Summary
Este artículo presenta un sistema de control biológico no invasor para el registro continuo y análisis de las actividades cardíaca y locomotor cangrejos de río. Este sistema consta de un sensor óptico y de infrarrojo cercano, un módulo de seguimiento de video y software para la evaluación de latidos de cangrejos de río que refleja su condición fisiológica y caracteriza el comportamiento del cangrejo durante las fluctuaciones del ritmo cardíaco.
Abstract
Un cangrejo de río es un organismo acuático fundamental que sirve como un práctico modelo biológico para estudios de comportamiento y fisiológicos de invertebrados y un útil indicador biológico de la calidad del agua. Aunque cigalas directamente no pueden especificar las sustancias que provocan el deterioro de la calidad de agua, puede inmediatamente (dentro de unos pocos segundos) advierten que los seres humanos de deterioro de la calidad del agua a través de cambios agudos en su actividad cardiaca y de comportamiento.
En este estudio, presentamos un método no invasivo que es simple de implementar en diversas condiciones debido a una combinación de simplicidad y fiabilidad en un modelo.
Este enfoque, en el que los organismos biológicos se aplican en los procesos de evaluación ambiental, proporciona una alarma de aviso y prevención de la deterioración aguda de agua en un ambiente confiable y oportuna. Por lo tanto, este sistema no invasivo basado en cigalas fisiológicas y grabaciones de parámetros etológicos fue investigado para la detección de cambios en el medioambiente acuático. Este sistema se aplica en una cervecería local para el control de calidad del agua utilizada para la producción de la bebida, pero puede ser utilizado en cualquier tratamiento de aguas y suministro de instalaciones para la evaluación de la calidad de agua continua, en tiempo real y para laboratorio regular investigaciones de fisiología cardiaca de cangrejos de río y el comportamiento.
Introduction
El tema de las aplicaciones de los organismos acuáticos, como organismos modelo para diversas investigaciones de laboratorio1,2 y como herramientas para el monitoreo de calidad de agua industrial y medio ambiente natural3,4 , parece ser bien estudiado. Sin embargo, este tema es de notable interés para los seres humanos, independientemente de si pertenecen a la comunidad científica o a otras ocupaciones. A pesar de la existencia de un número de métodos avanzados para el control de ciertos parámetros (llamados "biomarcadores")5,6,7,8, los requisitos más importantes para la selección de un indicador consiste de tres simples factores: (i) la simplicidad, (ii) confiabilidad y disponibilidad (iii) general.
Cangrejo de río, como un representante fundamental de la fauna de agua dulce, se distingue porque se encuentra en todo el mundo, es generalizada y, en la mayoría de los casos9, tiene un caparazón lo suficientemente grande y duro apto para la manipulación. Este crustáceo pertenece al grupo de los invertebrados superiores que proporcionan suficiente desarrollo de los sistemas fisiológicos vitales y órganos respectivos y, al mismo tiempo, mantener una organización relativamente simple10.
Métodos basados en la evaluación de la gama de los parámetros biológicos y comportamiento de langostas, como se describe en la literatura científica, han contribuido significativamente al desarrollo de estudios de biomonitoreo y cangrejos de río en general. La mayoría de los métodos invasivos disponibles actualmente para mediciones de pulso de cangrejos se basa en registros de electrocardiograma que requieren un procedimiento quirúrgico complejo y preciso11,12,13; Estas manipulaciones pueden causar un estrés significativo para y requieran adaptación prolongada por el cangrejo. Además, no se sabe cómo largo un cangrejo de río puede llevar tales electrodos y si con éxito se muda al llevar dichos datos adjuntos. Los métodos no invasivos descritos se basan en grabaciones pletismográfica, que son complicadas por la complejidad del hardware y requieren un circuito de acondicionamiento para el filtrado de la señal14 y una amplificación o componentes ópticos precisos y costosos15 ,16.
En este estudio, describe un enfoque que contribuye a los resultados existentes y ofrece nuevas alternativas para mejorar los actuales procedimientos de medición de pulso de cangrejos de río. Entre las ventajas, se encuentran (i) un accesorio rápido y no invasivo que no requiere una adaptación fisiológica prolongada; (ii) capacidad langostas para llevar el sensor dentro de un período de algunos meses de muda en muda; (iii) el software capaz de monitoreo cardiaco en tiempo real y actividades conductuales y la evaluación de los datos obtenidos simultáneamente de varios cangrejos de río; (iv) una producción baja de precio y simplicidad. El sistema de biomonitoreo que describimos permite no invasivo y continuo monitoreo de cigalas cardiaca y locomotor las actividades basadas en cambios en las características fisiológicas etho de langostas. Este sistema puede aplicarse fácilmente en los exámenes de laboratorio de la fisiología cardiaca cigalas o etología, además de implementaciones industriales para el control de calidad del agua en instalaciones de tratamiento y suministro de agua.
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Protocol
1. cangrejos selección
- Para aplicar con éxito el enfoque actual a las cigalas, seleccione a los respectivos ejemplares adultos con suficiente tamaño de caparazón (que es una longitud de caparazón de menos de 30 mm) para montaje de sensor, visualmente examinar la ausencia de enfermedades y compruebe Si levanta tanto quelos cuando se toca. Los parámetros antes mencionados indican un estado elegible de salud de cangrejos de río.
Nota: Si varios cangrejos de río se esperan que se utilizará en el juicio y están expuestos a las mismas condiciones, el grupo experimental debe ser formado en base a varios parámetros: (i) similares peso y longitud; (ii) pulso comparable; (iii) pronunciada actividad nocturna; (iv) consumo de alimentos regular; (v) la muda período17. A veces, es difícil definir si un cangrejo de río es cerca de muda por las mediciones de la frecuencia cardíaca o exámenes visuales o táctiles por lo tanto, el análisis de contenido de proteína total de hemolinfa de la langosta pueden ser útiles. Contenido de proteína se espera a ser mayor cuando el cangrejo está más cercano de la muda que en la muda de estado18.
2. registro de actividad cardiaca de cangrejos de río y el comportamiento
-
Para medir no invasor cangrejo corazón tarifas, preliminarmente prepare el sensor para este procedimiento. Antes de esto, pone un cangrejo de río en el tanque con agua y deje que se adapte allí por unos días como la preparación del sensor19 también tomará unos pocos días.
- Pareja axialmente un IR diodo electroluminoso (LED) con un fototransistor. Conecte el circuito del sensor óptico en una tarjeta; es necesario una fuente de alimentación de 5 V. Para la conexión del LED, colocar una resistencia de 200 Ω en el tablero de sensor de IR; para conectar el fototransistor, colocar un resistor de 220 Ω en el tablero.
- Cuando el cangrejo, la salida del sensor es modulada por la cantidad de hemolinfa llena el músculo cardiaco de cigalas y esparce una luz incidente de lo LED. Con el fin de evitar interferencias recíprocas de la iluminada IR ligero por el LED y el IR reflejado luz desde el corazón del cangrejo de río, que es recibido por el fototransistor, colocar un pequeño muro (0.5 x 1.5 x 4 mm, grosor x altura x anchura) de plástico antiestático negro entre el LED y el fototransistor.
- Colocar el LED en un paquete impermeable y cubrir la superficie del sensor con el gel dieléctrico resistente al agua desde el lado adyacente al caparazón para la protección de los componentes electrónicos de posibles daños (figura 1). Deje que el gel seco durante 3 días para conseguir sus mejores propiedades protectoras.
- Para una señal analógica, Conecte cables flexibles finos (aproximadamente 3 m de largo) al sensor y conecte el convertidor de analógico a digital (ADC); de esto, una señal digitalizada será transferida a un ordenador personal sobre una interfaz USB, que la información sobre el cangrejo se guarda la actividad cardiaca, analizados en tiempo real con un software especial (véase Tabla de materiales) y almacenados para análisis más detallados.
- Tan pronto como está preparado el sensor, conéctelo a la cigala. Para ello, encienda el ordenador y ejecute el software. Determinar el número de cangrejos de río a fijarse en los sensores y pulso grabados que se guardan en el archivo de la fecha.
- Retire el cangrejo de agua y su parte dorsal del caparazón con una toalla de papel. Envuelva las quelos y abdomen de los cangrejos en la toalla de papel para evitar daños por la mano humana y para eliminar el estrés adicional en el cangrejo causado por manos humanas cálidas.
Nota: No utilice un enfriamiento previo de la cigala en hielo o en el congelador para su inmovilización antes de manipulaciones con el accesorio de sensor. La diferencia de temperaturas lleva cangrejo dorsal superficial llanto que, a su vez, conduce al sensor confiable sujeción y rápida separación adhesivo de caparazón de cangrejo. - Preparar una superficie (es decir, tomar un pequeño trozo plano de plástico o rasgar un pedazo de cinta adhesiva y fijar a una tabla) y un palo para mezclar el pegamento. Extraer dos gotas pequeñas (de un diámetro de unos 0,5 cm) de los tubos A y B que contienen pegamento de epoxi y mezclar rápidamente.
- Coloque el sensor en el caparazón dorsal de cangrejos de río y tratar de encontrar el lugar en que la amplitud de la señal cardiaca sería máxima. Sostenga el cangrejo con el sensor en una mano y con la otra mano libre, poner una gota de pegamento mezclado en cada uno de los cuatro cables auxiliares situados en el sensor (fijar entre pasos 2.1.1 y 2.1.4.). No mueva el sensor por lo menos 5 minutos hasta que el pegamento se endurece (el endurecimiento del pegamento depende de la temperatura y humedad ambiente).
Nota: Al fijar el sensor al caparazón de cangrejo, examinar minuciosamente el área cardiaco todo desde el lado del caparazón para definir el área con la mejor amplitud de la señal cardiaca (máximo). Ayudarán el software para proporcionar cálculos de frecuencia cardíaca más precisos. - Tocar el pegamento con una mano libre y si no es pegajosa, el cangrejo sin envolver con el sensor conectado (figura 2) a la caja sin agua por unos minutos más hasta que el pegamento esté completamente seco.
Nota: Una temperatura óptima para la manipulación de cangrejos de río y del pegamento varía de 18 a 22 ° C. A estas temperaturas, el pegamento se endurece dentro de 5 a 7 minutos y está completamente secado dentro de 8 a 10 minutos. A temperaturas más bajas, la tensión en el cangrejo es menos marcada; sin embargo, el pegamento necesita más tiempo para endurecerse, cerca de 15 a 20 min debajo de 15 ° C y 10 ° C, respectivamente. En temperaturas más altas, particularmente por encima de 25 ° C, el pegamento se endurece en 3 minutos, pero el cangrejo sufre más estrés; por lo tanto, tratar de minimizar la exposición de los crustáceos a condiciones extremas sin agua. - Antes de mover el cangrejo hacia atrás en el tanque, sumerja su cefalotórax en el agua varias veces con intervalos cortos de unos pocos segundos para permitir una descarga del aire que ha acumulado en las branquias, y deja el cangrejo en el agua para aproximadamente 1 h para eliminar cualquier exceso productos químicos. Una vez finalizado este proceso, liberar el cangrejo en el agua y déjelo que se aclimate durante una a dos semanas bajo condiciones experimentales, dependiendo de los índices fisiológicos observados. Intercambio de agua óptima durante los períodos de aclimatación es todos los días.
Nota: Características del cangrejo de río que se ha aclimatado y se encuentran en un estado saludable incluyen pronunciado circadiano cardíaco y actividades locomotrices, consumo regular y pasar más la luz del día en un albergue especializado (siempre).
3. cámara y configuración del Software
- Inicie el software; automáticamente se enciende la cámara de video.
- Seleccione una opción de detección de movimiento, bien detectar el área de cada tanque en la pantalla y el software comenzará a rastrear el comportamiento y la vinculación con las grabaciones de la actividad cardiaca.
Nota: Un módulo de detección de movimiento de cangrejo de río consta de una cámara que rastrea el comportamiento de cangrejo debajo del tanque y el software que combina el comportamiento con la actividad cardiaca. Los datos del módulo se utilizan para facilitar el procesamiento de datos de actividad cardiaca más precisa al eliminar los períodos en que el cangrejo muestra alta actividad locomotora. Movimientos de cigalas repentino (es decir, una reacción de escape o iniciación de la alimentación) pueden resultar en fluctuaciones o corto tiempo picos de señales cardiacas que pueden reducir la precisión de los cálculos cardiaco intervalo.
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Representative Results
Como resultado, obtuvimos una combinación de cangrejo actividades cardiacas y comportamiento, registrados y guardados en un archivo de formato txt (figura 3). Además el número de cangrejos experimentales, la fecha y la frecuencia de muestreo, el archivo consta de tres columnas: (1) el continuo tiempo en formato HH; (2) la frecuencia cardíaca se calcula automáticamente en pulsaciones por minuto; (3) la locomoción registrado como ausencia (0) o presencia (1) de cualquier movimiento. Cuando el cangrejo estaba inactivo, cero fue asignado a la célula responsable de movimiento, y cuando se movió, entonces número uno apareció en la celda respectiva. Cuando se graba continuamente, el archivo de datos se crea automáticamente cada día a las 00:00 horas (12:00 AM). Es fundamental incluir la locomoción ya que podría haber causado cambios en la frecuencia cardiaca (figura 4). Después de 10 s, un olor a comida (larvas de Chironomidae molidos, filtrados y diluidos) fue entregado en el tanque que contiene el cangrejo, utilizando una bomba peristáltica. En 14 s, el cangrejo reconoce el estímulo y su ritmo cardíaco disminuido ligeramente debido a la supuesta respuesta de orientación. Después de 20 s, la frecuencia cardíaca aumentada, lo que resulta en una disminución de los intervalos cardíacos. A los 26, el cangrejo se mueve hacia la fuente del estímulo, y tanto la excitación fisiológica provocada por el olor de la comida y el inicio de la locomoción resultó en un incremento sustancial la frecuencia cardíaca. 37 s, también había evidencia de movimiento abrupto cangrejos. Además, locomoción podría han contribuido sustancialmente al crecimiento de la frecuencia cardíaca durante las reacciones del cangrejo a determinados estímulos (figura 5). Un cangrejo de río disturbado por lo general tiene un aumento en ritmo cardíaco, como se ve durante el intervalo de 30-40 min con locomoción ocasional. Sin embargo, durante el intervalo de 45 a 50 min, la locomoción es mucho más pronunciada. Esta locomoción contribuyó a una frecuencia cardíaca que es significativamente más alta que el observado durante el período con locomoción disminuida. Si se transfieren los datos desde el archivo a otra aplicación o se utiliza el algoritmo de programación anterior, los datos que contiene sólo la actividad cardiaca del cangrejo podrían obtenidos y procesados posteriormente si es necesario (figura 6). La frecuencia cardíaca de cangrejos se caracteriza por una amplitud monotónica de la curva del latido del corazón y por aproximadamente igual cardiacas intervalos entre cada pico cardiaco.
Con el fin de analizar patrones de comportamiento de cangrejos (como pasado distancia, preferencia de una determinada zona de la velocidad del tanque o arena y locomoción), sería posible cambiar la actual cámara con una cámara de vídeo estándar con un lente gran angular plana, como la cámara utilizado actualmente no tiene una grabación pero sólo pistas de locomoción. Alternativamente, podría utilizarse una grabación con cualquiera de las aplicaciones en línea para la captura de un vídeo de la pantalla.
Figura 1 : Sensor optoelectrónico infrarroja no invasiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Señal de cigalas, Pacifastacus leniusculus, manteniendo el sensor en su caparazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Un ejemplo del archivo de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Latido de cangrejos durante el cambio de normal a perturbado condiciones cuando está expuesto a olores de alimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Frecuencia cardíaca y las actividades de locomoción de un cangrejo de río en condiciones disturbado (30-60 min) y tranquilo (0-30 min). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Cangrejo pulso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se ha sugerido extensamente que la medición de determinados parámetros fisiológicos (como el corazón o tasa de ventilación o ambos) es un método más fiable para registrar reacciones de cangrejos que la evaluación de las respuestas del comportamiento que no siempre se producen inmediatamente11. Sin embargo, es evidente que el enfoque más eficiente para evaluar las reacciones del cangrejo real a los cambios ambientales es la combinación de actividad cardiaca y grabaciones del comportamiento puesto hace posible ver los motivos de los latidos del corazón del cangrejo cambios y si no ocurren como resultado de alteraciones químicas en el ambiente o debido a la iniciación de la locomoción. Durante el monitoreo de calidad de agua, es crucial eliminar todas las influencias externas sobre los cambios en marcadores fisiológicos de cangrejos de río, incluyendo movimientos bruscos que tienen efectos de aumento en la frecuencia cardiaca pero que no presentan una alarma para el sistema de control biológico.
Otra posibilidad para facilitar una evaluación más precisa e informativa de latidos del corazón son los cronotrópico e inotrópico parámetro análisis de cigalas cardiacas actividades relacionadas principalmente con formas específicas en cangrejos señales cardiacas19. Tales análisis confirman que aun cuando el latido del corazón cambiado solamente unas pocas pulsaciones por minuto, algunos de los parámetros secundarios pueden indicar cambios significativos en cigalas actividades cardíaca19.
A pesar de la cantidad de beneficios al usar el abordaje descrito, investigación alrededor vigilancia cangrejo ha movido hacia una minimización absoluta de manipulaciones táctiles cangrejos. En el sistema recientemente desarrollado sin contacto20, la eliminación de los sensores y sus cables respectivos significa que cangrejos de cualquier tamaño se pueden utilizar para el procedimiento de control. También es posible mantener varios cangrejos de río en un área experimental ya que la ausencia de cables evita el enredo del alambre y las restricciones de movimiento de cangrejo de río. El cangrejo va a llevar dos pedazos pequeños de una cinta altamente reflexiva que indica su zona cardiaca. Estos trozos de cinta pueden conectarse el cangrejo incluso después de la muda unos días. Actividades cardiacas cangrejos comportamientos registrados por la cámara de video y analizados en tiempo real por el software de coordinación. Junto con otros avances técnicos, el acercamiento modificado causará una disminución significativa en el precio del sistema de monitoreo por hardware limitado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Ministerio de educación, juventud y deportes de la República Checa-proyectos "CENAKVA" no. CZ.1.05/2.1.00/01.0024 y no "CENAKVA II''. LO1205 bajo la sostenibilidad nacional, programa de la Agencia de Grant de la Universidad de Bohemia del sur en České Budějovice (012/2016/Z) y la Agencia de donación de la República Checa (no. 16-06498S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR LED diode | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| Phototransistor | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| Resistor | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| Capacitor | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| Cable | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| Connector | HARTING | 21348100380005 | |
| Connector | HARTING | 21348000380005 | |
| Dielectric gel | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| Analogue-to-digital convertor | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| Glue | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect video camera | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| Analysis software | University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems | Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring User name: frov Password: CF2018 |
References
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