우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 재발 사이트 및 게놈 핫스팟 호스트 세포 게놈으로 비 무작위로 proviral DNA를 통합합니다. 여기 우리가 선택한 게놈 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 소설 체 외 모델의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 이 방법으로 선택의 기자 시퀀스 수 있습니다 통합할 수는 타겟, 선택한 genomic 소재 시, 임상 관련 통합 사이트를 반영.
프로토콜, HIV 파생 기자의 디자인과 대상 사이트 및 gRNA 순서의 선택 설명 합니다. 상 동 팔 대상 벡터 생성 이며 Jurkat T 세포로 페. 기자 시퀀스 선택 된 게놈 사이트에 대상 사이트에 Cas9 중재 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된 동종 재결합 대상 이다. 단일 셀 클론 생성 되며 cytometry 및 PCR에 의해 이벤트 대상에 대 한 상영. 선택 된 클론 확장 다음, 그리고 PCR, 시퀀싱, 그리고 남부 blotting에 의해 확인 된다 정확한 타겟팅. CRISPR Cas9 중재 하는 유전자 공학의 잠재적인 대상에서 이벤트는 분석 했다.
이 프로토콜, 소설 세포 배양 시스템을 사용 하 여 임상 관련 통합 사이트에서 그 모델 HIV 감염을 생성할 수 있습니다. 단일 세포 클론의 생성 및 올바른 기자 시퀀스 통합의 확인은 시간이 걸리는, 결과 클론 라인 proviral 통합 사이트 선택 기능 분석에 강력한 도구입니다.
감염 시 호스트 게놈으로 통합 proviral DNA의 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 수명 주기에서 중요 한 단계입니다. 통합에 따라 HIV 메모리 CD4 + T 세포 같은 긴 CD4 + T 세포 부분 집합에서 대기 시간을 설정 하 여 유지 합니다. 에이즈 통합 비 무작위1,2나타납니다. Recurrently 통합 proviral dna 게놈 핫스팟의 숫자 심하게만 성으로 감염 된 개인2,,34 통합 사이트의 시퀀싱을 통해 여러 연구에서 발견 되었습니다. 5,6,,78. 흥미롭게도, 이러한 통합 사이트의 일부에 같은 로커 스 재발 사이트에서 통합 클론 확장1미칠 긍정적으로 생각을 이끌어 감염 된 세포의 큰 분수에서 발견 되었다.
재발 성 통합 사이트의 중요성에 대 한 우리의 이해를 사전에 proviral 통합 사이트 선택 탐구 해야 합니다. 그러나 여러 가지 기술적인 측면 공부 에이즈 통합을 방해 하는, 선택과 결과 사이트. JLat 셀 라인 임상 관련 재발 통합 사이트9를 반영 하지 않습니다 처럼 광범위 하 게 HIV 대기 시간에 대 한 셀 문화 모델 사용. 기본 환자 파생 셀에 대 한 연구 한 한편으로, 통합 사이트 프리의 설명 연속 있지만 기능 분석에 대 한 허용 하지 않습니다. 우리의 지식을 하려면, 아무 적절 한 실험 모델은 선택 된 임상 관련 통합 사이트를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다.
여기 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 새로운 모델을 생성 하는 자세한 워크플로 선물이. 여기에 설명 된 워크플로 HIV 감염, 선택한 통합 사이트에서 genomically 통합된 proviral 기자를 들고 모델 T 세포 유래 기자 셀 라인을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그들은 따라서 proviral 통합 사이트 에이즈 생물학 영향을 미칠 수 어떻게는 provirus 다른 치료 전략 (예: 대기 시간 역전 에이전트에서, inducibility)에 응답 하는 방법을 탐구 하는 새로운 도구로 봉사는. 우리의 방법은 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링, 기자는 통합에 동종 재결합 하 여 시퀀스는 대상 사이트에서 Cas9 nuclease 유도 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된의 장점을 사용 합니다. 통합에 대 한 대상 사이트는 HIV에 감염 된 개인과 Cas9 중재 게놈 엔지니어링에 대 한 적합 한 PAM 모티프의 존재에 대 한 연구에서 설명된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선택 됩니다.
우리의 훌륭한 결과에서 우리는 BACH2 유전자 소재 시는 BTB와 CNC 상 동 transcriptional 레 귤 레이 터 2에 대 한 코드에 집중 했다. 항 레트로 바이러스 치료에만 성으로 HIV 감염 된 개인, BACH2 통합된 HIV-1 시퀀스3,6,7,,810의 농축을 보여주는 loci 중 하나입니다. 우리는 우리 BACH2 intron 5에서에서 두 개의 특정 사이트를 대상으로 HIV 1 파생 긴 단말기 반복 (LTR), tdTomato 코딩 시퀀스, 소 성장 호르몬 (BGH) polyadenylation 신호 (PA)의 구성 된 최소한의 HIV 파생 기자를 선택 했습니다. 제시 프로토콜 Jurkat 세포 인간의 CD4 + T 세포에서 파생 된 현 탁 액 셀 라인, 하지만 다른 셀 라인을 사용할 수 있습니다, 적절 하 게 적응 하는 프로토콜 최적화 되어 있습니다. 선물이 다양 한 대상 사이트, 대상 상 동 팔, CRISPR-Cas9-중재 선택한 게놈 사이트, 생성 및 클론 라인의 선택으로 취재의 대상으로 하 고 포괄적인 벡터의 건설에 대 한 자세한 워크플로 확인 새로 생성 된, 대상 기자 셀 라인의.
여기, 우리가 선택한 proviral 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 적용 HIV 1 파생 Jurkat 기자 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다.
프로토콜의 몇 가지 포인트는 계획 단계에서 주의 필요합니다. 첫째, 타겟이 될 장소 선택 해야 신중 하 게, 일부 loci 대상에 다른 사람 보다 쉽게 될 수 있습니다 (예:, 지역 및 대상의 염색 질 상태에 따라 자체 순서). 반복 시퀀?…
The authors have nothing to disclose.
우리 기술 지원 Britta Weseloh와 베티 아벨 감사합니다. 우리 또한 감사 아르네 두 제 다우와 Jana Hennesen (교류 cytometry 기술 플랫폼, 하인리히 Pette Institut) 기술 지원.
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |