ayarlayın.
    3. Referans elektrot ve agar tuz Köprüsü elektrot elektriksel temas içinde olduğundan emin olun.
      1. Arabellek 1 mL plastik bir kaba ekleyin.
      2. Referans elektrot ve agar tuz Köprüsü elektrot daldırma ve sinyal yanıt için kontrol edin. Sinyal yanıt doğruysa, 2.7 adıma geçin.
  6. Varsa yanlış sinyal yanıt ya da hiçbir elektriksel temas hiç, aşağıdaki sorun giderme gerçekleştirin.
    1. Elektrot tuz solüsyonu ile temas halinde olup olmadığını kontrol edin ve elektrot çözüm içine itin.
      Not: çözüm zaten çok yapışkan ise, mikro-agar tuz Köprüsü kaldırmak ve yeni microcapillary bahşiş hazırlamak.
    2. Hava kabarcıkları tuz solüsyonu içinde olup olmadığını kontrol edin. Evet ise, yeni microcapillary bahşiş hazırlayın.
    3. Tuz solüsyonu ile temas arabellek çözüm olup olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, sonra başka bir 1 mm ucu tüp ucunun kesti.
      Uyarı: ucu hala arabellek içeren ipucu nüfuz kadar uzun olduğundan emin olun. Eğer hala temas yok, yeni microcapillary bahşiş hazırlayın.
    4. Bu adımlardan hiçbiri yardım, yeni microcapillary bahşiş hazırlayın.
  7. İçin depolama, agar tuz Köprüsü elektrot 3 M KCl çözüm daldırma.
    Not: Burada protokol durdurulabilir. Bir duraklama için gecede, elektrot 3 M KCl tuz solüsyonu 4 ° C'de depolayın
  8. Arabellek içeren plastik ipucu hazırlayın.
    Not: elektrot gecede depolanmışsa, almak o dışarı ve izin oda sıcaklığında 30 dakika kadar ısı.
    1. Microcapillary bahşiş almak ve Tüp, dar bölümünün kenarından 2 cm Isıtma tel kullanarak yaklaşık 90 derece bükün.
    2. Bir çok keskin bir bıçak veya bıçak kullanmak ve viraj yaklaşık 5 mm tüp kesti.
    3. Vasıl belgili tanımlık son etanol ve su yüzeyi temizleyin ve ucu delik çapi ölçün. Bu, yüzeyinde alanı hesaplayın.
    4. Ucu 85:15 (v: v) hekzan: hexadecane ile yüzey kat.
      1. Çözücü 3 µL pipet ve ucundan kaldır.
      2. Böylece tüm belgili tanımlık uç içinde kalan solvent buharlaşıp 1 dakika bekleyin.
    5. Ölçüm ucu arabellek 3 µL ile doldurun ve tuz Köprüsü elektrot takın.
      Not: tuz Köprüsü elektrot ve referans elektrot elektriksel temas içinde adım 2.5.3 gerçekleştirerek yeniden denetleyin.
    6. Elektrik yok ilgili kişi varsa, aşağıdakileri denetleyin:
      1. Tuz Köprüsü elektrot ile temas arabellek çözüm olup olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, o zaman ya ucu arabellekte hacmini ya da daha uzun microcapillary bahşiş hazırlamak.
      2. Bir hava kabarcığı ise, mikro-tuz Köprüsü elektrot ucunu kaldır, ucu arabellekte dolum ve elektrot yeniden takın.

3. rekombinant Protein ile yeniden membran elektriksel parametrelerinin ölçümü

  1. Üçgen bir alternatif gerilim sinyal uygulamak maksimal gerilim Umax ile = 50 mV ve ΔTrampa 50 ms, dikdörtgen alternatif akım yanıt oluşturur =. Pozitif ve negatif akımları (+ ve ben-) ortalama değerleri aşağıdaki formüle göre membran kapasiteyi hesaplamak:
    Equation 1
  2. -50 arasında değişen bir gerilim rampa uygulamak mV + 50 mV ve kayıt mevcut. -Yamaç gürültülerinden mı - veri doğrusal bir işleve uygun ve uygun x ekseni kesişim noktasını hesaplar.
  3. Plastik ucu çözümde deşarj ve yeni bir yüksek substrat konsantrasyonu içeren bir arabellek ile doldurun.
    1. Hiçbir membran ilk 20-30 s içinde oluşan, birimin deşarj ve bu doldurma. Bu konsantrasyon degrade membran boyunca membran oluşumu sırasında önemli ölçüde değişmez garanti eder.
    2. Bir membran oluşumu sonra 3.1 ve 3.2 uygun membran oluşumu iyileşmediğini görmek ve x ekseni kesişim noktasını almak için adımları gerçekleştirin.

4. substrat ciro oranı hesaplama

Not: önceki çalışma ayrıntıları3,7için bkz.

  1. Membran lipit ve protein (MLipid ve MProtein), membran ve bir lipid baş grup (birmembran veLipid) alanı ve kitle başına protein oranını moleküler kütlesi üzerinden protein tahmin etmek lipid (r).
    Equation 2
  2. Taşınan substrat için potansiyel Nernst hesaplayın. R gaz sabiti, T sıcaklık, z nakli substrat, F Faraday'nın sürekli ve c şarj olan1 ve c2 membran her iki tarafının substrat konsantrasyonu.
    Equation 3
  3. Akım-gerilim kayıtları ters doğrusal uyar x ekseni kesişim noktaları farkı ile ham malzeme degrade de hesaplanan olası al.
  4. Nernst potansiyel11ters potansiyel oranı tarafından substrat gürültülerinden, Gsubstrat, GToplam, toplam membran gürültülerinden için oranını hesaplamak.
    Equation 4
  5. Substrat ciro numarası ΔN hesaplamak zaman birimi ΔT substrat gürültülerinden (Gsubstrat), uygulanan gerilim U ve substrat z: ücrettensubstrat
    Equation 5
  6. Taşınan substrat birim zamanda proteinler sayısına oranı ciro oranı κ hesaplayın.
    Equation 6

Representative Results

Potansiyel difüzyon indirilmesi doğrulamak için sağlam bir membran akım-gerilim ölçümleri kararlılığını ölçüldü. Şekil 2içindeA, temsilcisi akım voltaj kayıtları varlığı (beyaz nokta) ve pH degrade yokluğu (siyah nokta) tasvir edilmektedir. Nernst denklemi göre pH degrade bir vardiyada gerilim indükler. Veri doğrusal bir uyum x ekseni kesişme noktasından potansiyel shift hesaplanır. Her iki elektrot test etmek için x ekseni kesişim noktasını vardiyada bir standart AgCl elektrot (Şekil 2B; beyaz noktalar) ve bir mikro-agar tuz Köprüsü (Şekil 2B; siyah noktalar) için analiz edildi. Bir gerilim rampa on kere üst üste kaydedildi ve x ekseni ortalama vardiyada zamana karşı tasvir edilir. Agar tuz Köprüsü elektrot 5'ten bir maksimum kayma vardı oysa mV ölçüm, standart elektrot 300 saniye sonra bile 30 çeşitli mV öngörülemeyen, rasgele, davranış.

Daha sonra her iki elektrot farklı pH gradyanlar (Şekil 3A) test edildi. Standart elektrot için pH degrade 0,35 ve 1.0 (beyaz nokta) oluşturuldu; agar tuz Köprüsü elektrot, pH degradeler 0,35, 0.7 ve 1.0 (siyah nokta) için. Potansiyel vardiyada üç bağımsız ölçümlerde analiz edildi. Nerede ölçülen üst karakter sadece biraz değişir, 0.35, degrade aksine gerilim shift pH degrade 1.0 mikro-agar tuz Köprüsü yokluğunda, önemli ölçüde değiştirir. Bir doğrusal verilere, işlev eğimi 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH için standart elektrot ve 50.1 ± 4,6 mV/ΔpH mikro-agar tuz Köprüsü elektrot için seçimdir. Nernst denklemi göre hesaplanan olası vardiya 's 60,7 mV/ΔpH t = 32 ° C.

Mikro-agar tuz Köprüsü, proton ciro numarası kullanarak κ, mitokondriyal UCP1 ve UCP3 ölçülen ve önceki ölçümler (resim 3B) karşılaştırıldığında. Benzer Şekil 3A, ΔpH = 1.0 oluşturulur ve ters potansiyel ölçüldü. Zarda protein miktarı kısmında 4 Protokolü ' nün bir protein 4 µg lipid oranı ile sağlanan formüle göre tahmin edilmiştir / (lipid mg), protein ve lipit, membran yüzey alanı 3,53 x 10 için 33.000 ve 750 Da moleküler kütlesi -4 cm2ve 10-15 cm2x 7,8 lipid başına bir alan. UCP1 ve UCP3, sırasıyla elde κwas 5,56 ± 0,38 s-1 ve 4.10 ± 0.71 s-1 (Şekil 3B).

Figure 1
Resim 1 : Mikro-agar tuz Köprüsü ile elektrofizyolojik set-up. Sketch up bir (A) Bu panel gösterir. (Turuncu tasvir) agar tuz solüsyonu içeren microcapillary İpucu (mavi) (siyah) elektrot ile arabellek içeren ipucu arasına yerleştirilir. Membran yüzeyinde (okla gösterilen) arabellek içeren ipucu sonunda oluşur. (B) Bu panel elektrofizyolojik set-up bir görüntü, mikro-agar tuz Köprüsü Uygulama gösterir. Elektrot, mikro-agar tuz Köprüsü, referans elektrot ve kapsayıcı arabellek çözüm ile okları üzerine gelin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Bir mikro-agar tuz Köprüsü ve standart AgCl elektrot karşılaştırılması. (A) Bu panel gösterir bir temsilcisi akım-gerilim ölçüm varlığı (gri nokta) ve pH degrade 1 (beyaz nokta) yokluğu. Satırları temsil eden hangi gürültülerinden ve x ekseni kesişim değerleri elde edilen veriler için doğrusal bir uyum. Gerilim shift kavşak değerleri her iki kayıtları fark tarafından değerlendirilir. (B) Bu panel membran kayması zamanında bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot (siyah nokta) için standart bir AgCl elektrot (beyaz nokta) potansiyel gösterir. On akım-gerilim ölçümleri üst üste kaydedildi ve ortalama gerilim shift tarafından difüzyon potansiyel zamana karşı çizilir. Tüm deneyler, membran 45:45:10 mol % 15 mol % araşidonik asit 1.5 mg/mL bir konsantrasyon ile yeniden DOPC:DOPE:CL yapılmıştır. Arabellek 50 mM Na2SO4, içerdiği 7,34 ve T = 10 mM MES, 10 mM TRIS ve 0.6 mM EGTA pH = 32 ° C. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Ters potansiyel pH degrade huzurunda üzerinden hesaplanan proton devir sayısı UCP1 ve UCP3. (A) Bu panel gösterir shift çeşitli pH degradeler bir standart AgCl elektrot (beyaz nokta) ve mikro-agar tuz Köprüsü elektrot (siyah nokta) bir UCP1 içeren membran potansiyeli. Satırları temsil eden veri doğrusal bir uyum. (B) Bu panel UCP1 proton devir sayısını gösterir (ilk veri kümesi) ve UCP3 (ikinci veri kümesi) olarak gerilim değişme oranı üzerinden Nernst potansiyel bölümünde 4 Protokolü'nün formüllerine göre hesaplanan. Her kümesinin ilk bar mikro-agar tuz Köprüsü ile ölçülen ciro oranları temsil eder. İkinci bar her veri kümesinin standart AgCl elektrot kullanarak önceki ölçüleri temsil eder. UCP1 ve UCP3 değerleri Urbankovave ark. alınmıştır 3 ve Macher vd. 8. tüm ölçüleri, membran 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 15 mol % AA ve UCP1/UCP3 ile yeniden yapılmıştır. Lipid ve protein konsantrasyonu sırasıyla 1.5 mg/mL ve lipid, 4 µg/mg oldu. Arabellek 50 mM Na2SO4, içerdiği 7,34 ve T = 10 mM MES, 10 mM TRIS ve 0.6 mM EGTA pH = 32 ° C. Degrade ölçümleri için önbellek pH 7, 66 yı, 8,00 veya 8.33 TRIS ekleyerek yükseltilmiştir ve solüsyon içeren pipet değiştirildi. Üç bağımsız ölçümlerin ortalama ± standart sapma değerlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Mikro-agar tuz Köprüsü elektrot ile uygulanması, difüzyon potansiyel en aza indirir ve daha kesin ölçümler membran potansiyel pH degrade tarafından oluşturulan sağlar. Çeşitli transmembran pH degradeler varlığında, her iki elektrot potansiyel kayma ΔpH kabul edilebilir potansiyel Nernst denge teorik değerini karşılaştırırken 0,35 = (ΦNernst 23,8 = mV ΔpH için 0,4 =). Tam olarak ΔpH, potansiyel shift ölçmek matris ve intermembrane alanı, standart AgCl elektrot arasında mitokondri örneğinde işlemi başarısız oldu ancak, daha fazla fizyolojik pH degradeler olarak (Şekil 3A) = 1. Mikro-agar tuz ile Köprü elektrot teorisi için çok daha karşılaştırılabilir değerler teslim.

Deneme sırasında arabellek çözüm değiştirilirse difüzyon potansiyel AgCl referans elektrot da oluşabilir. Klorür-Alerjik arabellek çözüm deneylerde beri uncoupling proteinler klorür iyonları taşımak için önerilen ve pH Tris veya MES kullanılarak ayarlanmış kullanıldı. Elektrot potansiyel, klorür, önemli bir konsantrasyon olmaması durumunda öncelikle klorür kirleri arabellek çözüm bağlıdır. Kompozisyonunu deneyler sırasında değişmeden olduğu gibi sadece bir sabit mahsup potansiyel neden olur. Ancak, mutlak bir potansiyel farkı iki elektrot arasındaki ölçüm için bir basit agar tuz-köprü sistemi (Ag/AgCl 3 M KCl) de referans elektrot için kullanılabilir.

Bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot potansiyel bir denge tarafından difüzyon potansiyel dengeler. Tuz solüsyonu stabilize etmek amacıyla, %1 (w/v) özel arabellek çözüm ile tuz solüsyonu karıştırma önlemek için eklendi. Tuz iyonları K+ ve Cl- benzer mobilities sıvı var ve elektrot potansiyel denge. Düzgün tuz Köprüsü kurmak için agar tuz solüsyonu yeterince microcapillary ipucu olmadan herhangi bir hava kabarcıkları doldurmak için ve AgCl elektrot karşılamak için ısıtmalı zorunda. Daha önce kullanımı, kontrol edilmesi tuz Köprüsü elektrot ve referans elektrot arasındaki elektriksel temas var. Tuz Köprüsü kullanıldığında bağlı olarak, tuz solüsyonu yeterince herhangi bir tuz solüsyonu ile tampon karıştırma önlemek için genellikle zorunda. K+ veya Cl- taşıyıcılar incelenmiştir Eğer bu özellikle önemlidir. Tuz Köprüsü için çok kısa bir süre kullanıldı ve özel elüsyon bu tarih aralığında ihmal edilebilir düzeydedir. Özel % 5'e kadar veya agar (% 3 - % 5), daha yüksek bir konsantrasyon saat6,12uzun bir süre için tuz Köprüsü kullanarak sağlar.

Bu yöntem bir membran taşıyıcı düşük ciro oranları ile (i) ve (ii) mitokondrial proteinlerin neredeyse standart yama kelepçe set-up13' te soruşturma olması iç membran taşıma kinetik belirleme sağlar. Onun hassas bir düşük toplam membran gürültülerinden ve kayıt ses potansiyel bir membran neden küçük konsantrasyon degradeler hangi doğruluğu azalır ters potansiyel ölçüm esas olarak bağlıdır.

Bu ayarı kullanarak, UCP1 ve aynı koşullar altında üretilen UCP3 ciro oranları ölçüldü. Yüksek pH degrade nedeniyle elde edilen oranları daha kesin ve küçük elektrot potansiyel vardiyasından çıkan eserler tarafından soğukkanlı görünmektedir. Daha fazla çözümlemek ve benzer koşullar altında üretilen mitokondrial membran taşıyıcı karşılaştırmak için kullanılabilir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser (E.E.P. için P31559-B20) Avusturyalı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Sulandırma, fare UCP1 ve UCP3 proteoliposomes ve yazarlar Sarah Bardakji üretim mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter