Summary
Denne artikel præsenterer en noninvasiv bioovervågning system til kontinuerlig optagelse og analyser af krebs hjerte og bevægeapparatet aktiviteter. Dette system består af en nær-infrarød optisk sensor, en video-tracking modul og software til evaluering af krebs hjerteslag, der afspejler dens fysiologiske tilstand og karakteriserer Krebs adfærd under hjerteslag udsving.
Abstract
En Krebs er en afgørende akvatisk organisme, der fungerer både som en praktisk biologiske model for adfærdsmæssige og fysiologiske undersøgelser af hvirvelløse dyr og som en nyttig biologiske indikator for vandkvaliteten. Selvom Krebs ikke kan direkte angive de stoffer, der forårsager vand kvalitetsforringelse, kan de straks (indenfor få sekunder) advare mennesker af vand kvalitetsforringelse via akutte ændringer i deres hjerte og adfærdsmæssige aktiviteter.
I denne undersøgelse præsenterer vi en invasiv metode, der er enkel nok skal gennemføres under forskellige betingelser på grund af en kombination af enkelhed og pålidelighed i én model.
Denne tilgang, hvor de biologiske organismer er implementeret i miljømæssig evaluering processer, giver en pålidelig og rettidig alarm til advarsel og at forebygge akut vand forringelse i en omgivende miljø. Derfor, denne noninvasive system baseret på Krebs fysiologiske og etologiske parameter optagelser blev undersøgt for påvisning af ændringer i en vandmiljøet. Dette system nu anvendes på en lokal bryggeri for at kontrollere kvaliteten af det vand, der anvendes til fremstilling af drikke, men det kan bruges på enhver behandling af vand og levering facilitet for evaluering af kvaliteten af kontinuerlig, real-time vand og regelmæssig laboratorium undersøgelser af krebs hjerte fysiologi og adfærd.
Introduction
Genstand for akvatiske organismer ansøgninger, både som modelorganismer til forskellige laboratory efterforskninger1,2 og værktøjer til at overvåge industrielle og naturlige/miljømæssige vand kvalitet3,4 , synes at være godt undersøgt. Dette emne er imidlertid stadig af bemærkelsesværdige interesse for mennesker, uanset om de hører til det videnskabelige samfund eller til andre erhverv. På trods af eksistensen af en række avancerede metoder til overvågning af visse parametre (såkaldte "biomarkører")5,6,7,8, de vigtigste krav for at vælge en indikator består af tre enkle faktorer: a enkelhed, (ii) pålidelighed og (iii) almen tilgængelighed.
Krebs, adskiller som en vigtig repræsentant for ferskvand fauna, sig fordi det er fundet over hele verden, er udbredt, og i de fleste tilfælde9, har et tilstrækkeligt stort og hårdt rygskjoldet egnet til manipulation. Dette krebsdyr hører til gruppen af højere hvirvelløse dyr, der giver tilstrækkelig udvikling af vitale fysiologiske systemer og respektive organer, på samme tid, opretholde en forholdsvis enkel organisation10.
Metoder baseret på vurderingen af vifte af rejer biologiske og/eller adfærdsmæssige parametre, som beskrevet i den videnskabelige litteratur, har i høj grad bidraget til udviklingen af bioovervågning og Krebs undersøgelser i almindelighed. De fleste af de aktuelt tilgængelige invasive metoder for Krebs puls målinger er baseret på elektrokardiogram optagelser, der kræver en kompleks og præcise kirurgisk procedure11,12,13; sådanne manipulationer kan forårsage betydelige stress og kan kræve længere tids tilpasning af krebs. Også, det vides ikke hvor længe en Krebs kan bære disse elektroder og om det vil lykkedes molt samtidig med en vedhæftet fil. De beskrevne noninvasive metoder er baseret på plethysmographic optagelser, som er komplicerede hardware kompleksitet og kræver en conditioning kredsløb for signal filtrering14 og en forstærkning eller præcise og dyre optiske komponenter15 ,16.
I denne undersøgelse beskrev vi en tilgang, der bidrager til eksisterende resultater og tilbyder nye alternativer til forbedring af nuværende Krebs puls måleprocedurer. Blandt fordelene er der (i) en hurtig og noninvasive vedhæftet fil, der ikke kræver en langvarig fysiologisk tilpasning; (ii) rejer evne til at bære sensoren inden for en periode på et par måneder fra molting til molting; (iii) software i stand til at overvåge real-time hjerte og adfærdsmæssige aktiviteter og evalueringen af data samtidigt fra flere Krebs; (iv) en lav produktion pris og enkelthed. Bioovervågning systemet, der beskriver vi tillader noninvasive og kontinuerlig overvågning af krebs hjerte og bevægeapparatet aktiviteter baseret på ændringer i rejer etho-fysiologiske karakteristika. Dette system kan nemt anvendes i laboratorieundersøgelser af krebs hjerte fysiologi og/eller etologi, ud over industrielle implementeringer for kontrollen vandkvaliteten på vand rensning og forsyning faciliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Krebs udvalg
- Med succes anvende den nuværende tilgang til Krebs, vælge de respektive voksne prøver med tilstrækkelig rygskjoldet størrelser, (som er en rygskjoldslængde på mindst 30 mm) til sensor vedhæftet fil, visuelt undersøge det for fravær af sygdomme og tjekke om det løfter begge chelae når det er rørt. De ovennævnte parametre indikere en berettiget Krebs sundhedstilstand.
Bemærk: Hvis flere Krebs forventes at blive brugt i forsøget og er udsat for de samme betingelser, den eksperimentelle gruppe bør dannes baseret på flere parametre: (i) lignende vægt og længde; (ii) sammenlignelige puls; (iii) udtales natlige aktivitet; iv regelmæssig fødevareforbrug; (v) molting indbyrdes perioden17. Sommetider er det svært at definere, om en Krebs er tæt på molting af puls målinger eller visuelle eller taktile undersøgelser kun; analyser af de Krebs hemolymph samlede proteinindhold kan derfor være nyttige. Proteinindhold forventes at blive højere når Krebs er tættere på molting end i den indbyrdes molting state18.
2. optagelse af krebs hjertets aktivitet og adfærd
-
For at noninvasively måle Krebs hjerte rum, foreløbigt forberede sensor for denne procedure. Før dette, sætte en Krebs i tank med vand og lad det acclimate der for et par dage som forberedelse af sensor19 vil også tage et par dage.
- Aksialt par en IR light - emitting diode (LED) med en phototransistor. Fastgør optisk sensor kredsløb på et bord; det vil kræve en strømforsyning 5 V. Til LED-tilslutning, placere en 200 Ω modstand på IR sensor bord; for at forbinde phototransistor, skal du placere en 220 Ω modstand på brættet.
- Når der er knyttet til Krebs, sensor output moduleres af mængden af hemolymph udfylde hjertemuskulaturen krebs og scatters en indfaldende lys fra LED. For at undgå gensidige indblanding af den belyste IR lys af LED og reflekteret IR-lys fra Krebs hjerte, som er modtaget af phototransistor, placere en lille væg (0,5 x 1,5 x 4 mm, tykkelse x højde x bredde) lavet af sort plastik, antistatiske mellem LED og phototransistor.
- Placer LED i en vandtæt pakke, og dække overfladen af sensor med vandtæt dielektrisk gel fra den side, der støder op til skjoldet for beskyttelse af de elektroniske komponenter fra mulige skader (figur 1). Lad gelen tørre i 3 dage for at få sine bedste beskyttende egenskaber.
- For et analogt signal, tillægger sensoren tynde bøjelige kabler (ca 3 m lang) og tilsluttes analog til digital konverter (ADC); fra dette, en digitaliseret signal vil blive overført til en personlig computer via en USB-interface, på som punkt oplysninger om Krebs hjertets aktivitet gemmes, analyseres i realtid med særlig software (Se Tabel af materialer), og gemte for yderligere detaljerede analyser.
- Så snart sensoren er parat, fastgør den til krebs. For at gøre dette, tænder computeren og køre softwaren. Bestem antallet af krebs skal fastgøres til sensorer og indspillede puls bliver gemt i Datofilen.
- Fjern Krebs fra vandet og tør sin dorsale rygskjoldet side med et stykke køkkenrulle. Wrap chelae og maven af en Krebs i et stykke køkkenrulle for at undgå eventuelle skader af menneskehånd og fjerne ekstra stress på Krebs forårsaget af varm menneskelige hænder.
Bemærk: Brug ikke en tidligere afkøling af krebs på is eller i fryseren til sin immobilisering før manipulationer med sensor vedhæftet fil. Forskellen i temperaturer fører til Krebs dorsale overflade gråd som igen fører til upålidelige sensor fastgørelse og hurtig klæbende løsrivelse fra den Krebs skjoldet. - Forberede en overflade (dvs. tage en lille flad stykke plastic eller rive et stykke klistret tape og lave det til en tabel) og en stok til at blande limen. Tryk ud to små dråber (med en diameter på ca. 0,5 cm) fra rør A og B indeholdende epoxy lim og hurtigt bland dem.
- Tillægger Krebs dorsale rygskjoldet sensoren og forsøger at finde et sted, hvor hjertets signal amplitude er maksimal. Hold Krebs med sensor i den ene hånd, og brug de andre frie hænder, sætte en dråbe af blandet lim på hver af de fire ekstra ledninger placeret på sensoren (lave dem i mellem trin 2.1.1 og 2.1.4.). Flyt ikke sensoren i mindst 5 min., indtil limen hærder (lim hærdning afhænger af den omgivende temperatur og luftfugtighed).
Bemærk: Ved fastsættelsen af sensor til Krebs rygskjoldet, undersøge grundigt området hele hjerte fra rygskjoldet side for at definere området med den bedste (maksimal) hjerte signal amplitude. Det vil hjælpe software til at give mere præcise puls beregninger. - Touch lim med en fri hånd, og hvis det ikke er klistret, sætte det uindpakkede Krebs med den vedlagte sensor (figur 2) til boksen uden vand i få flere minutter, indtil limen er helt tør.
Bemærk: En optimal temperatur for krebs og lim manipulation varierer fra 18 til 22 ° C. Ved disse temperaturer, limen hærder indenfor 5-7 min og er helt tør inden for 8-10 min. Ved lavere temperaturer, er stress i Krebs mindre udtalt; limen skal dog mere tid til at hærde, ca 15 og 20 min under 15 ° C og 10 ° C, henholdsvis. Ved højere temperaturer, især over 25 ° C, limen hærder i 3 min, men Krebs gennemgår meget mere stress; derfor forsøge at minimere eksponering af krebsdyr til ekstreme forhold uden vand. - Inden du flytter Krebs tilbage i tanken, dyppe sin forkrop i vandet flere gange med korte mellemrum af et par sekunder for at give decharge af den luft, der er akkumuleret i gællerne, og forlade Krebs i vand til ca 1 time at fjerne eventuelle overskydende kemikalier. Når denne proces er fuldført, udsætning af krebs i vandet og gør det muligt at acclimate til en til to uger under forsøgsbetingelser, afhængigt af observerede fysiologiske indekser. Optimal vand exchange i acclimation perioder er hver anden dag.
Bemærk: Karakteristik af krebs, der har akklimatiseret og er i en sund tilstand omfatter udtalt døgnrytmen hjerte og bevægeapparatet aktiviteter, regelmæssig fødevareforbrug og udgifter de fleste dagslys i et specialiseret shelter (hvis det findes).
3. kamera og Software opsætning
- Starte softwaren; video kamera vil automatisk tænde.
- Vælg en indstilling i bevægelse opdagelse, opdager grundigt område af hver tank på skærmen og softwaren vil starte sporing adfærd og forbinder det med hjerte aktivitet optagelser.
Bemærk: En Krebs bevægelse opdagelse modul består af et videokamera, der sporer Krebs adfærd fra under tanken og den software, der kombinerer funktionaliteten med hjertets aktivitet. Data fra modulet anvendes til at lette mere præcise hjertets aktivitet databehandling ved at fjerne perioder, hvor Krebs demonstrerer høj lokomotiv aktivitet. Pludselig Krebs bevægelser (dvs. en flugt reaktion eller fodring indledning) kan resultere i svingninger eller kort tid pigge i cardiac signaler, der kan reducere beregningspræcisionen hjerte interval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et resultat, opnåede vi en kombination af krebs hjerte og adfærdsmæssige aktiviteter, optaget og gemt i en fil i txt-format (figur 3). Udover antallet af eksperimentelle Krebs, datoen og samplingfrekvens, filen består af tre søjler: (1) den løbende tid i klokkeslæt format. (2) pulsen beregnes automatisk i minuttet; (3) bevægelse registreret som fravær (0) eller tilstedeværelse (1) af enhver bevægelse. Når Krebs var inaktiv, nul var tildelt til den celle, der er ansvarlig for bevægelse, og når det flyttes, derefter nummer et dukkede op i de respektive celle. Når løbende optagelse, oprettes datafilen blev automatisk hver dag kl 00:00 timer (12:00 AM). Det var afgørende at medtage bevægelse, da det kan have forårsaget ændringer i hjertefrekvens (figur 4). Efter 10 s, en mad lugt (sleben, filtreret og fortyndet Chironomidae larver) blev leveret i tank indeholdende Krebs, ved hjælp af en peristaltisk pumpe. På 14 s, krebs anerkendt stimulus, og dets puls, faldt en anelse på grund af den såkaldte orientere svar. Efter 20 s, hjertefrekvensen øges, hvilket resulterer i et fald i kardiale intervaller. På 26 s, krebs flyttet mod stimulus kilde, og både fysiologiske excitation forårsaget af fødevarer lugt og locomotion indledning resulterede i en væsentlig puls stigning. På 37 s, der var også tegn på pludselige Krebs bevægelse. Derudover kunne bevægelse har væsentligt bidraget til puls vækst under den Krebs reaktioner på bestemte stimuli (figur 5). En forstyrret Krebs har typisk en stigning i hjertefrekvensen, som set under 30-40 min. interval med lejlighedsvise locomotion. Men under 45-50 min. interval, bevægelse er langt mere udtalt. Denne bevægelse har bidraget til en puls, der er væsentligt højere end set i løbet af perioden med nedsat bevægelsesevne. Hvis dataene fra filen er overført til et andet program eller den ovenstående programmering algoritme bruges, de data, der indeholder bare den kardiale aktivitet af krebs kunne opnås og efterfølgende behandles om nødvendigt (figur 6). Puls af uforstyrret Krebs er karakteriseret ved en monoton amplitude af hjerteslag kurve og af omtrent lig hjerte mellemrum mellem hvert hjerte peak.
For at analysere Krebs adfærdsmæssige mønstre (såsom bestået afstand, præference for et bestemt område i tank eller arena og bevægelse hastighed), det ville være muligt at udveksle aktuelle kameraet med en standard videokamera med en flad vidvinkel linse, som de aktuelt anvendte kamera gør ikke en optagelse men sporer kun bevægelse. Alternativt, en optagelse med nogen af de online programmer til at fange en video fra skærmen kunne bruges.
Figur 1 : Noninvasive infrarød optoelektroniske sensor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Signal Krebs, Pacifastacus leniusculus, holde sensoren på dens rygskjoldet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Et eksempel på datafilen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Krebs hjerteslag under forandring fra normal til forstyrret betingelser når de udsættes for fødevarer lugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Puls og locomotion aktiviteter af en Krebs i uforstyrret (0 – 30 min) og forstyrret (30-60 min) betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Uforstyrret Krebs puls. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det blevet almindeligt foreslået, at måling af visse fysiologiske parametre (såsom hjerte eller ventilation sats eller begge dele) er en mere pålidelig metode til registrering af krebs reaktioner end vurdering af adfærdsmæssige reaktioner, der ikke altid forekommer straks11. Det er imidlertid klart, at den mest effektive tilgang til at vurdere virkelige Krebs reaktioner på miljømæssige ændringer er kombinationen af hjertets aktivitet og adfærd optagelser, da det gør det muligt at se årsag(er) til Krebs hjerteslag ændringer og om de opstår som følge af kemiske ændringer i det omgivende miljø eller på grund af locomotion indledning. Under vand kvalitet overvågning er det vigtigt at fjerne alle eksterne påvirkninger på ændringer i Krebs fysiologiske markører, herunder pludselige bevægelser, der have stigende indvirkning på pulsen men ikke præsentere en alarm for bioovervågning system.
En anden mulighed for at lette en mere præcis og informativ hjerteslag vurdering er kronotropiske og inotrope parameter analyser af krebs hjerte aktiviteter hovedsagelig vedrører bestemte figurer i Krebs hjerte signaler19. Sådanne analyser bekræftet, at selv når hjerteslag ændres kun et par slag i minuttet, kan nogle af de sekundære parametre viser betydelige ændringer i Krebs hjerte aktiviteter19.
Trods antallet af fordele i benytter metoden beskrevet, har forskning omkring overvågning Krebs flyttet mod en absolut minimering af taktile Krebs manipulationer. I den nyligt udviklede kontaktløse system20betyder fjernelsen af sensorer og deres respektive ledninger at Krebs af enhver størrelse kan bruges til overvågningsproceduren. Det er også muligt at holde flere Krebs i et eksperimenterende område da fraværet af nogen ledninger forhindrer wire sammenfiltring og Krebs transportrestriktioner. Krebs vil bære blot to små stykker af en stærkt reflekterende tape, der angiver dens hjerte område. Disse stykker tape kan knyttes til Krebs selv efter et par post molting dage. Krebs hjerte aktiviteter og adfærd er optaget af den video kameraet og analyseret i realtid af den koordinerende software. Sammen med andre tekniske fremskridt, vil den ændrede tilgang medføre et betydeligt fald i prisen på overvågningssystem på grund af begrænset hardware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og sport i Tjekkiet-projekter "CENAKVA" nr. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 og "CENAKVA II'' No. LO1205 under den nationale bæredygtighed Program jeg, af Grant agenturet af Universitet i Sydböhmen i České Budějovice (012/2016/Z), og Grant agenturet af Den Tjekkiske Republik (nr. 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
- do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
- Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
- Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
- Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
- Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
- Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
- Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
- Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594 (2009).
- Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
- Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
- Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
- Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
- Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
- Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
- Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
- Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
- Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).
