Summary
連続録画とザリガニの心臓と自発活動の分析のための非侵襲的バイオモニタ リング システムを提案する.このシステムは、近赤外光センサー、ビデオ追跡モジュール、およびその生理状態を反映し、心拍ゆらぎの中にザリガニの動作を特徴付けるザリガニ ハートビートを評価するためのソフトウェアで構成されています。
Abstract
ザリガニは、無脊椎動物の行動生理学的研究の実用的な生物学的モデルとして、水質の生物指標としての両方を提供する極めて重要な生物です。ザリガニは、水質悪化の原因物質を直接指定できません、にもかかわらず、すぐに (数秒) 内、心と行動の活動に急性の変化によって水質の悪化が人間を警告できます彼ら。
本研究では十分なシンプルさと信頼性の 1 つのモデルの組み合わせにより様々 な条件下で実装する単純な非侵襲的手法を提案します。
生物的有機体が環境評価プロセスの実装は、このアプローチは、警告と急性水周囲の環境悪化を防止するための信頼性の高い、タイムリーなアラームを提供します。したがって、ザリガニ生理に基づくこの非侵襲的システム、子豚パラメーター録音は水生環境の変化の検出について検討しました。飲料の製造に使用される水の質を制御するためのローカル ビール醸造所でこのシステムが適用される今が連続的な実時間の水質評価と定期的検査に任意の水処理と供給施設で使用できます。ザリガニの心臓の生理学および行動の調査。
Introduction
水生生物のアプリケーションでは、様々 な実験室調査1,2のためのモデル有機体と産業と自然/環境水品質3,4を監視するためのツールとしての対象、勉強もするが表示されます。それにもかかわらず、このトピックは、まだ科学的なコミュニティまたは他の職業に属しているかどうかに関係なく、人間のための注目すべき興味のです。特定パラメーター (いわゆる「バイオ」)5,6,7、8を選択するための最も重要な要件を監視する高度な方法の数の存在にもかかわらず、3 つの単純な要素から成っているインジケーター: シンプル (i)、(ii) 信頼性、および (iii) 一般の可用性。
ザリガニ、淡水動物の重要な代表として一線を画してそれ世界的な発見は、広まっている、操作に適した十分に大きく、固い甲羅があるほとんどの場合9、ので。この甲殻類は、比較的単純な組織10を維持する、同時に重要な生理学的システムとしながら、各部位の十分な開発を提供する高い無脊椎動物のグループに属しています。
科学文献で説明されているように、ざりがに類の生物学的および/または行動パラメーターの範囲の評価に基づく方法は一般的にバイオモニタ リングやザリガニ研究の発展に大きく貢献しています。ザリガニ心拍数測定のため現在入手可能な侵襲的方法のほとんどは、複雑で精密な手術11,12,13; が必要な心電図記録に基づいていますこのような操作に重大なストレスを引き起こすことができ、ザリガニによって長期適応を必要があります。また、それが知られていない長いザリガニがそのような電極を運ぶことができる方法、それは正常にこのような添付ファイルを運んでいる間脱皮されるかどうか。説明の非侵襲的方法ハードウェアの複雑性により、複雑な信号フィルタ リング14と増幅または精密で高価な光コンポーネント15 の調整回路を必要とするプレチスモ グラフの記録に基づいています ,16。
本研究では、既存の結果に貢献し、現在ザリガニ心拍数測定手順を改善するための新たな選択肢を提供するアプローチについて説明しました。利点の中で、(i) 長期生理学的な適応を必要としない高速かつ非侵襲的添付ファイル(ii) アメリカザリガニの脱皮; に脱皮から数ヶ月の期間内にセンサーを行う能力(iii) 複数のザリガニ; から同時に得られたデータの評価と行動活動リアルタイム心筋を監視できるソフトウェア(iv) の低価格とシンプルさ。述べるバイオモニタ リング システムは、非侵襲的、ざりがに類の etho 生理特性の変化に基づいてザリガニの心臓と自発活動の連続モニタリングを許可します。このシステムは、ザリガニの心臓の生理学や動物行動学、水治療、供給設備の水質を制御するための産業の実装に加えて検査で簡単に適用できます。
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Protocol
1. ザリガニの選択
- 現在のアプローチをザリガニに正常に適用するためにセンサーの取り付けについて (これは頭胸甲長 30 mm 以上の) 十分な甲羅サイズそれぞれ大人標本を選択、視覚的に、疾患の有無の確認、チェックかどうかそれにタッチしたときに、両方の鉗脚を持ち上げます。上記のパラメーターは、ザリガニ健康の対象となる状態を示します。
注:実験群をいくつかのパラメーターにに基づいて形成する場合、いくつかのザリガニは、トライアルで使用すると予測され、同じ条件にさらされている、: (i) と同様の重量と長さ。(ii) 匹敵する心拍数;(iii) 顕著な夜行性の活動;(iv) 規則的な食糧消費;(v) 脱皮間期17。時々、それはザリガニが心拍数測定による脱皮または視覚や触覚検査のみに近いかどうかを定義するは難しいしたがって、ザリガニの体液中総たんぱく量の解析は、便利です。ザリガニは脱皮間状態18よりも脱皮に近い場合より高いタンパク質含有されます。
2. ザリガニの心臓の活動と行動の記録
-
ザリガニ心拍数を非侵襲的測定するために予めこのプロシージャのセンサーを準備します。この前に、ザリガニを入れ水のタンクとセンサー19の準備に数日かかりますまた、数日間そこに慣れさせること。
- 軸とフォト トランジスタ、赤外線発光ダイオード (LED) のカップルします。ボードの上に光学センサー回路を添付します。それは、5 V の電源が必要です。LED 接続用 IR センサー基板の 200 Ω 抵抗を配置します。フォト トランジ スターを接続するために基板上 220 Ω 抵抗を配置します。
- ザリガニに接続されて、センサーの出力はザリガニの心臓の筋肉を充填体液の量によって変調され、LED からの入射光を散乱させます。照らされた IR LED 光と反射赤外フォト トランジ スターによって受信される、ザリガニの心から光の相互干渉を避けるために小さな壁を配置 (0.5 × 1.5 × 4 mm、厚さ x 高さ x 幅) 黒い帯電防止プラスチック製のLED とフォト トランジスタを。
- 防水パッケージに LED を置き、潜在的な被害 (図 1) から電子部品の保護のため甲に隣接する辺から防水の誘電体ゲルのセンサーの表面をカバーします。その最高の保護特性を得るために 3 日間乾燥ゲルをしましょう。
- アナログ信号の薄いフレキシブル ケーブル (約 3 m くらい) をセンサーに接続し、アナログ-デジタル変換器 (ADC) に接続このことから、デジタル化された信号に転送されますパソコン USB インターフェイス経由で心臓の活動を保存すると、ザリガニについてのポイントを分析、特別なソフトウェア リアルタイム (材料の表を参照)、ために格納されて、さらに詳細な分析。
- センサーの準備ができたら、すぐに、ザリガニを付けます。これを行うには、コンピューターのスイッチをソフトウェアを実行します。センサーと日付ファイルに保存する記録された心拍数に固定したザリガニの数を決定します。
- 水からザリガニを外し、ペーパー タオルでその背甲側を拭いてください。人間の手によって損害を避けるために、暖かい人間の手によるザリガニに付加的な圧力を排除するためにペーパー タオルで、鉗脚とザリガニの腹部をラップします。
注:氷の上やその固定センサー添付ファイルを操作する前に冷凍庫でザリガニの前冷却を使用しないでください。気温の差は、ザリガニ背側表面しだれに順番、ザリガニの甲から信頼性の低いセンサー固定及び簡単な接着剤の剥離につながるに します。 - 表面の準備 (すなわち、小さくて平たいプラスチックを取るまたは粘着テープの切れ端を引き裂くし、テーブルに修正) と接着剤のミキシングのための棒。管 A B 含むエポキシ接着剤から (直径約 0.5 cm) の 2 つの小滴を押し、すぐにそれらをミックスします。
- ザリガニの背甲にセンサーを接続し、心臓の信号の振幅が最大になる場所を見つけることを試みる。ザリガニを持つ 1 つの手のセンサーと、センサー上にある 4 つの補助線のそれぞれに混合接着剤のドロップを置く他のフリーハンドを使用すると、(2.1.1、2.1.4 の手順の間にそれらを修正します。)。接着剤が固まるまでセンサーに少なくとも 5 分を移動しないでください (接着剤硬化は周囲の温度と湿度により異なります)。
注:ザリガニ甲にセンサーを固定、徹底的に調べる甲側から全く心臓領域最高 (最大) の心臓の信号振幅領域を定義するために。それはより正確な心拍数の計算を提供するためにソフトウェアに役立ちます。 - 無料手を使用して接着剤をタッチし、それが定着していない場合我慢アンラップされたザリガニ接続されているセンサー (図 2) 水なしボックスに接着剤が完全に乾燥するまでいくつかの分以上。
注:ザリガニ、接着操作のための最適な温度は異なります 18 22 ° cこれらの温度で接着剤が 5 〜 7 分内で固まるし、8 に 10 分以内で完全に乾燥します。低温には、ザリガニのストレスは少なくなります。ただし、接着剤は、硬化に時間がかかる 15 の ° C と 10 ° C の下で約 15 〜 20 分それぞれ。特に 25 ° C 以上の高温で接着剤硬化 3 分以内が、ザリガニは、はるかに多くのストレスを受けるしたがって、甲殻類の水がなければ極端な条件への暴露を最小限にしようとします。 - ザリガニを水槽に戻す前に浸し、頭胸部、数秒の短い間隔で数回水, 鰓で蓄積してきた空気の放電を可能にするため、用水でザリガニを残す任意の余分な化学薬品を削除する約 1 h。このプロセスの完了後は、水の中にザリガニをリリースによって観測された生理指標の実験条件下で 1 〜 2 週間のために適応するようにし、なさい。順化期間中に最適な水交換は毎日です。
注:順応が、正常な状態では、ザリガニの特性には、顕著な概心と自発活動、定期的な食品消費、および (存在する場合)、特殊な避難所でほとんど日光を支出が含まれます。
3. カメラとソフトウェアのセットアップ
- ソフトウェアを起動します。ビデオ カメラ自動的に切り替わります。
- 動きの検出オプションを選択、画面に各タンクのエリアを徹底的に検出、動作を追跡し、心臓の活動記録とリンクが開始されます。
注:ザリガニの動き検出モジュールは、タンクと心臓の活動と動作を組み合わせたソフトウェアの下からザリガニの動作を追跡するビデオカメラで構成されます。モジュールからのデータは、ザリガニが高い活動を示す期間を排除することによってより正確な心臓の活動データ処理を容易にする使用されます。突然ザリガニの動き (すなわち、エスケープ反応または供給開始) は、変動や心臓の間隔計算の精度を下げる可能性のある心臓の信号の短時間のスパイクで起因できます。
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Representative Results
その結果、心と行動の活動、記録および txt 形式ファイル (図 3) に保存されたザリガニの組み合わせを得た。3 つの列の実験ザリガニ、日付、およびサンプリング レートの数、以外にもファイルので構成されています: (1) hh:mm:ss 形式で継続時間(2) 心拍数は 1 分当たりのビートで自動的に計算されます。(3) の歩行は不在 (0) または任意の運動の存在 (1) として登録されています。ゼロが動き、担当の携帯に割り当てられていたザリガニはアクティブではなかったとき、それが移動したときに、それぞれのセルに、ナンバーワン登場します。継続的に記録、データ ファイルに毎日 00:00 (12:00) が自動的に作成されます。それは心拍数 (図 4) で変更を引き起こしている可能性がありますので、歩行を含むように重要でした。10 後 s、におい (粉砕、フィルター、および希薄化後ユスリカ幼虫) は、ザリガニ、ペリスタ ポンプを含んでいるタンクに配信されました。14 s、ザリガニ認識刺激と微減のいわゆる方向づけの応答のための心拍数。後 20 s、心拍数増加、心臓の間隔の減少の結果します。26 で s、ザリガニは刺激源に向かって移動し、食品臭と歩行の開始によって引き起こされる両方生理学的な励起により実質的な心拍数増加しました。37 s、また急激なザリガニの動きの証拠があった。さらに、運動は、特定の刺激 (図 5) にザリガニの反応中に心拍数の成長に大幅に貢献したかもしれない。邪魔のザリガニは、通常時折歩行で 30-40 分間隔の間に見られるように心拍数の増加をしてください。しかし、50 を 45 分間歩行はより発音されます。この運動は大幅減少した移動の期間の間に見られるより高い心拍数に貢献しました。ザリガニの心臓の活動だけを含むデータを入手し、必要に応じて処理が行われる可能性がありますファイルからデータが別のアプリケーションに転送や上記のプログラミング アルゴリズムを使用した場合 (図 6)。妨げられていないザリガニの心拍数は、ハートビート曲線の単調な振幅によって特徴付けられるし、心臓各心臓のピーク間隔をほぼ同じ数で。
としてフラット広角レンズ標準ビデオ カメラで現在のカメラを交換する可能になる (渡されたなどの距離、タンクやアリーナ、歩行速度である特定の区域の好み) ザリガニの行動パターンを分析するために、現在使用しているカメラ録音していないが、ちょうど移動を追跡します。また、画面からビデオをキャッチするためのオンラインのアプリケーションのいずれかで記録を使用可能性があります。
図 1: 非侵襲的赤外線光電センサー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 信号のザリガニ、ウチダザリガニ試験、その甲にセンサーを保持します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: データ ファイルの例です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 通常から変更中にザリガニ ハートビート邪魔食べ物のにおいにさらされる条件。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 心拍数と平静 (0-30 分) と邪魔 (30-60 分) 条件でザリガニの歩行活動。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 平静ザリガニ心拍。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
常に発生しない行動応答の評価よりもザリガニの反応を記録するためのより信頼性の高いメソッドを (心または換気量または両方) など特定の生理学的パラメーターの測定にはそれ広く示唆されています。すぐに11。しかし、それはザリガニ ハートビートの理由を参照してくださいすることが可能となるので、実質ザリガニ環境の変化に反応を評価するための最も効率的な方法は心臓の活動と行動記録の組み合わせであることは明らか変更は、彼らは周囲の環境や歩行開始のための化学変化の結果として発生するか否か。水質モニタリング、中に心拍数の増加の効果を持つが、バイオモニタ リング システムのための警報を提示しない急激な動きを含むザリガニ生理学的マーカーの変化にすべての外部の影響を排除することが重要です。
正確で有益なハートビート評価を促進するための別の可能性は、ニトロプルシッドと心臓の活動は主にザリガニ心臓信号19の特定の図形に関連するザリガニの変力作用パラメーター解析です。そのような分析は、ハートビートは、毎分心拍数のみが変更された場合でもザリガニの心臓活動19に重要な変更を示すことができます二次パラメーターのいくつかを確認しました。
記述されているアプローチを使用しての利点の数にもかかわらずザリガニを監視周辺研究は触覚ザリガニ操作の絶対最小化に向けて移動しています。最近開発された非接触システム20センサーとそのそれぞれのワイヤの除去はモニタリングの手順の任意のサイズのザリガニを使用できることを意味します。また、1 つの実験エリア任意の配線のないワイヤ絡めとができませんので、ザリガニの運動制限で複数のザリガニを維持することが可能です。ザリガニは、その心臓領域を示す非常に反射テープのちょうど 2 つの小さな断片を運ぶでしょう。テープのこれらの作品は、いくつか後脱皮後もザリガニにアタッチできる日。ザリガニの心臓の活動や行動をビデオカメラによって記録され、分析した調整ソフトウェアによるリアルタイム。他の技術の進歩と共に変更されたアプローチは限られたハードウェアのための監視システムの価格の重要な低下を引き起こします。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究に支えられた教育省・青年・ チェコ共和国プロジェクト"CENAKVA"号のスポーツCZ.1.05/2.1.00/01.0024 と「CENAKVA II」号国家の持続可能性の下で LO1205 プログラム、助成機関南ボヘミア大学 České ブジェヨヴィツェ (012/2016/Z) のチェコスロバキア共和国 (第 16 - 06498S) の助成機関
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
- do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
- Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
- Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
- Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
- Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
- Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
- Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
- Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594 (2009).
- Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
- Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
- Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
- Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
- Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
- Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
- Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
- Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
- Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).
