Vi presenterer en genomet engineering arbeidsflyt for generering av nye i vitro modeller for HIV-1 smitte som recapitulate proviral integrering på utvalgte genomisk områder. Målretting av HIV-avledet journalister er tilrettelagt av CRISPR-Cas9-mediert, områdespesifikke genomet manipulasjon. Detaljert protokoller for encellede klone generasjon, screening og riktig målretting verifisering tilbys.
Humant immunsviktvirus (HIV) integrerer sin proviral DNA ikke-tilfeldig i verten celle genomet tilbakevendende nettsteder og genomisk hotspots. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av romanen i vitro modeller for HIV-infeksjon med valgte genomisk integrering webområder ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering-teknologi. Med denne metoden kan en reporter rekke valg integreres i et målrettet, valgte genomisk locus, reflekterer klinisk relevante integrering nettsteder.
I protokollen, er utformingen av en HIV-avledet reporter og velge av et mål sted og gRNA beskrevet. En målretting vektor med homologi våpen er konstruert og transfekterte i Jurkat T celler. Reporter sekvensen er målrettet genomisk området av homologe rekombinasjon tilrettelagt av en Cas9-mediert dobbel-strand pause på målområdet. Encellede kloner er generert og vist for målretting hendelser av flowcytometri og PCR. Valgte kloner deretter utvides, og riktig målgruppe er bekreftet av PCR, sekvensering og Southern blotting. Potensielle off-målet hendelser av CRISPR-Cas9-mediert genomet engineering analyseres.
At modellen HIV-smitte på klinisk relevante integrering nettsteder kan genereres ved hjelp av denne protokollen, romanen celle kultur systemer. Selv om generering av encellede kloner og verifisering av riktig reporter sekvens integrering er tidkrevende, er resulterende klonal linjene kraftige verktøy for å analysere funksjonelt proviral integrasjon området valg.
Integrering av proviral DNA i vert genomet på infeksjon er en avgjørende skritt i livet syklus av humant immunsviktvirus (HIV). Etter integrasjon, HIV vedvarer ved å etablere ventetid i varige CD4 + T celle undergrupper som minne CD4 + T celler. HIV integrering synes å være ikke tilfeldig1,2. En rekke genomisk hotspots med recurrently integrerte proviral DNA påvist i flere studier gjennom sekvensering av integrering i akutt og kronisk infiserte individer2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, på noen av disse integrasjon, ble samme locus oppdaget i en stor andel av infiserte celler, fører til ideen at integrering på tilbakevendende nettsteder kan positivt påvirke klonal ekspansjon1.
For å fremme vår forståelse av betydningen av tilbakevendende integrering nettsteder, må proviral integrasjon området valg utforskes. Imidlertid flere tekniske aspekter hemme studere HIV integrering valg og konsekvensene. Bredt brukt celle kultur modeller for HIV ventetid som JLat cellelinjer ikke reflekterer klinisk relevante tilbakevendende integrering nettsteder9. Studier på primære pasient-avledede celler, på den ene siden, aktiverer beskrivelse av integrasjon området landskap av sekvensering men tillater ikke for funksjonell analyser. Til vår kunnskap er ingen tilstrekkelig eksperimentell modell tilgjengelig funksjonelt analysere valgte klinisk relevante integrering nettsteder.
Her presenterer vi en detaljert arbeidsflyt for å generere nye modeller for HIV-smitte ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering teknologi. Arbeidsflyten beskrevet her kan brukes til å generere T celle-avledet reporter linjer som modell HIV-smitte, bærer genomically integrert proviral reporter på et valgt integrering område. De er dermed fungerer som nye verktøy for å utforske hvordan webområdet proviral integrering kan påvirke HIV biologi og hvordan provirus reagerer på ulike behandling strategier (f.eks, inducibility av ventetid snu agenter). Vår metode bruker fordelene av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering, i hvilken integrering av reporteren sekvensen homologe rekombinasjon er tilrettelagt av en Cas9 nuclease-indusert dobbel-strand pause på målområdet. Målområder for integrering er valgt etter avstand til beskrevet tilbakevendende integrering nettsteder fra studier på HIV-infiserte individer og tilstedeværelsen av egnet PAM motiver Cas9-mediert genomet engineering.
I våre eksemplarisk resultater, har vi fokusert på BACH2 gene locus, hvilke koder for BTB og CNC homologi transcriptional regulator 2. Kronisk HIV-infiserte individer på antiretroviral behandling er BACH2 en av loci viser berikelse av integrert HIV-1 sekvenser3,6,7,8,10. Vi har valgt en minimal HIV-avledet reporter bestående av HIV-1-derivert lang terminal gjenta (VTH), tdTomato koding sekvens og storfe veksthormon (BGH) polyadenylation signal (PA), som vi har rettet mot to bestemte områder i BACH2 intron 5. Presentert protokollen er optimalisert for Jurkat celler, en menneskelig CD4 + T celle-avledet suspensjon cellen linje, men andre cellen linjer kan brukes og protokollen tilpasset deretter. Vi presenterer en detaljert arbeidsflyt for valg av målområdet, bygging av målet vektor med homologi armer, CRISPR-Cas9-mediert målretting av reporteren i valgt genomisk område, generasjon og valg av klonal linjer og omfattende bekreftelse nyopprettede, målrettet reporter cellen linjer.
Her beskriver vi en protokoll for å generere HIV-1-derivert Jurkat reporter modeller med valgt proviral integrasjon nettsteder bruke CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering.
Flere punkter av protokollen krever nøye på planleggingsstadiet. Først locus bli målrettet bør velges nøye, som noen loci kan være lettere å mål enn andre (f.eks, avhengig av chromatin status i regionen og målet sekvens selv). Gjentatte sekvenser er vanskelig å klone til målretting vektoren og er ofte…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Britta Weseloh og Bettina Abel for teknisk assistanse. Vi takker også Arne Düsedau og Jana Hennesen (flyt cytometri teknologiplattform, Heinrich Pette Institut) for kundestøtte.
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |