HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik
Summary
Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.
Abstract
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) proviral DNA’sının ana hücre genomu tekrarlayan siteleri ve genomik etkin noktaları olmayan rasgele tümleştirir. Burada ayrıntılı bir protokol roman tüp bebek modelleri üretimi için HIV enfeksiyonu için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak seçilen genomik tümleştirme siteleri ile mevcut. Bu yöntemle, seçim bir muhabir dizi bir hedefli, seçilen genomik locus klinik entegrasyon siteleri yansıtan entegre edilebilir.
İletişim kuralında, HIV kaynaklı bir muhabir tasarımı ve bir hedef site ve gRNA dizi seçme açıklanmıştır. Hedefleme vektör Homoloji silah ile inşa edilmiştir ve Jurkat T hücre içine transfected. Muhabir sıra Homolog rekombinasyon bir Cas9-aracılı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırılmış tarafından seçilen genomik siteye hedeflenmektedir. Tek hücre klonlar oluşturulan ve olaylar hedefleme için ekranlı akış sitometresi ve PCR tarafından. Seçili klonlar sonra genişletilir ve doğru hedefleyen PCR, sıralama ve Southern Blot tarafından doğrulanır. CRISPR-Cas9-aracılı genom mühendislik potansiyel hedef kapalı olayları analiz edilir.
Bu iletişim kuralı, roman hücre kültür sistemleri kullanarak bu modeli HIV enfeksiyonu klinik entegrasyon sitelerde oluşturulabilir. Tek hücre klonlar oluşturma ve doğrulama doğru muhabir sıra entegrasyon zaman alıcı olsa da, elde edilen klonal satırları işlevsel olarak proviral tümleştirme site seçim analiz etmek için güçlü araçlardır.
Introduction
Ana bilgisayar genom enfeksiyon üzerine proviral DNA entegrasyonu insan immün yetmezlik virüsü (HIV) yaşam döngüsünün kritik bir adımdır. Tümleştirme, HIV uzun ömürlü CD4 + T hücre alt kümeleri bellek CD4 + T hücreleri gibi gecikme süresi kurarak devam ederse. HIV tümleştirme rasgele1,2gibi görünüyor. Akut ve kronik olarak enfekte bireylerin2,3,4 entegrasyon sitelerin nasıl yapılacağını aracılığıyla çeşitli çalışmalarda yerleştirilmiştir entegre proviral DNA ile genomik etkin noktaları bir dizi algılandı ,5,6,7,8. İlginçtir, entegrasyon sitelerin bazıları enfekte hücreleri, tekrarlayan sitelerin entegrasyon klonal genişleme1olumlu etkileyebilir fikir önde gelen büyük bir kısmını aynı locus algılandı.
Tekrarlayan tümleştirme siteleri önemi bizim anlayışı ilerletmek için proviral tümleştirme site seçim keşfedilmeyi gerekir. Ancak, birkaç teknik yönleri eğitim HIV tümleştirme engel site seçimi ve sonuçları. Geniş JLat hücre hatları klinik tekrarlayan tümleştirme siteleri9yansıtmıyor gibi hücre kültür modelleri HIV gecikme süresi için kullanılır. Çalışmalar birincil hasta elde edilen hücrelerde, bir yandan, entegrasyon sitesi peyzaj açıklaması sıralama tarafından etkinleştirir, ancak fonksiyonel analiz için izin vermez. Bilgimizi, yeterli bir deneysel model işlevsel olarak seçilen klinik entegrasyon siteleri analiz etmek kullanılabilir.
Burada CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak HIV enfeksiyonu için roman modelleri oluşturmak için ayrıntılı bir iş akışı mevcut. Burada açıklanan iş akışı HIV enfeksiyonu, genomically entegre proviral muhabir seçilen tümleştirme sitesinde taşıyan model T hücre kaynaklı muhabiri hücre satırlarını oluşturmak için kullanılabilir. Böylece proviral tümleştirme sitesi HIV biyoloji nasıl etkileyebilir ve provirus farklı tedavi stratejileri (örneğin, inducibility gecikme süresi ters kayıt ajanları tarafından) nasıl yanıt vereceğini keşfetmek için yeni araçları olarak hizmet vermekteyiz. Bizim Yöntem CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik, muhabir hangi Wuppertal’de sırası Homolog rekombinasyon tarafından bir Cas9 nükleaz kaynaklı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırdı avantajları kullanır. Hedef siteleri tümleştirme için HIV enfekte bireylerin ve Cas9-aracılı genom Mühendisliği için uygun PAM motifleri varlığı üzerine çalışmalar açıklanan tekrarlayan tümleştirme sitelere yakınlık göre seçilir.
Örnek sonuçlarımızda BACH2 gen odağı, BTB ve CNC Homoloji transkripsiyon regülatör 2 için hangi kodları üzerinde odaklanmıştır. Kronik olarak HIV enfekte bireylerin antiretroviral tedavi, BACH2 zenginleştirme entegre HIV-1 dizileri3,6,7,8,10gösterilen loci biridir. Uzun terminal tekrar (LTR) HIV-1-türetilmiş, tdTomato kodlama dizisi ve sığır büyüme hormonu (BGH) Poliadenilasyon sinyal (PA), biz BACH2 intron 5 iki belirli sitelere hedef içeren en az bir HIV kaynaklı muhabir seçtik. Sunulan Protokolü Jurkat hücreleri, bir insan CD4 + T hücre kaynaklı süspansiyon hücre kültürünü, ama diğer hücre hatları kullanılabilir ve buna göre uyarlanmış protokolü için optimize edilmiştir. Biz hedef site, inşaat hedef vektörünün Homoloji silah, CRISPR-Cas9-aracılı seçilen genomik, üretimi ve site seçimi klonal satırlarının muhabir hedefleme ve kapsamlı ile seçim için ayrıntılı bir iş akışı mevcut doğrulama Yeni oluşturulan, hedeflenen muhabiri hücre satırı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik uygulama seçilen proviral tümleştirme sitelerle HIV-1-türetilmiş Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için bir protokol açıklayın.
İletişim kuralı birkaç puan planlama aşamasında dikkat gerektirir. Gibi bazı loci diğerlerinden daha hedef için daha kolay olabilir ilk olarak, var olmak hedef için odağı dikkatli seçilmelidir (örneğin, bölge ve hedef kromatin durumuna bağlı olarak kendisi sıra). Tekrarlayan diziler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Britta Weseloh ve Bettina Abel teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz de Arne Düsedau ve Jana Hennesen (akış sitometresi teknoloji platformu, Heinrich Pette Institut) Teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
References
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
- Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
- Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
- Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
- Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
- Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
- Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
- CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
- Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
- Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
- Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
- Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
- Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
- Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
- Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
- Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
- Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
- Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).
