CRISPR-Cas9-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग चयनित वायरल एकीकरण साइटों के साथ एचआईवी-1 संक्रमण के लिए Jurkat रिपोर्टर मॉडल उत्पन्न करने के लिए
Summary
हम में नई की पीढ़ी के लिए एक जीनोम इंजीनियरिंग कार्यप्रवाह वर्तमान इन विट्रो मॉडल एचआईवी के लिए-1 संक्रमण है कि दोहराऊंगा चयनित जीनोमिक साइटों पर वायरल एकीकरण. एचआईवी-व्युत्पंन पत्रकारों के लक्ष्यीकरण CRISPR-Cas9-मध्यस्थता, साइट विशेष जीनोम हेरफेर द्वारा सुविधा है । एकल-सेल क्लोन जनरेशन, स्क्रीनिंग, और सही लक्ष्यीकरण सत्यापन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं ।
Abstract
मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) समवर्ती साइटों और जीनोमिक के आकर्षण के बीच में मेजबान सेल जीनोम में अपने वायरल डीएनए गैर बेतरतीब ढंग से एकीकृत करता है । यहां हम CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग कर चुना जीनोमिक एकीकरण साइटों के साथ एचआईवी संक्रमण के लिए इन विट्रो मॉडल में उपंयास की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान । इस विधि के साथ, चुनाव के एक रिपोर्टर अनुक्रम एक लक्षित, चुना जीनोमिक लोकस में एकीकृत किया जा सकता है, नैदानिक प्रासंगिक एकीकरण साइटों को प्रतिबिंबित ।
प्रोटोकॉल में, एक एचआईवी के डिजाइन रिपोर्टर व्युत्पंन और एक लक्ष्य साइट और gRNA अनुक्रम का चयन वर्णित हैं । समरूपता हथियारों के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर का निर्माण और Jurkat टी कोशिकाओं में transfected है । रिपोर्टर अनुक्रम लक्ष्य स्थल पर एक Cas9-मध्यस्थता डबल-किनारा तोड़ने द्वारा सुविधा मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा चयनित जीनोमिक साइट के लिए लक्षित है । एकल सेल क्लोन उत्पंन और प्रवाह cytometry और पीसीआर द्वारा घटनाओं को लक्षित करने के लिए जांच की जाती है । चयनित क्लोन तो विस्तार कर रहे हैं, और सही लक्ष्यीकरण पीसीआर, अनुक्रमण, और दक्षिणी सोख्ता द्वारा सत्यापित है । CRISPR-Cas9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के संभावित बंद लक्ष्य घटनाओं का विश्लेषण कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उपंयास सेल संस्कृति प्रणालियों कि मॉडल नैदानिक प्रासंगिक एकीकरण साइटों पर एचआईवी संक्रमण उत्पंन किया जा सकता है । हालांकि एकल सेल क्लोन और सही रिपोर्टर अनुक्रम एकीकरण के सत्यापन की पीढ़ी के समय लेने वाली है, जिसके परिणामस्वरूप क्लोनिंग लाइनों शक्तिशाली उपकरण को कार्यात्मक वायरल एकीकरण साइट पसंद का विश्लेषण कर रहे हैं ।
Introduction
संक्रमण पर मेजबान जीनोम में वायरल डीएनए के एकीकरण मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के जीवन चक्र में एक महत्वपूर्ण कदम है । एकीकरण के बाद, एचआईवी लंबे समय तक रहते थे CD4 + टी सेल सबसेट जैसे स्मृति CD4 + टी कोशिकाओं में विलंबता की स्थापना के द्वारा बनी रहती है । एचआईवी एकीकरण के लिए गैर यादृच्छिक1,2प्रतीत होता है । आवर्तक रूप से एकीकृत वायरल डीएनए के साथ जीनोमिक हॉटस्पॉट की एक संख्या तीव्र और जीर्ण संक्रमित व्यक्तियों में एकीकरण साइटों के अनुक्रमण के माध्यम से कई अध्ययनों में पता लगाया गया है2,3,4 ,5,6,7,8. दिलचस्प है, इन एकीकरण साइटों में से कुछ पर, एक ही लोकस संक्रमित कोशिकाओं का एक बड़ा अंश में पाया गया था, विचार है कि समवर्ती साइटों पर एकीकरण सकारात्मक क्लोनिंग1विस्तार को प्रभावित कर सकता है अग्रणी ।
के लिए आवर्तक एकीकरण साइटों के महत्व के बारे में हमारी समझ अग्रिम, वायरल एकीकरण साइट चुनाव का पता लगाया जाना चाहिए । हालांकि, कई तकनीकी पहलुओं एचआईवी एकीकरण साइट पसंद और परिणामों का अध्ययन में बाधा । मोटे तौर पर इस्तेमाल सेल संस्कृति JLat सेल लाइनों की तरह एचआईवी विलंबता के लिए मॉडल नैदानिक प्रासंगिक आवर्तक एकीकरण साइटों9प्रतिबिंबित नहीं करते । प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं पर अध्ययन, एक तरफ, अनुक्रमण द्वारा एकीकरण साइट परिदृश्य का वर्णन सक्षम लेकिन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है. हमारे ज्ञान के लिए, कोई पर्याप्त प्रयोगात्मक मॉडल कार्यात्मक नैदानिक प्रासंगिक एकीकरण साइटों का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध है ।
यहां हम एक विस्तृत कार्यप्रवाह वर्तमान CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग एचआईवी संक्रमण के लिए उपंयास मॉडल उत्पंन करने के लिए । यहां वर्णित कार्यप्रवाह टी सेल व्युत्पंन रिपोर्टर सेल लाइनों कि मॉडल एचआईवी संक्रमण, एक चुना एकीकरण साइट पर एक genomically एकीकृत वायरल रिपोर्टर ले उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वे इस प्रकार नए उपकरणों के रूप में सेवा कर रहे है पता लगाने कैसे वायरल एकीकरण साइट एचआईवी जीव विज्ञान और कैसे वायरस अलग उपचार रणनीतियों (उदाहरण के लिए प्रतिक्रिया करता है, विलंबता reversing एजेंटों द्वारा inducibility) प्रभाव कर सकते हैं । हमारे विधि CRISPR-Cas9-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग के लाभ का उपयोग करता है, जिसमें मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा रिपोर्टर अनुक्रम के एकीकरण के लक्ष्य साइट पर एक Cas9 nuclease प्रेरित डबल-किनारा तोड़ने के द्वारा की सुविधा है । एकीकरण के लिए लक्ष्य साइटों एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों और Cas9 के लिए उपयुक्त पाम रूपांकनों की उपस्थिति-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग पर अध्ययन से वर्णित आवर्तक एकीकरण साइटों को निकटता के अनुसार चुना जाता है ।
हमारे अनुकरणीय परिणामों में, हम BACH2 जीन लोकस, जो BTB और सीएनसी समरूपता transcriptional 2 नियामक के लिए कोड पर ध्यान केंद्रित किया है । एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी पर जीर्ण एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में, BACH2 एकीकृत एचआईवी के loci दिखा संवर्धन में से एक है-1 अनुक्रम3,6,7,8,10। हम एक ंयूनतम एचआईवी-1-व्युत्पंन लंबे टर्मिनल दोहराने (बाएं), tdTomato कोडिंग अनुक्रम, और गोजातीय वृद्धि हार्मोन (BGH) polyadenylation संकेत (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) है, जो हम BACH2 intron 5 में दो विशिष्ट साइटों को लक्षित किया है शामिल रिपोर्टर व्युत्पंन चुना है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल Jurkat कोशिकाओं, एक मानव CD4 + टी सेल व्युत्पन्न निलंबन सेल लाइन के लिए अनुकूलित है, लेकिन अन्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रोटोकॉल तदनुसार अनुकूलित. हम लक्ष्य स्थल के चयन के लिए एक विस्तृत कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं, समरूपता हथियार, CRISPR-Cas9 के साथ लक्ष्य वेक्टर का निर्माण चुना जीनोमिक साइट में रिपोर्टर की मध्यस्थता लक्ष्यीकरण, पीढ़ी और क्लोनिंग लाइनों के चयन, और व्यापक सत्यापन के नव सृजित, लक्षित रिपोर्टर सेल लाइनों ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एचआईवी उत्पंन-1-चुना वायरल एकीकरण CRISPR लागू करने साइटों-Cas9 आधारित जीनोम इंजीनियरिंग के साथ Jurkat रिपोर्टर मॉडल व्युत्पंन ।
प्रोटोकॉल के कई बिंदुओं की योज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए Britta Weseloh और Bettina हाबिल धंयवाद । हम तकनीकी सहायता के लिए आऩने Düsedau और जना Hennesen (फ्लो cytometry टेक्नोलॉजी प्लेटफार्म, हेनरिक पेटते Institut) का भी धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
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