We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.
Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) integreert zijn proviraal DNA niet-willekeurig in het genoom van de cel host op terugkerende sites en genomische hotspots. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van nieuwe in vitro modellen voor HIV-infectie met gekozen genomic integratie sites met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. Met deze methode kan een verslaggever opeenvolging van keuze worden geïntegreerd in een gerichte, gekozen genomic locus, als gevolg van de integratie van klinisch relevante sites.
In het protocol, worden het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever en kiezen voor een doel-site en gRNA-sequence beschreven. Een targeting vector met homologie armen is gebouwd en in Jurkat T cellen transfected. De verslaggever-reeks is gericht op de geselecteerde genomic site door homologe recombinatie vergemakkelijkt door een Cas9-gemedieerde dubbel-strand break op de doelsite. Eencellige klonen zijn gegenereerd en gescreend voor het targeten van gebeurtenissen door stroom cytometry en PCR. Geselecteerde klonen zijn dan uitgebreid en de juiste targeting is geverifieerd door PCR, sequencing en Southern blotting. Potentiële uit doelsoort zijn gebeurtenissen van CRISPR-Cas9-gemedieerde genoom engineering worden geanalyseerd.
Met behulp van dit protocol, de nieuwe cel cultuur systemen kan dat model HIV-infectie op klinisch relevante integratie sites worden gegenereerd. Hoewel de generatie van eencellige klonen en verificatie van de juiste verslaggever reeks integratie tijdrovend is, zijn de resulterende klonale lijnen krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van functioneel proviraal integratie site keuze.
Integratie van proviraal DNA in het genoom van de host na infectie is een cruciale stap in de levenscyclus van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). Na de integratie, HIV blijft door de oprichting van latentie in langlevende CD4 + T cel subsets zoals geheugen CD4 + T cellen. HIV integratie lijkt te zijn non-random1,2. Een aantal genomic hotspots met productlevering geïntegreerde proviraal DNA is vastgesteld in verschillende studies door de sequencing van integratie sites in acuut en chronisch geïnfecteerde individuen2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, werd sommige van deze sites van de integratie, de zelfde locus gedetecteerd in een groot deel van de geïnfecteerde cellen, wat leidt tot het idee dat integratie op terugkerende sites klonale uitbreiding1positief kan beïnvloeden.
Om te gaan ons begrip van de betekenis van terugkerende integratie sites, moet proviraal integratie site keuze worden onderzocht. Echter, verschillende technische aspecten bestuderen HIV integratie belemmeren site keuze en de gevolgen. In grote lijnen gebruikt cel cultuur modellen voor HIV latentie zoals JLat cellijnen niet klinisch relevante terugkerende integratie sites9 weerspiegelen. Studies over primaire patiënt-afgeleide cellen, aan de ene kant, beschrijving van integratie site landschap inschakelen door sequentiebepaling maar laat niet voor functionele analyses. Om onze kennis is geen voldoende experimentele model beschikbaar voor de geselecteerde klinisch relevante integratie sites functioneel te analyseren.
Hier presenteren we een gedetailleerd workflow voor het genereren van nieuwe modellen voor HIV-infectie met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. De hierin beschreven werkstroom kan worden gebruikt voor het genereren van verslaggever T cel-afgeleide cellijnen die model van HIV-infectie, uitvoering van een genomically geïntegreerde proviraal verslaggever bij een gekozen integratie-site. Ze zijn dus nieuwe instrumenten te onderzoeken hoe de site proviraal integratie kan invloed hebben op HIV biologie en hoe de provirus reageert op verschillende behandelingsstrategieën (b.v., inducibility door latency achteruitrijlicht agenten) bijeenkomen. Onze methode maakt gebruik van de voordelen van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom techniek, in welke integratie van de verslaggever opeenvolging van homologe recombinatie wordt vergemakkelijkt door een Cas9 nuclease-geïnduceerde dubbele-strand break op de doelsite. Doel sites voor integratie zijn gekozen op basis van nabijheid van de sites beschreven terugkerende integratie van studies over HIV-geïnfecteerde individuen en de aanwezigheid van geschikte PAM motieven voor Cas9-gemedieerde genoom engineering.
In onze voorbeeldige resultaten, hebben we gericht op de BACH2 gen locus, welke codes voor de BTB en CNC homologie transcriptionele regulator 2. In chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie is BACH2 een van de loci verrijking van geïntegreerde HIV-1 sequenties3,6,7,8,10te tonen. Wij hebben een minimale HIV-afgeleide verslaggever bestaande van HIV-1-afgeleide lange terminal herhalen (LTR), tdTomato codering sequentie, en groeihormoon voor runderen (BGH) polyadenylatie signaal (PA), die we hebben gericht op twee specifieke sites in BACH2 intron 5 gekozen. Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor Jurkat cellen, een menselijke CD4 + T cel-afgeleide schorsing cellijn, maar andere cel lijnen kunnen worden gebruikt en het protocol aangepast. We presenteren een gedetailleerde workflow voor selectie van de doelsite, bouw van doel vector met homologie armen, CRISPR-Cas9-gemedieerde doelgerichtheid van de verslaggever in de gekozen genomic locatie, de generatie en de selectie van klonen lijnen en uitgebreide verificatie van de nieuw gegenereerde, gerichte verslaggever cellijnen.
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van HIV-1-afgeleide Jurkat verslaggever modellen met gekozen proviraal integratie sites CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering toe te passen.
Verschillende punten van het protocol vereist zorgvuldige aandacht tijdens de planningsfase. Ten eerste de locus worden gericht moet worden zorgvuldig gekozen, zoals sommige loci gemakkelijker te richten dan anderen wellicht (bijvoorbeeld, afhankelijk van de status van de chromatine van de r…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Britta Weseloh en Bettina Abel voor technische bijstand. Wij danken ook Arne Düsedau en Jana Hennesen (stroom cytometry technologieplatform, Heinrich-Pette Institut) voor technische ondersteuning.
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |