Elektrofizyolojik ölçümlerde ters potansiyel hassas ölçüm elektrot potansiyel değiştirerek bir difüzyon potansiyel varlığı rahatsız ediyor. Bir mikro-agar tuz Köprüsü kullanarak, potansiyel difüzyon etkisini, hangi Sulandırılan rekombinant membran proteinlerinin substrat ciro sayıda daha hassas bir ölçüm sağlar küçültülür.
Bugüne kadar tüm farmakolojik ilaçlar % 50’den fazla membran proteinlerinin taşıma kinetik hedef. Membran taşıyıcı proteinler lipid bilayer membranlar içinde yeniden elektrofizyolojik karakterizasyonu fizikokimyasal ve farmakolojik özelliklerinin değerlendirilmesi için güçlü ama hassas bir yöntemdir. Substrat ciro numarası farklı membran proteinlerinin etkinliğinin karşılaştırma sağlar benzersiz bir parametredir. Bir electrogenic nakliyesi, protein substrat devir hızı için doğrudan ilişkili olan bir membran potansiyel translocated ham malzeme degrade oluşturur. Gümüş klorür elektrotları kullanarak, sıvı kavşak potansiyel, bilinen bir difüzyon potansiyel, hangi elektrot potansiyeli değiştirir ve önemli ölçüde hassas membran potansiyeli ölçümleri bozan indüklenen olduğu. Difüzyon potansiyel elektrot potansiyeli ayarlayan bir tuz köprü ile en aza indirilebilir. Bu makalede, bir mikro-agar tuz Köprüsü Mikropipetler membran oluşumu için kullanır elektrofizyolojik set-up artırmak için tasarlanmıştır. Tuz solüsyonu özel, ek tarafından stabilize bir microcapillary pipet ucu içine girilir ve kolayca standart elektrot için monte edilebilir. Bir mikro-tuz Köprüsü elektrot elektrot potansiyeli daha istikrarlı bir standart elektrot karşılaştırılır. Bu sistemin uygulanması elektrot potansiyel stabilize ve membran potansiyel pH degrade tarafından oluşturulan daha hassas ölçümler sağlar. Bu sistemi kullanarak, proton ciro oranları mitokondriyal taşıyıcı UCP1 ve UCP3 reinvestigated ve daha önceki ölçümleri karşılaştırıldığında.
Membran proteinlerinin % 60 kadar tarafından tüm bilinen ilaç ilaçlar1hedeflenir. Elektrofizyolojik ölçümleri membran proteinlerinin membran taşıyıcı proteinler tarafından aracılı yüzeylerde electrogenic taşımacılığının analiz etmek için güçlü ama hassas araçlardır. Taşıyıcılar, örneğin, harekete geçirmek ve inhibisyon yüzeylerde veya taşıma farmakolojik ve fiziksel özelliklerinin değerlendirilmesi transmembran mevcut uygulama sabit voltaj veya voltaj rampaları tarafından modülasyon sağlar kinetik. Özel ilgi zaman birimi başına bir membran protein tarafından translocated substrat görüntüler substrat ciro numarası var. Çeşitli membran proteinlerinin kinetik karşılaştırırken bu önemli bir parametredir. Membran arasında bir ücret substrat konsantrasyonu degrade oluşturma hangi belgili tanımlık substrate devir sayısı çıkarılabilir bir elektromotor kuvvet oluşturur.
Bir AgCl elektrot kullanarak, klorür-Alerjik arabellek varlığı elektrot potansiyel değiştirir ve akım-gerilim ölçümleri2vardiyada yol açan bir difüzyon potansiyel oluşturur. Bu parametreler de olduğundan her zaman mevcut, standart gürültülerinden ve kapasite ölçümleri için ihmal edilebilir olsa da bağımlı olan tek kayıt (kapasite), fark veya akım-gerilim kaydı (gürültülerinden) yamacında hangi potansiyel iptal eder. Ancak, kayıt substrat taşıma ile oluşturulur, ters potansiyel önemli ölçüde potansiyel difüzyon tarafından rahatsız. Böylece, için kesin ölçümler ters potansiyel elektrot potansiyelleri sabit tutulması gerek.
Potansiyel difüzyon iki yöntemlerle en aza indirilebilir: bilayer membran (i) varlığı bir membran3,4tarafında artırılması bir substrat konsantrasyonu vardır veya (ii) bir tuz Köprüsü elektrot potansiyel dengeler 5. belgili tanımlık ilk yöntem son derece ölçüleri istikrar üzerinde bağlıdır. Membran birkaç dakika, substrat substrat çözümde neredeyse eşit olarak dağıtılır kadar karıştırma altında ek için hayatta kalmak için sahip. Arada membran yırtığı ham malzeme degrade şarj edilmiş molekülleri ücretsiz exchange tarafından değiştirilmez ve ölçüleri yanlış açın. İkinci yöntem potansiyel difüzyon dengeler ama set-up boyutuyla sınırlıdır. Küçük bir uygulama ama tuz Köprüsü elektrofizyolojik bir set-up mikro bir aralıktaki işleyen6meydan okuyor. İkinci yöntem için tuz solüsyonu microcapillary bahşiş dolu ve difüzyon tuz solüsyonu ve arabellek çözümü engellemek için özel eklenmesiyle stabilize.
Bu protokol için bir mikro-agar tuz Köprüsü ve uygulama üzerinde pipet set-up7 dayalı bir elektrofizyolojik set-up içine basit bir üretimin açıklanmıştır. Microcapillary bahşiş 1 mol % (w/v) özel bir 3 M KCl çözüm içeren ve AgCl elektrot ve tampon çözümünü köprü için ayarlanır. Mikro-tuz Köprüsü avantajı zaman kayıtları elektrot potansiyel Shift ve membran çeşitli pH degradeler potansiyel daha kesin ölçümler tarafından görüntülenir. Rekombinant proteinler lipozomlar yeniden modeli sisteminde mitokondriyal taşıyıcı UCP1 ve benzer koşullar altında üretilen UCP3 ciro oranları reinvestigated ve önceki sonuçları3,8‘ e göre.
Mikro-agar tuz Köprüsü elektrot ile uygulanması, difüzyon potansiyel en aza indirir ve daha kesin ölçümler membran potansiyel pH degrade tarafından oluşturulan sağlar. Çeşitli transmembran pH degradeler varlığında, her iki elektrot potansiyel kayma ΔpH kabul edilebilir potansiyel Nernst denge teorik değerini karşılaştırırken 0,35 = (ΦNernst 23,8 = mV ΔpH için 0,4 =). Tam olarak ΔpH, potansiyel shift ölçmek matris ve intermembrane alanı, standart AgCl elektrot arasında mitokondri örneğinde işlemi başarısız oldu ancak, daha fazla fizyolojik pH degradeler olarak (Şekil 3A) = 1. Mikro-agar tuz ile Köprü elektrot teorisi için çok daha karşılaştırılabilir değerler teslim.
Deneme sırasında arabellek çözüm değiştirilirse difüzyon potansiyel AgCl referans elektrot da oluşabilir. Klorür-Alerjik arabellek çözüm deneylerde beri uncoupling proteinler klorür iyonları taşımak için önerilen ve pH Tris veya MES kullanılarak ayarlanmış kullanıldı. Elektrot potansiyel, klorür, önemli bir konsantrasyon olmaması durumunda öncelikle klorür kirleri arabellek çözüm bağlıdır. Kompozisyonunu deneyler sırasında değişmeden olduğu gibi sadece bir sabit mahsup potansiyel neden olur. Ancak, mutlak bir potansiyel farkı iki elektrot arasındaki ölçüm için bir basit agar tuz-köprü sistemi (Ag/AgCl 3 M KCl) de referans elektrot için kullanılabilir.
Bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot potansiyel bir denge tarafından difüzyon potansiyel dengeler. Tuz solüsyonu stabilize etmek amacıyla, %1 (w/v) özel arabellek çözüm ile tuz solüsyonu karıştırma önlemek için eklendi. Tuz iyonları K+ ve Cl– benzer mobilities sıvı var ve elektrot potansiyel denge. Düzgün tuz Köprüsü kurmak için agar tuz solüsyonu yeterince microcapillary ipucu olmadan herhangi bir hava kabarcıkları doldurmak için ve AgCl elektrot karşılamak için ısıtmalı zorunda. Daha önce kullanımı, kontrol edilmesi tuz Köprüsü elektrot ve referans elektrot arasındaki elektriksel temas var. Tuz Köprüsü kullanıldığında bağlı olarak, tuz solüsyonu yeterince herhangi bir tuz solüsyonu ile tampon karıştırma önlemek için genellikle zorunda. K+ veya Cl– taşıyıcılar incelenmiştir Eğer bu özellikle önemlidir. Tuz Köprüsü için çok kısa bir süre kullanıldı ve özel elüsyon bu tarih aralığında ihmal edilebilir düzeydedir. Özel % 5’e kadar veya agar (% 3 – % 5), daha yüksek bir konsantrasyon saat6,12uzun bir süre için tuz Köprüsü kullanarak sağlar.
Bu yöntem bir membran taşıyıcı düşük ciro oranları ile (i) ve (ii) mitokondrial proteinlerin neredeyse standart yama kelepçe set-up13‘ te soruşturma olması iç membran taşıma kinetik belirleme sağlar. Onun hassas bir düşük toplam membran gürültülerinden ve kayıt ses potansiyel bir membran neden küçük konsantrasyon degradeler hangi doğruluğu azalır ters potansiyel ölçüm esas olarak bağlıdır.
Bu ayarı kullanarak, UCP1 ve aynı koşullar altında üretilen UCP3 ciro oranları ölçüldü. Yüksek pH degrade nedeniyle elde edilen oranları daha kesin ve küçük elektrot potansiyel vardiyasından çıkan eserler tarafından soğukkanlı görünmektedir. Daha fazla çözümlemek ve benzer koşullar altında üretilen mitokondrial membran taşıyıcı karşılaştırmak için kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser (E.E.P. için P31559-B20) Avusturyalı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Sulandırma, fare UCP1 ve UCP3 proteoliposomes ve yazarlar Sarah Bardakji üretim mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |