CRISPR-Cas9-baserte genomet Engineering generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 smitte med valgte Proviral integrasjon nettsteder

Summary

Vi presenterer en genomet engineering arbeidsflyt for generering av nye i vitro modeller for HIV-1 smitte som recapitulate proviral integrering på utvalgte genomisk områder. Målretting av HIV-avledet journalister er tilrettelagt av CRISPR-Cas9-mediert, områdespesifikke genomet manipulasjon. Detaljert protokoller for encellede klone generasjon, screening og riktig målretting verifisering tilbys.

Abstract

Humant immunsviktvirus (HIV) integrerer sin proviral DNA ikke-tilfeldig i verten celle genomet tilbakevendende nettsteder og genomisk hotspots. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av romanen i vitro modeller for HIV-infeksjon med valgte genomisk integrering webområder ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering-teknologi. Med denne metoden kan en reporter rekke valg integreres i et målrettet, valgte genomisk locus, reflekterer klinisk relevante integrering nettsteder.

I protokollen, er utformingen av en HIV-avledet reporter og velge av et mål sted og gRNA beskrevet. En målretting vektor med homologi våpen er konstruert og transfekterte i Jurkat T celler. Reporter sekvensen er målrettet genomisk området av homologe rekombinasjon tilrettelagt av en Cas9-mediert dobbel-strand pause på målområdet. Encellede kloner er generert og vist for målretting hendelser av flowcytometri og PCR. Valgte kloner deretter utvides, og riktig målgruppe er bekreftet av PCR, sekvensering og Southern blotting. Potensielle off-målet hendelser av CRISPR-Cas9-mediert genomet engineering analyseres.

At modellen HIV-smitte på klinisk relevante integrering nettsteder kan genereres ved hjelp av denne protokollen, romanen celle kultur systemer. Selv om generering av encellede kloner og verifisering av riktig reporter sekvens integrering er tidkrevende, er resulterende klonal linjene kraftige verktøy for å analysere funksjonelt proviral integrasjon området valg.

Introduction

Integrering av proviral DNA i vert genomet på infeksjon er en avgjørende skritt i livet syklus av humant immunsviktvirus (HIV). Etter integrasjon, HIV vedvarer ved å etablere ventetid i varige CD4 + T celle undergrupper som minne CD4 + T celler. HIV integrering synes å være ikke tilfeldig^1,2. En rekke genomisk hotspots med recurrently integrerte proviral DNA påvist i flere studier gjennom sekvensering av integrering i akutt og kronisk infiserte individer^{2,3,4 ,5,6,7,8}. Interessant, på noen av disse integrasjon, ble samme locus oppdaget i en stor andel av infiserte celler, fører til ideen at integrering på tilbakevendende nettsteder kan positivt påvirke klonal ekspansjon¹.

For å fremme vår forståelse av betydningen av tilbakevendende integrering nettsteder, må proviral integrasjon området valg utforskes. Imidlertid flere tekniske aspekter hemme studere HIV integrering valg og konsekvensene. Bredt brukt celle kultur modeller for HIV ventetid som JLat cellelinjer ikke reflekterer klinisk relevante tilbakevendende integrering nettsteder⁹. Studier på primære pasient-avledede celler, på den ene siden, aktiverer beskrivelse av integrasjon området landskap av sekvensering men tillater ikke for funksjonell analyser. Til vår kunnskap er ingen tilstrekkelig eksperimentell modell tilgjengelig funksjonelt analysere valgte klinisk relevante integrering nettsteder.

Her presenterer vi en detaljert arbeidsflyt for å generere nye modeller for HIV-smitte ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering teknologi. Arbeidsflyten beskrevet her kan brukes til å generere T celle-avledet reporter linjer som modell HIV-smitte, bærer genomically integrert proviral reporter på et valgt integrering område. De er dermed fungerer som nye verktøy for å utforske hvordan webområdet proviral integrering kan påvirke HIV biologi og hvordan provirus reagerer på ulike behandling strategier (f.eks, inducibility av ventetid snu agenter). Vår metode bruker fordelene av CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering, i hvilken integrering av reporteren sekvensen homologe rekombinasjon er tilrettelagt av en Cas9 nuclease-indusert dobbel-strand pause på målområdet. Målområder for integrering er valgt etter avstand til beskrevet tilbakevendende integrering nettsteder fra studier på HIV-infiserte individer og tilstedeværelsen av egnet PAM motiver Cas9-mediert genomet engineering.

I våre eksemplarisk resultater, har vi fokusert på BACH2 gene locus, hvilke koder for BTB og CNC homologi transcriptional regulator 2. Kronisk HIV-infiserte individer på antiretroviral behandling er BACH2 en av loci viser berikelse av integrert HIV-1 sekvenser^3,6,7,8,10. Vi har valgt en minimal HIV-avledet reporter bestående av HIV-1-derivert lang terminal gjenta (VTH), tdTomato koding sekvens og storfe veksthormon (BGH) polyadenylation signal (PA), som vi har rettet mot to bestemte områder i BACH2 intron 5. Presentert protokollen er optimalisert for Jurkat celler, en menneskelig CD4 + T celle-avledet suspensjon cellen linje, men andre cellen linjer kan brukes og protokollen tilpasset deretter. Vi presenterer en detaljert arbeidsflyt for valg av målområdet, bygging av målet vektor med homologi armer, CRISPR-Cas9-mediert målretting av reporteren i valgt genomisk område, generasjon og valg av klonal linjer og omfattende bekreftelse nyopprettede, målrettet reporter cellen linjer.

Protocol

1. målretting strategi for genomet Engineering og målretting vektor (tv) Design Merk: Det første trinnet i genomet engineering innebærer utvalg og generering av de nødvendige verktøyene for CRISPR-Cas9-mediert målretting. Utvalg av et genomisk integrering området locus, valg av celle type for målretting og design av en HIV-avledet reporter for integrasjon bør foran dette trinnet. Denne protokollen beskriver målretting av en HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA minimal reporter i J…

Representative Results

I dette representant eksperimentet har vi valgt å målrette en minimal HIV-1-derivert reporter bestående av en polyA-signalet rekkefølge til to loci i intron 5 BACH2 gen17med LTR og tdTomato-coding sekvens. Loci for målretting ble valgt etter avstand til publiserte tilbakevendende integrering nettsteder funnet i forskjellige studier på primær T-celler fra HIV-infiserte pasienter2,4,<sup cla…

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for å generere HIV-1-derivert Jurkat reporter modeller med valgt proviral integrasjon nettsteder bruke CRISPR-Cas9-baserte genomet engineering.

Flere punkter av protokollen krever nøye på planleggingsstadiet. Først locus bli målrettet bør velges nøye, som noen loci kan være lettere å mål enn andre (f.eks, avhengig av chromatin status i regionen og målet sekvens selv). Gjentatte sekvenser er vanskelig å klone til målretting vektoren og er ofte…

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK	GeneArt		mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	mammalian expression vector for cloning
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	cell culture medium supplement
L-glutamine	Biochrom	K 0282	cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml	Biochrom	A 2212	cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cell culture reagent
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatography spin-columns for purification of labeled DNA