Summary

Basati su CRISPR-Cas9 genoma ingegneria per generare modelli di Jurkat Reporter per infezione da HIV-1 con integrazione Proviral selezionati siti

Published: November 14, 2018
doi:

Summary

Vi presentiamo un flusso di lavoro ingegneria di genoma per la generazione di nuovi modelli in vitro per infezione da HIV-1 che ricapitolano integrazione proviral a selezionati siti genomici. Targeting dei reporter HIV-derivato è facilitato dalla manipolazione del genoma CRISPR-Cas9-mediata, site-specific. Sono disponibili protocolli dettagliati per cella singola clone generazione, lo screening e la corretta verifica targeting.

Abstract

Virus di immunodeficenza umana (HIV) integra il DNA provirale non casualmente nel genoma della cellula ospite alle ricorrenti siti e genomico hotspot. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di nuovi modelli in vitro per l’infezione da HIV con siti di integrazione genomica selezionate utilizzando la tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Con questo metodo, una sequenza di reporter di scelta può essere integrata in un locus genomico mirato, selezionato, riflettendo siti di integrazione clinicamente rilevanti.

Nel protocollo, la progettazione di un reporter di HIV-derivato e scegliendo di una sequenza di destinazione sito e gRNA sono descritti. Un vettore targeting con braccia di omologia è costruito e transfected nelle cellule di T di Jurkat. La sequenza di reporter si rivolge al sito genomico selezionato tramite la ricombinazione omologa, facilitata da una pausa di doppio filo Cas9-mediata al sito di destinazione. Cloni unicellulari sono generati e proiettati per ottimizzazione degli eventi mediante citometria a flusso e PCR. Cloni selezionati vengono quindi espansi e targeting corretta viene verificato mediante PCR, sequenziamento e macchiare del sud. Vengono analizzati potenziali eventi fuori bersaglio di ingegneria CRISPR-Cas9-mediata del genoma.

Utilizzando questo protocollo, sistemi di coltura cellulare romanzo può essere generato l’infezione da HIV tale modello presso siti di integrazione clinicamente rilevanti. Anche se la generazione di cloni unicellulari e verifica dell’integrazione sequenza corretta reporter è lunghe, le linee clonali risultante sono potenti strumenti per analizzare in modo funzionale scelta del sito di integrazione proviral.

Introduction

Integrazione del DNA provirale nel genoma ospite al momento dell’infezione è un passo fondamentale nel ciclo di vita del virus di immunodeficenza umana (HIV). A seguito di integrazione, l’HIV persiste attraverso la definizione di latenza in sottoinsiemi di cellule T CD4 + longevi come cellule T CD4 + di memoria. Integrazione di HIV sembra essere non casuale1,2. Un numero di hotspot genomico con DNA provirale ricorrentemente integrato è stato rilevato in parecchi studi attraverso il sequenziamento dei siti di integrazione in individui acutamente e cronicamente infettati2,3,4 ,5,6,7,8. È interessante notare che, in alcuni di questi siti di integrazione, stesso locus è stato rilevato in una grande frazione delle cellule infettate, che conduce all’idea che integrazione alle ricorrenti siti potrebbe influenzare positivamente l’espansione clonale1.

Per avanzare la nostra comprensione del significato dei siti di integrazione ricorrenti, scelta del sito di integrazione proviral deve essere esplorata. Tuttavia, diversi aspetti tecnici ostacolano lo studio integrazione HIV sito scelta e le conseguenze. Ampiamente utilizzati modelli di coltura cellulare per latenza di HIV come linee cellulari JLat non riflettono clinicamente rilevante integrazione ricorrenti siti9. Studi su cellule primarie derivate dal paziente, da un lato, attivare la descrizione di integrazione sito paesaggio dall’ordinamento ma non consentono analisi funzionali. A nostra conoscenza, nessun modello sperimentale adeguato è disponibile per analizzare i siti selezionati clinicamente rilevante integrazione funzionalmente.

Qui presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per generare nuovi modelli per l’infezione da HIV usando tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Il flusso di lavoro descritto nel presente documento può essere utilizzato per generare linee cellulari derivati da cellule T reporter che modellano l’infezione da HIV, che trasportano un reporter proviral genomicamente integrato in un sito di integrazione selezionate. Servono così come nuovi strumenti per esplorare come il sito di integrazione proviral può influenzare la biologia di HIV e come provirus risponde a diverse strategie terapeutiche (ad esempio, 270ms dagli agenti inversione di latenza). Il nostro metodo utilizza i vantaggi dell’ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma, in quale integrazione del reporter sequenza di ricombinazione omologa è facilitato da una pausa di doppio filo indotta da nucleasi Cas9 al sito di destinazione. Siti di destinazione per l’integrazione sono scelti secondo la vicinanza ai siti integrazione ricorrente descritto da studi su individui affetti da HIV e la presenza di motivi di PAM adatti per ingegneria Cas9-mediata del genoma.

Nei nostri risultati di esemplare, ci siamo concentrati sul luogo del gene BACH2, che codifica per il regolatore trascrizionale di BTB e CNC omologia 2. In individui HIV-infettati cronicamente sulla terapia antiretrovirale, BACH2 è uno dei loci risultati arricchimento di HIV-1 integrato sequenze3,6,7,8,10. Abbiamo scelto un reporter HIV-derivato minimo costituito da HIV-1-derivati lungo terminale di ripetizione (LTR), sequenza di codificazione di tdTomato e ormone della crescita bovina (BGH) segnale di poliadenilazione (PA), che siamo presi di mira a due siti specifici in BACH2 introne 5. Il protocollo presentato è ottimizzato per Jurkat cellule, un’umano CD4 + linea cellulare T cellula-derivati sospensione, ma altri cell le linee possono essere utilizzate e il protocollo adattato di conseguenza. Vi presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per la selezione del sito di destinazione, costruzione del vettore di destinazione con le braccia di omologia, CRISPR-Cas9-mediata di targeting del reporter nel sito genomico scelto, la generazione e la selezione di linee clonali e complete verifica delle varietà di cellula di reporter appena generato, mirati.

Protocol

1. strategia di targeting per genoma ingegneria e Targeting disegno vettoriale (tv) Nota: Il primo passo di ingegneria genoma prevede selezione e generazione degli strumenti necessari per il CRISPR-Cas9-mediated targeting. Selezione di un locus di sito di integrazione genomica, scelta del tipo di cella per il targeting e progettazione di un reporter di HIV-derivati per l’integrazione deve precedere questo passaggio. Questo protocollo descrive il targeting di un reporter di minim…

Representative Results

In questo esperimento rappresentanza abbiamo scelto di indirizzare un reporter di HIV-1-derivati minimo composta un LTR, la sequenza tdTomato-codificazione e la sequenza di polyA-segnale a due loci in introne 5 del gene BACH217. I loci per il targeting sono stati scelti secondo la vicinanza ai siti pubblicati integrazione ricorrenti trovato in diversi studi su cellule T primarie da pazienti HIV-infettati2,4…

Discussion

Qui, descriviamo un protocollo per generare modelli di HIV-1-derivati Jurkat reporter con siti di integrazione proviral selezionate l’applicazione di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma.

Alcuni punti del protocollo richiedono attenzione durante la fase di pianificazione. In primo luogo, il luogo di destinazione dovrebbe essere scelto con attenzione, come alcuni loci potrebbero essere più facile bersaglio di altri (ad es., a seconda dello stato della cromatina della regione e la d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Britta Weseloh e Bettina Abel per assistenza tecnica. Ringraziamo anche Arne Düsedau e Jana Hennesen (piattaforma tecnologica flusso cytometry, Heinrich Pette Institut) per il supporto tecnico.

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 Addgene 42230 vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK GeneArt mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1 Invitrogen V79020 mammalian expression vector for cloning
BbsI New England Biolabs R0539S restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5520S Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System Agilent Technologies 600210 DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom) TPP 92097 tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 L DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D9170 dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution New England Biolabs B9021S MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix 5PRIME 2200400 ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit Qiagen 51106 DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine Lonza BE12-167F cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge PAN Biotech P123002 cell culture medium supplement
L-glutamine Biochrom K 0282 cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml Biochrom A 2212 cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media Thermo Fisher Scientific 31985062 cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat Mirus Bio MIR2125 transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139-1MG cell culture reagent
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634-1MG cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm Millex SLGP033RB filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator Thermo Fisher Scientific 51026280 tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+ GE Healthcare RPN1520B positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800 Stratagene 400072 UV crosslinker
High Prime Roche 11585592001 kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08 chromatography spin-columns for purification of labeled DNA

References

  1. Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
  2. Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
  4. Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
  5. Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  6. Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
  7. Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
  8. Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  9. Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
  10. Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
  11. Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
  12. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
  13. Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
  14. Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
  15. Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
  16. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
  17. Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
  18. Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
  19. Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
  20. Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
  21. Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
  22. Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J., Lange, U. C. CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (141), e58572, doi:10.3791/58572 (2018).

View Video