Summary
Detta protokoll innehåller nödvändiga steg för att upprätta och utvärdera neonatal sepsis i 7 dagar gamla möss.
Abstract
Neonatal sepsis är fortfarande en global börda. En preklinisk modell till skärmen effektiva förebyggande eller terapeutiska insatser behövs. Neonatal mus polymikrobiella sepsis kan induceras av injicera cecal flytgödsel intraperitonealt i dag av livet 7 möss och övervaka dem för följande vecka. Här presenteras de detaljerade steg som är nödvändiga för genomförandet av denna neonatal sepsis modell. Detta inkluderar att göra en homogen cecal flytgödsel lager, späda ut den till en vikt - och skräp-justerade dos, en disposition av övervakningsschema, och en definition av observerade hälsa kategorier används för att definiera humana slutpunkter. Generering av en homogen cecal flytgödsel lager från poolade givare tillåter förvaltning till många kullar över tid, att minska variationen mellan givare och förhindrar användning av potentiellt toxiska glycerol. Övervakningsstrategin används möjliggör föregripande av överlevnad utfall och identifiering av möss som senare skulle utvecklas till döds, vilket möjliggör en tidigare identifiering av humana slutpunkten. Två huvudsakliga beteendemässiga egenskaper används för att definiera hälsa poängen, nämligen de neonatala möss förmåga att just själva när den placeras på ryggen och deras nivå av rörlighet. Dessa kriterier skulle potentiellt kunna tillämpas på adress humana slutpunkter i andra studier av neonatal sjukdom hos möss, så länge som en pilot studie utförs för att bekräfta riktigheten. Sammanfattningsvis ger denna metod en standardiserad metod modell nyfödda sepsis hos möss, samtidigt som resurser för att bedöma djurens välbefinnande används för att definiera tidig humana slutpunkter för utmanade djur.
Introduction
Sepsis är en ledande orsak till nyfödda smittsamma dödsfall1. Eftersom nyfödda sepsis är dåligt känd, har få framsteg gjorts i båda identifiering av at-risk nyfödda tidigt under sjukdomen och utveckling av effektiva behandlingar eller profylax. Detta kräver användning av djurmodeller av sepsis att bättre förstå de process och testa eventuella interventionerna. Dessutom reagerar vuxna gnagare olika på sepsis, med statistiskt signifikanta skillnader i antalet bakterier att administrera för att erhålla samma dödlig dos (LD) och skillnader i den resulterande värd Svaren jämfört med nyfödda2. Neonatal sepsis har således, att studeras hos nyfödda. Flera vuxna sepsis modeller har använts i sepsis forskning. Dessa inkluderar en intravenös utmaning med specifika organismer inblandad i vuxen människa sepsis eller cecal ligering och punktering (CLP). CLP är en endogen utmaning modell där blindtarmen är kirurgiskt isolerade, sammanskrivna och punkteras så att läckage av tarminnehållet i bukhinnan, så småningom leder till systemisk spridning av mikroorganismer och deras produkter3. Men är det kirurgiska ingreppet som krävs för att fastställa CLP dödliga för nyfödda djur; Därför behövs en alternativ metod att efterlikna polymikrobiella utmaningen att CLP att inducera neonatal sepsis. Cecal flytgödsel modellen för neonatal polymikrobiella sepsis utvecklades för att tillgodose det behovet, whereby cecal innehållet i djur skördas, upphängd i sterila glukos 5% i vatten (D5W) och injiceras intraperitonealt i nyfödda möss2. Detta har sedan, blivit en alltmer populär modell att studera sepsis i både nyfödda och vuxna djur och har väsentligen avancerade mekanistiska insikter i sjukdomens process4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Med tanke på den ökande användningen av denna modell och önskan av forskare att direkt jämföra resultaten över publikationer, finns det ett behov för de tekniska aspekterna vara väl beskrivna och standardiserat i studier. Standardisering gäller tre aspekter av modellen, nämligen i) utarbetandet av cecal flytgödsel beståndet, ii) utarbetandet av de utmaning alikvoter för injektion i försöksdjuren, och iii) definitionen av humana slutpunkten whereby djur anses nonsurvivors i utmaning experiment. Specifikt, refereras metoder för att förbereda cecal flytgödsel beståndet ofta till den ursprungliga artikeln att införa den modell2. En kort sammanfattning av denna modell är att cecal innehållet från vuxna möss var skördas, upphängd i sterila D5W till en koncentration på 80 mg/mL, och används inom 2 h för att injicera försöksdjuren. Denna ursprungliga modell används möss i samma ålder, från samma leverantör plats, som var inrymt i deras respektive forskningsanläggningar för mindre än 2 veckor före skörd cecal innehållet. Användningen av interna Förädlat möss, ökat trots att minska kostnaden från vanliga leverantör leverans och möjliggör användning av överskott möss av ett bredare spektrum av kön och ålder, också väsentligt givare-till-givare variabilitet. Detta motiverade utvecklingen av en alternativ teknik, whereby cecal innehållet från flera möss var poolade tillsammans för att förbereda ett stort lager, som då var aliquoted och lagras vid-80 ° C13. Denna alternativa metod har anpassats av flera grupper14,15. Att anpassningen resulterade dock i vissa tekniska variationer, både i de lagringsmedia som används (10% eller 15% glycerol eller D5W ensam) och i strategin för filtrering ta bort partiklar (flerstegs filtrering genom en 860 µm och, sedan, en 190 µm filter eller individ filtreringar genom 100 µm eller 70 µm filter)13,14,15. Injektion av glycerol ensam kan potentiellt skada, med tanke på att 25-50% glycerol injektioner har använts som en gnagare modell av njurskada16,17,18,19, 20. För att undvika oavsiktliga biverkningar av glycerol, cecal flytgödsel lager förberedelserna för möss i denna studie är frysta i D5W utan glycerol, och tester av bakteriell livskraft från lagring vid-80 ° C utförs. Den filtrering strategi som används i denna studie är en passera genom en 70 µm filter, som inte direkt har jämförts med de andra strategier för filtrering som anges.
Dödliga vikt justerade doser injiceras cecal slurry kan variera från anläggning till anläggning och bör titrerade ut till önskad dödlighet för enskilda grupper. Med olika utmaning doser ändra de medföljande utmaning volymerna av nödvändighet. Detta metodologiska uppgifter har dock inte rapporterats före. Dessutom strategier för standardiserade förfaranden, såsom intraperitoneal injektion, är sällan utarbetas på inom litteraturen, men enskilda tekniker kan påverka huruvida nyfödda möss läcka när injiceras och påverka deras slutliga resultat.
Djurskydd, inklusive en definition av Human slutpunkt, är en central aspekt av denna modell och i någon modell av infektion och inflammation i gnagare21. 1998 offentliggjort kanadensiska rådet på Animal Care (CCAC) omfattande riktlinjer för Human slutpunkt urval, definiera humana slutpunkten som ”alla faktiska eller potentiella smärta, ångest eller obehag ska minimeras eller lindras genom att välja de tidigaste slutpunkten som är kompatibel med vetenskapliga målen för forskningen ”22. Andra också försiktighet att humana slutpunkter måste fastställas baserat på vetenskaplig motivering snarare än på en subjektiv tolkning av djurets tillstånd enbart21. Medan det finns en mängd resurser för klinisk, beteendemässiga, och kroppskondition tecken-baserade kriterier för humana slutpunkten, även i samband med infektion och inflammation specifikt21,23,24, ingen av dessa , inklusive CCAC riktlinjerna för humana slutpunkten22, nämna nyfödda möss. Således, objektivt och vetenskapligt motiverade humana slutpunkter är mycket svårare att fastställa för nyfödda djur, både möjligheterna begränsade beteende och bristen på bevis från kriterier som viktminskning, som vanligtvis används för vuxen möss. För närvarande kriterierna för humana slutpunkten används för 5-12 dag-gamla neonatala möss i cecal flytgödsel litteraturen allt referera tillbaka till den original-manuskript som introducerade den modell2. I detta ursprungliga papper baserades definitionen av Human slutpunkt för nyfödda djur på två kriterier. nämligen, platsen för en mus utanför boet (spridning) och bristen på mjölk ställen hade setts att leda till döden inom timmar. En komplicerande fråga i tilldela en human slutpunkt är att mjölk fläckar blir svåra att se i mus stammar med mörk päls, såsom vanligen anställd C57BL/6J stam, efter den första veckan i livet, medan sjuka djur övervakas tills den 14: e dagen i livet (DOL). Ytterligare, döda djur kan hittas postchallenge vid tillämpningen av dessa kriterier (egen observation, opublicerade); Således krävs en strängare definition av humana slutpunkten att lindra lidande försöksdjur och undvika dödlighet i situationer där resultatet kunde noggrant urskiljas tidigare.
Alla tre metodologiska aspekter av cecal flytgödsel modellen presenteras i ett normalförfarande detailing utarbetandet av cecal flytgödsel lager, en metod för att injicera försöksdjur som håller den injektion volym konstanten mellan doserna och minskar risken för läckor, och en definition av humana slutpunkten för 7 - 12 dag-gamla möss baserat på ett system av beteendemässiga modellering. Beteendemässiga information av mus hälsa noter från över 240 experimentella djur samlades in och grupperade efter sista överlevnad utfall, visar en bevis-driven definition av humana slutpunkten. Lidande av försöksdjur minskas genom att identifiera döende neonatala möss den tidigaste möjliga tidpunkt, medan biologiskt signifikanta överlevnad utfall kan härledas genom att observera nyckelvariabler. En visuell representation av både cecal flytgödsel förberedelse och neonatal mus beteenden kommer att fungera som en utmärkt resurs till någon grupp studera sepsis eller nyfödda utmaning modell djur.
Protocol
Alla experiment i detta protokoll har godkänts av University of British Columbia djur vård utskottet under protokollnummer A17-0110.
1. verktyget sterilisering
- I biologiska säkerhetsdragskåp (BSC), slå på och värm heta pärla autoklaven till 250 ° C, minst 30 min innan användning.
- Doppa verktyg i 70% etanol.
- Dränka verktygen i förvärmd het pärla autoklaven för minst 1 min.
Obs: Handtagen på verktygen blir varm och kan brinna om kvar i varma pärla autoklaven för över 1,5 min. - Spraya en matta av pappershanddukar med 70% etanol att sterilisera den.
- Ta bort verktyg från heta pärla autoklaven utan att röra den steriliserade delen av verktyget till nonsterile handtagen av andra nedsänkt verktyg och placera dem på etanol-besprutas pappershanddukar.
- Vänta 30 s till 2 min för verktygen svalna innan du använder dem för dissektion.
2. cecal flytgödsel förberedelse
- Preweigh 15 mL centrifugrör (en tub för varje fem möss varelse euthanized).
- Euthanize cecal flytgödsel givare enligt lokala djurvård riktlinjer eller använda protokollet nedan.
Obs: Upp till 40 C57BL/6J möss mellan 6 och 12 veckor gammal användes för cecal flytgödsel förberedelse, med upp till fem möss varelse euthanized i taget.- Överföra möss till dödshjälp kammaren och isofluran anestesi maskinen till 5% med syre perfusion.
- Övervaka mössen att observera förlusten av förmågan att flytta och att se dem in kirurgiska planet av anestesi och slutligen slutar andas.
- Ta bort musen från dödshjälp kammaren, nypa dess tass och observera eventuella ben indragning eller inandning. Om antingen är närvarande, återgå musen till dödshjälp kammaren. annars Fortsätt.
- Obotligt euthanize möss av skarpa cervikal dislokation.
- Utföra blindtarmen dissektion, använder presterilized och kyls verktyg (se avsnitt 1) i en BSC.
- Fästa benen på musen för att en extruderad styrencellplast ombord med 23 G nålar så att musen har dess buken upp. Säkra och spraya sedan buken med 70% etanol.
- Med hjälp av steril pincett och sax, skär genom huden, lossa huden från peritoneal foder med sax och klippa öppna ett rektangulärt område från ljumsken till bröstbenet och vänster till höger. Ta bort all päls från bukhinnan.
- Växla till ett nytt par sterila verktyg att skära igenom bukhinnan, att göra en rektangulär öppning som gjordes för huden, byta verktyg om de används kontakt huden.
- Identifiera blindtarmen, som bör vara igång vänster till höger över kroppen. Störa bindväv för att identifiera den blindtarm grenar från tarmarna och skär blindtarmen bort från tarmarna. Placera blindtarmen på steriliserade pappersark väger papper.
Obs: Vägning papper kan steriliseras antingen genom besprutning med 70% etanol på båda sidor och lämnar den att torka eller genom UV-bestrålning. Blindtarmen kan alternativt vara dissekerade på en steril Petri tallrik.
- Cecal innehåll extrudering
- I en BSC, använda sterila verktyg för att skära igenom båda ändarna av blindtarmen.
- Håll mitten av blindtarmen med steril pincett och Använd en platt sterila metall spatel att försiktigt skjuta cecal innehållet ur snittet avslutas, med en rullande rörelse och undvika en skrapning rörelse som kunde Riva epitel. Samla in innehållet och placera dem i ett preweighed 15 mL centrifugrör.
- Poolen cecal innehållet från maximalt fem möss i samma rör. Väga röret igen när allt innehåll har lagts till.
Obs: Räkna med ett genomsnitt på 300 mg och upp till 390 mg cecal slurry per mus, som kräver 1,8 till 2,4 mL D5W för resuspension per mus; Därför, med mer än fem möss under detta steg kan resultera i överfyllning av 15 mL centrifugrör. - Torka verktygen rena med en etanol-besprutas pappershandduk och omsterilisera dem genom att upprepa steg 1.2-1.6.
- Cecal flytgödsel filtrering
- Väga centrifugröret fylld med cecal innehållet och beräkna mängden D5W att lägga till cecal innehållet genom att dividera vikten av cecal innehållet med önskad lager koncentration i milligram per milliliter, liksom i ekvationen nedan.
- I en BSC, lägga till det begärda beloppet av iskall D5W till centrifugröret 15 mL som innehåller cecal innehållet.
- Vortex 15 mL Centrifugera röret vertikalt och horisontellt i 30 s. Kontrollera för partiklar av mer än 1-3 mm i diameter, och i förekommande fall, fortsätta omskakas tills alla stora partiklar har synbart försvunnit.
- Placera en steril 70 µm cell SIL i en 50 mL centrifugrör som placeras på is. Pipettera 4 mL återsuspenderade cecal slurry cell silen och sedan till samling röret. Återsuspendera partiklar av pipettering upp och ner 2 x-3 x. Försiktigt pressa bubblor för att öka filtrering hastigheten under omrörning innehållet med pipettspetsen tills det finns inga fler droppar som filtreras.
Obs: När man blandar, det kan finnas partiklar tillräckligt stor för att plugga i 5 mL pipett. I detta fall upprepa vortexa från steg 2.5.3 och om lösningen fortfarande inte bryta isär, Använd pipetten för att trycka partiklar mot väggen i centrifugröret. - Upprepa steg 2.5.4, ändra cellen silar mellan varje rör cecal slurry och pool allt innehåll i den samma 50 mL samling centrifugrör höll på isen eller i en andra 50 mL centrifugrör om volymen av filtratet överstiger nivån is i ice box.
- Väga centrifugröret fylld med cecal innehållet och beräkna mängden D5W att lägga till cecal innehållet genom att dividera vikten av cecal innehållet med önskad lager koncentration i milligram per milliliter, liksom i ekvationen nedan.
- Alikvot cecal suspensionen.
- I tillämpliga fall, kombinera flera 50 mL cecal flytgödsel filtratet rör från steg 2.5.5 till en större steril behållare (t.ex. en 1 000 mL lagring-flaska). Sedan virvel för 15 s och plats 20 mL i en ny 50 mL centrifugrör.
- Vortex cecal flytgödsel beståndet i det 50 mL centrifugröret för 5-10 s, och alikvotens 500 µL till tre 2 mL kryogen flaskor som har en gummitätning, för att förhindra avdunstning över tid. Placera omedelbart master materiel och aliquoted kryogen injektionsflaska på is.
- Upprepa steg 2.6.1 och 2.6.2 tills alla cecal slammet har varit aliquoted, vortexa master beståndet efter varje tre kryogen flaskor att förhindra reglerandet av alla partiklar och att bibehålla en homogen blandning.
- Frysa de cecal flytgödsel alikvoter vid-80 ° C.
Obs: Förvänta dig mellan tre till fyra lager injektionsflaskor på 500 µL från varje vuxen mus. Varje lager injektionsflaska bör vara grovt nog att utmaning en kull på åtta möss vid DOL 7.
3. sepsis challenge 7-dag-gammal neonatala möss
- Separera, identifiera och väga neonatala möss.
- I en BSC, överföra de neonatala möss till en ny bur att hålla möss borta från dammen och minska stress till dammen.
- Ta bort och gnugga del av häckande material med handskar att överföra den Cages lukten till handskarna. Sedan forma det häckande materialet till en mindre boet och placera det i en ny bur utan dammen.
- Överföra de neonatala möss till häckande material i nya buren.
- Överföra mer häckande material för att göra en andra, tomma boet i nya buren.
- Stänga och ta bort dammen bur från huven så att dammen inte är stressad från att höra någon av neonatala mösss ångest.
- För att spåra enskilda neonatala möss inom kullen över tid, använda en etanol-bevis markör för att markera en till fem prickar på framsidan eller baksidan av svansen, omtillämpa varje 12-24 h efter behov.
- Väga varje mus som kommer att utmanas, att placera varje i sekundärt boet efter vägning och upprepa detta för alla mössen.
- Returnera hela kullen till dammen innan du förbereder cecal flytgödsel utmaningen alikvotens.
- Beräkna de individuella vikt justerade doserna av cecal flytgödsel och krävs spädning med D5W genom slutförandet av detta steg för varje kull separat eller beräkningarna nedan eller använda medföljande kalkylbladet (se Kompletterande fil).
- Beräkna milligram cecal slurry (en) som ges till varje mus genom att multiplicera vikten på musen i gram (b) den önska utmaning dosen i milligram cecal flytgödsel per gram mus (c).
- Beräkna den enskilda volymen av outspädd cecal flytgödsel lager krävs per mus i mikroliter (d) genom att dividera milligram cecal slurry behövs per mus från steg 3.2.1 (en) av lager cecal flytgödsel koncentrationen, 160 mg cecal slurry per milliliter av D5W (e), och multiplicera med 1000 µL per milliliter att konvertera från milliliter till mikroliter.
- Genomsnittliga lager volymen cecal slurry krävs per mus (g) genom att summera volymen av cecal flytgödsel lager (d) per mus i en kull av n möss, dividerat med antalet möss (n).
- Beräkna den genomsnittliga utspädningsfaktorn för cecal flytgödsel beståndet (h) genom att dividera den genomsnittliga injektionsvolymen (100 µL) av den genomsnittliga lagerföra volymen av cecal flytgödsel krävs per mus (g).
- Beräkna varje musens specifika injektionsvolym i mikroliter (j) genom att multiplicera varje musens volym lager cecal slurry krävs (d) med genomsnittliga utspädningsfaktorn (h), och sedan avrunda det de närmaste tio (att matcha den 10 µL ökningar av injektionssprutan).
- Beräkna den genomsnittliga volymen krävs D5W att späda cecal flytgödsel beståndet (k) genom att subtrahera det genomsnittliga cecal flytgödsel lagret (g) från den genomsnittliga injektionsvolymen (100 µL).
- Beräkna den totala mängden cecal flytgödsel lager i mikroliter (l) genom att multiplicera det genomsnittliga lager cecal flytgödsel per mus i mikroliter (g) av antalet möss i denna kullen (n) och multiplicera med 1,4 att skapa extra.
- Beräkna den totala mängden D5W i mikroliter (m) krävs att späda cecal flytgödsel beståndet genom att multiplicera den genomsnittliga volymen krävs D5W (k) av antalet möss (n) och multipliceras med 1,4 att skapa extra.
- Beräkna milligram cecal slurry (en) som ges till varje mus genom att multiplicera vikten på musen i gram (b) den önska utmaning dosen i milligram cecal flytgödsel per gram mus (c).
- Förbereda alikvoten som utmaning efter beräkningen av lager cecal flytgödsel krävs (l från steg 3.2.7). I en BSC, Tina erforderligt antal cecal flytgödsel lager injektionsflaskor i rumstemperatur, pipettering dess innehåll att blanda.
- När det finns ingen mer synliga iskristaller i den tinade cecal flytgödsel, överföra det beräknade beloppet för cecal flytgödsel lager (l från steg 3.2.7) till en steril 1,8 mL mikrocentrifug rör.
- Späd till önskad koncentration genom att lägga till iskall D5W som beräknas enligt steg 3.2.8 (m). Lagra alikvoten som utmaning på is.
- Innan du fyller sprutan, blanda mikrocentrifug röret genom att snärta det 20 x, följt av 3 x utarbeta och utvisa 300-500 µL cecal slurry med en 500 cc 28 G ½ tum insulinspruta.
- Rita upp ungefär 150 µL utspädda cecal slurry i samma spruta.
- Snärta sprutan för att få bort bubblor från kolven, dra tillbaka något på sprutan och sedan utvisa bubblor.
- Fördela den överskjutande cecal flytgödsel tillbaka i mikrocentrifug röret tills den rätta mängden cecal flytgödsel för en mus, som beräknades för enskilda möss i steg 3.2.5 (j), är laddad i sprutan.
- Intraperitonealt injicera cecal flytgödsel, enligt relevanta lokala djurens vård institution riktlinjer, eller Använd stegen nedan.
- I en BSC, separat neonatala möss från dammen som beskrivs i steg 3.1.
- Kragen musen av baksidan av halsen, med hjälp av tummen och pekfingret.
- Säkra musens svans över ryggen av den och ringfinger, eller på framsidan av ringen och pinky fingrarna.
- För att minimera läckage, luta neonatal musen så att den är vänd nedåt och sätt nål avfasningen kanylen pekandes uppåt, mellan benet och genitalier, att hålla nålen grunt och subkutan.
- När nålen sätts till 1 cm, tryck nedåt och framåt för att känna nålen punktering bukhinnan. Tryck långsamt in kolven, hålla spetsen på nålen så stadigt som möjligt, laterala rörelser kan skada musens organ.
- Dra försiktigt tillbaka nålen över 5-10 s, följa samma väg ut som, avkopplande långfingret under borttagningen till minska spänningen i musens kropp.
- För att kontrollera efter läckor, håll nere musknappen i några sekunder efter avlägsnande av nålen, att ge tid för injektionsstället att stänga, och observerar läckage eller utbuktning vid injektionsstället, vid vilken punkt musen inte bör användas i analysen.
Obs: Utbuktningen av huden vid injektionsstället indikerar en misslyckad intraperitoneal injektion, med den injectant som subkutan. - Placera musen på en pappershandduk och låt musen för att ta ett steg. Om musen är orörlig för 5 s, tryck lätt på svansen.
- Plocka upp musen och kontrollera eventuella läckage cecal slurry vid injektionsstället. Om det finns en läcka, utesluta musen från analysen och avliva musen.
4. mus övervakning
- Övervaka möss regelbundet för att kontrollera dem anländer till en human slutpunkt.
- Iaktta möss 2 h postchallenge för injektion-relaterade komplikationer.
- Övervaka möss 12 h postchallenge för sepsis-relaterade sjuklighet och identifiering av möss vid en human slutpunkt (se steg 4,2-4,3 för kriterier).
- Därefter övervaka varje 4-6 h de första 2 dagarna, utom för 8 h över natten, när de neonatala möss är obevakad.
- Utöver 2 dagar postchallenge, övervaka 1 x-2 x per dag. Om sjuka möss eller möss vars hälsa poäng minskar observeras, sedan öka den övervakning frekvensen till varje 4-6 h.
- Övervakning neonatala möss
- För någon åtgärd som medför neonatala möss, överföra materialet till en ny bur sängkläder som beskrivs i steg 3.1 (av samma skäl som nämnts det). Kontrollera noga för eventuella nyfödda som dras från boet medan omvårdnad. Alla möss som dras ur kullen medan omvårdnad bör inte anses vara utspridda möss.
- När du tar bort toppen av boet, identifiera någon spridning av neonatala möss antingen från boet eller fastnat i det häckande materialet men bort från deras littermates, med undantag för möss dras bort från kullen vid amning. Hänvisa till humana slutpunkten kriterier i steg 4.5 om en mus hittas utspridda.
- Mäta mössens rätande reflexer och rörlighet.
- På en pappershandduk, placera en mus på ryggen och övervaka för sin förmåga att rätt själv inom maximalt 4 s. När den placeras på ryggen, kommer att musen falla till antingen vänster eller höger sida, vilket är när 4 s rösträkningen inleds.
Obs: För att delas in i gruppen ”rättigheter”, musen måste kunna få minst tre av fyra tass madrassera på hushållspapper för 1 s. Det är fortfarande grupperade som att kunna rätt själv om det faller.- Om musen kan höger sig själv, vänta sedan 8 s fastställa dess rörlighet.
- Kategorisera musen som ”rättigheter-mobil” om det kan rätt själv och utforska sin miljö genom att ta flera steg i rad.
- Kategorisera musen som ”rättigheter-slö” om det kan rätt själv och ta några steg att utforska sin omgivning. Möss i denna grupp kan falla över medan du tar ett steg, ser skakig på fötterna och pausa mellan stegen.
- Kategorisera musen som ”rättigheter-Nonmobile” om det kan rätt själv men inte flytta runt en hel del. Det kan fortfarande falla, och om det inte vidtar några åtgärder inom 8 s, det är grupperade som rättigheter-Nonmobile.
- Om musen inte kunde rätt själv, sedan kategorisera dess rörlighet baserat på observerade hip rörelsen.
Obs: Undvik att upprepa övervakning eller öka längden på tiden musen tillbringar på ryggen eftersom detta kunde påverka poängsystem och Human slutpunkt, som en mus som underlåter att rätta sig inom 4 s kan ibland göra det om ges mer tid.- Kategorisera musen som ”misslyckas till höger (FTR)-mobil” om det inte till höger sig själv och visar hip rörelse som överskrider 90° vinkel från horisontalplanet. Vissa möss kan rätt själva om ges mer än 4 s men ska fortfarande kategoriseras som FTR, med rörlighet poäng baserat på hip rörelse.
- Kategorisera musen som ”FTR-slö” om det inte till höger sig själv och visar hip rörelse under 90° vinkel från vågrät.
- Kategorisera musen som ”FTR-Nonmobile” om det inte till höger sig själv och har ben att skaka eller vibrera men ingen hip rörelse. Lemmar kan utöka eller dra tillbaka men göra inte har laterala rörelse. Musen är synbart sjuk och har nått den humana slutpunkten.
- På en pappershandduk, placera en mus på ryggen och övervaka för sin förmåga att rätt själv inom maximalt 4 s. När den placeras på ryggen, kommer att musen falla till antingen vänster eller höger sida, vilket är när 4 s rösträkningen inleds.
- Upprepa steg 4,3 på andra sidan av musen, inspelning båda sidor.
Obs: Se Kompletterande fil för inspelning av observationer. - Avgöra om musen är på en human slutpunkt och kräver dödshjälp som beskrivs i tabell 1, och nedanför.
- Kategorisera möss i olika rätande och mobilitetsnivåer baserat på övervakning observationer antecknade i steg 4.3 och 4.4. Musens rörlighet mäts för varje sida, och mobila beteendet används för att avgöra om musen kräver dödshjälp.
- Tilldela alla möss med en rätande reflex av antingen (a) FTR-Nonmobile eller (b) FTR-slöa och hittade separerade från boet vara på en human slutpunkt.
- I övervakning punkter utöver 20 h postchallenge, klassificera någon mus med en rätande reflex av ”misslyckas till höger” på båda sidor vara en human slutpunkt, eftersom presenterade uppgifter med hög noggrannhet förutse att dessa möss så småningom duka under för sjukdomen, inte och återställa.
- Separat möss som ska bli euthanized, vilket anges i steg 4,5. Om den övervakade mus inte ses som på en human slutpunkt, placera den i andra tomma boet i nya buren utan dammen, och fortsätta med de andra neonatala möss.
- När hela kullen har övervakats, flytta hälften av häckande material in i buren med dammen, reformera ett rede med plats i mitten för neonatala möss.
Obs: En felaktigt bildade boet kan orsaka mössen scatter och minska mängden tillgänglig vård som dammen kan erbjuda. - Över de neonatala möss tillbaka i buren med dammen.
- Omslut kullen i boet genom att sätta det överblivna häckande materialet över kullen och försiktigt klämma det runt locket för att säkra det häckande materialet på plats.
- Avliva de neonatala möss separerade i steg 4,6 enligt lokala institution krav.
5. titrering av cecal slammet
- Utmana möss med önskad utmaning dos (avsnitt 3) och övervaka resultat (avsnitt 4).
- Observera om det slutliga resultatet resulterar i önskad LD och om inte, upprepa avsnitten 3 och 4 med en ny kull på en högre eller lägre utmaning dos, anpassa den med 5-10%.
Obs: Utmaning doser kan vara liknande figur 1B men behöver vara titrerade i varje anläggning och stam av möss. - Också, observera om mössen uppnå en human slutpunkt snabbare eller långsammare än den förväntade kineticsen i figur 1B, och upprepa avsnitten 3 och 4 med en ny kull på en högre eller lägre utmaning dos, anpassa den med 5-10%.
Representative Results
Cecal flytgödsel livskraft lagras vid-80 ° C kan testas med tiden genom seriellt späda och plätering alikvoter av cecal flytgödsel lager på 5% fårmjölk blod tryptic soy agar följt av 24 h aerob inkubation vid 37 ° C. Efterföljande rösträkningen odlingsbara kolonibildande enhet (CFU) innehåll cecal flytgödsel preparats hittades inte för att ändra under en 6 månaders period och lönsamhet påverkades inte av långvarig lagring vid-80 ° C (figur 2). Varje givare mus medförde, i genomsnitt tillräckligt cecal flytgödsel att utmana tre till fyra kullar (inga data anges).
Möss som utmanade vid DOL 7 med cecal flytgödsel inducera polymikrobiella sepsis började nå humana slutpunkten inom 12 h av utmaningen och polymikrobiella sepsis löstes mestadels genom 48 h postchallenge, som observerades i en Kaplan-Meier överlevnad kurva kombineras från data från över 200 utmanade möss (figur 1A). Dödlighet var beroende på utmaning dos, med en 5% förändring av utmaning dos vilket resulterar i en ungefär 15% skillnad i överlevnad (figur 1B). Musen kroppsvikt mättes vid varje uppföljning besök. Viktminskning observerades i alla utmanade djur, att vara icke-diskriminerande mellan möss som hamnade överlever och de som inte under första 24 h postchallenge (figur 1 c). Efter 24 h började mest överlevande djuren återfå sin vikt, medan alla nonsurvivors fortsatte att gå ner i vikt och flyttade till sin humana slutpunkten. Dock en liten andel överlevande djur som hade behållit sin rätande reflex fortsatte också att gå ner i vikt eller misslyckats att vinna vikt, fram till slutet av experimentet, även förlora så mycket som 20% av sin initiala kroppsvikt inom 40 h av utmaningen. Det var en överlappning av viktminskning mellan möss som hamnade överlever och de som gjorde det inte, förändringen i vikt eller ett tröskelvärde på viktminskning kan inte användas som ett kriterium för humana slutpunkten samtidigt bibehålla målet med korrekt dividera överlevande från nonsurvivors.
Beteendet hos möss var övervakas som beskrivs i protokollet och i tabell 2. Ögonblicksbilder av hälsa kategorier visas (figur 3A-C). Dessa bilder visar de olika hälsa kategorierna av möss som misslyckades att rätt sig efter att ha placerats på ryggen och beskriva skillnaden mellan FTR-Mobile och FTR-slö, vilket är en viktig distinktion. Ohotad friska möss i denna ålder visar inte FTR-slö aktivitet; Därför är denna hälsa kategori en markör av sjukdom och ett svar att utmana. Sjuka möss visas FTR-slö symtom (figur 3B) och kan regrediera mot FTR-Nonmobile (figur 3 c), där det övre benet fortfarande parallellt med det nedre benet, med liten eller noll hip vaggande rörelse, som är ett av kriterierna för humana slutpunkten. Möss kan också återställa, vinner ökad hip rörelse och bli FTR-Mobile (figur 3A). Den rätande reflex och rörlighet noter bestämdes för både vänster och höger sida av varje mus och högsta poäng utnyttjades för att avgöra om musen hade nått en human slutpunkt. Beteendemässiga information samlades in från över 240 djur utmanas med en dödlig dos 60 (LD60) cecal flytgödsel, och 144 humana slutpunkter observerades (figur 3D-F och tabell 1). Detta bevis-driven strategi användes för att definiera och förfina den humana slutpunkten investeringsfaser fyra sjukdom, kategoriseras genom de praktiker utgångspunkt i både beteendemässiga skillnader mellan överlevande och nonsurvivors och fraktionen av humana slutpunkter nått under varje tidsperiod. Under tidiga experiment visade FTR-Nonmobile möss som hade ingen hip rörelse genomgående döda inom 4-6 h i detta beteende observeras. I samlingen av det presenterade informationen användes en FTR-Nonmobile hälsa poäng som kriterium för en human slutpunkt. Från 12-21 h postchallenge, medan FTR-Nonmobile möss var euthanized, både överlevande och nonsurviving djur visas mycket liknande beteendemönster och kunde inte urskiljas på något annat sätt (figur 3D). Från 21-48 h postchallenge, flesta överlevande möss återfick sin rätande reflex, medan färre än 1% av FTR beteenden observerade var i djur som skulle gå på att överleva experimentet (figur 3E). Möss som misslyckats med att just själva från båda sidor blev således, ytterligare ett kriterium för humana slutpunkten under denna tid. Mellan 12 och 20 h postchallenge observerades 12,5% av det totala antalet humana slutpunkter, kontra 80,5 procent mellan 20 och 48 timmar och 7 procent efter 48 h (tabell 1). Ett utmärkande drag mellan möss som hamnade överlevande och som så småningom förvärrades till en human slutpunkt var förlusten av den rätande reflexen, oberoende av hip rörlighet (figur 3F). Ja, mellan 20 och 48 h efter utmaningen, sammanlagt 121 möss hade inte rätt sig från båda sidor, med 116 i dessa möss så småningom utvecklas till en human slutpunkt (som representerar en 96% noggrannhet identifiera möss som inte skulle få tillbaka). Bortom 48 h efter utmaningen observerades 11 möss misslyckas till höger sig från båda sidor, och 10 av dessa kommit till en human slutpunkt (en 91% noggrannhet). Utöver 20 h efter utmaningen förutspår antalet möss som förlorat den rätande reflexen för båda sidor slutresultatet med en noggrannhet på mer än 90%. Detta har därför lagts till humana slutpunkten kriterierna, att identifiera nonrecovering möss tidigare och minska mus lidande (tabell 1).
Frekvensen att möss behöver övervakning ändras över tid, på grund av olika priser för döden postchallenge, och beskrivs i tabell 1. En mus ansågs vara i dess humana slutpunkten när som helst om det inte hade till höger sig själv och visas nonmobile hip rörelse på båda sidor, eller om musen hittades utspridda i boet, gick inte till höger sig själv, och hade slö hip rörelse. Möss med något av dessa villkor inte förväntades kunna återförenas med kullen och har observerats för att vara FTR-Nonmobile inom 4-6 h. start 20 h efter utmaningen, lades en ny Human slutpunkt eftersom den presenterade informationen visar att den stora majoriteten av möss som FTR från båda sidor hamnar duka under till sjukdom.
De videor, tabeller och resurser som presenteras i detta manuskript är en effektiv undervisning resurs för rätt beteende tilldelningen av utmanade möss. Sju praktiker ombads att titta på utbildningsvideo och läsa både protokollet och tabellerna innan du tilldelar beteenden till 60 utmanade djur. Identifiering av humana slutpunkten uppdrag var korrekt både för särskiljande FTR-Nonmobile möss från möss som visas de andra beteenden (figur 4A) och FTR möss från möss som kunde rätt sig inom den tillåtna tidsram ( Figur 4B).
Figur 1 : Kaplan-Meier överlevnad kurva, cecal flytgödsel dostitrering och förändring i kroppsvikt efter utmaningen cecal flytgödsel. (A) överlevnad resultatet av neonatal C57BL/6J möss utmanas med en intraperitoneal cecal flytgödsel injektion vid DOL 7. Data för denna siffra kombinerades från oberoende experiment med flera utmaning doser, från 0,7 till 1,3 mg cecal slurry per gram kroppsvikt administrerades till dessa möss. (B) neonatala möss utmanas med 0,80 till 0,95 mg cecal flytgödsel per gram kroppsvikt från ett cecal flytgödsel preparat visar en dosberoende relation mellan mängden cecal flytgödsel tanke och andelen överlevnad. ()C) procentuella förändringen i vikt jämfört med utmaning vikt, med den streckade linjen som betecknar en 20% förlust av vikt från tiden av utmaningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : CFU koncentration i cecal flytgödsel lager lagras vid-80 ° C inte ändras över en 6 månadersperiod. Effekten av cecal flytgödsel ålder på CFU koncentration testades med linjär regression. Varje punkt representerar en alikvot av samma cecal flytgödsel preparatet, seriellt spädas och klädd under en 6 månaders period. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Höft rörlighet kategorier av möss som misslyckas med att just själva och djurs beteenden vid olika tillfällen postchallenge. Möss som har ifrågasatts och sepsis, när den placeras på ryggen, kommer att visa tecken på sjuklighet som kan mätas av graden av hip rörelse. (A) A misslyckas till höger (FTR)-mobil mus visar hip vaggande rörelsen av deras övre benet överstiger 90 ° vinkel från horisontalplanet. (B) en FTR-slö mus visar HipHop gungande rörelse men inte överstiger 90 ° vinkel från horisontellt vid någon punkt under 4 s av övervakning. (C) vissa FTR-Nonmobile möss kommer att förlänga deras ben, böja på knäet, men visar mycket liten (mindre än 10 ° vinklar) till noll hip gungande rörelse, och benen kvar parallellt med varandra. (D) djurens beteenden 12-21 h postchallenge visar att endast FTR-Nonmobile beteenden separata överlevande från nonsurvivors. (E) från 21 till 48 h postchallenge, endast 4 av 592 observerade FTR beteenden (0,67%) tillhör överlevande, tillåter den rätande reflex att förutsäga slutresultatet och användas som ett nytt kriterium för humana slutpunkten. (F), utöver 48 h angripen, 6 av 131 möss (4,55%) som hade en rätande reflex kom att bli en del av gruppen FTR och offrades i slutet av experimentet, motiverar fortsatt övervakning under återhämtning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Instruktions resurser resultera i korrekt beteendemässiga klassificering av oberoende praktiker. Praktiker som tränas av vaktande video åtföljer detta protokoll kategoriseras videor av 60 neonatala möss i olika hälso grupper. (A), förmågan att skilja en human slutpunkt bestämdes och 97% av beteenden i genomsnitt var korrekt Kategoriserad som FTR-Nonmobile eller inte, medan endast 1% av FTR-Nonmobile möss var felidentifierad. Två procent av mössen var felaktigt identifieras som FTR-Nonmobile. (B) identifiering av den andra humana slutpunkten criterium korrekt skilja mellan FTR möss eller dem som har förmågan att rätt sig inom 4 s placeras på ryggen har angetts korrekt i 97% av menyövergångar, medan endast 0,96% av mössen var felaktigt tilldelade som rätande själva och 2% av möss var felaktigt tilldelade som FTR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sjukdom Stadium | A: hög sjuklighet, ingen mortalitet | B: hög sjuklighet, låg mortalitet | C: hög sjuklighet, hög dödlighet | D: låg morbiditet, låg dödlighet |
| Timmar efter utmaning | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Övervakning frekvens | 2 h post utmaning | varje 4−6 h | Varje 4−6 h, 8 h, obevakad under natten | 1−2 gånger dagligen, mer om det behövs |
| Andel av totala humana slutpunkter som observerats | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Procentandel av humana slutpunkter observerade | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Humana slutpunkten kriterier | 1. FTR−Nonmobile på båda sidor | 1. FTR−Nonmobile på båda sidor | ||
| 2. spridda från boet och är FTR−Lethargic | 2. spridda från boet och är FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR på både vänster och höger sida (med någon rörlighet Poäng) | ||||
Tabell 1: frekvens av övervakning och humana slutpunkten kriterier i de olika stadierna av sjukdom. Övervakning frekvens, humana slutpunkter observerats, procentandelen av humana slutpunkter och humana slutpunkten kriterier under olika skeden av sjukdomen.
| Rätande Reflex | Rörlighet | Tidsfristen till höger efter att ha placerats på rygg | Tidsgräns för att mäta mängden rörelse (mobil / slö / nonmobile) | Rörlighet poängkriterier |
| Rättigheter | Mobile | 4 s | Ytterligare 8 s | Musen tar flera steg i rad, att upprätthålla drivkraft, och utforskar sin omgivning. Valpen kommer inte att falla. |
| Slö | Musen kan ta ett steg men stoppar och pausar innan du tar en annan. PUP kan falla. | |||
| Nonmobile | Musen vidtar inte några åtgärder efter rätande själv. PUP kan falla. | |||
| Misslyckas till höger | Mobila höfter | Den samma 4 s används för att mäta rätande reflex | Har energisk hip rörelse med det övre benet roterande utöver 90° från horisontell minst en gång inom 4 s. | |
| Slö höfter | Hip rörelse upp till men inte längre än 90° från horisontalplanet. | |||
| Nonmobile höfter | Lemmar kan flytta genom att utvidga och infällbara men höfterna roterar inte. Valpen ser mycket sjuklig. |
Tabell 2: övervakning av tabell och kriterier för att fastställa den hälsa poängen av möss. De medföljande kriterierna användes för att definiera hälsa kategorigrupper till möss, och att minska individuella varians i tilldela hälsa noter.
Discussion
Postnatal neonatala möss har mycket begränsad rörlighet och misslyckas att rätta sig efter att ha placerats på ryggen, även när oemotsagda. Av DOL 7, åldern av möss utmanas i denna modell, ett utbud av rörelse som sträcker sig från rättigheter-Mobile till FTR-Mobile observerades i ohotad möss, med en viktig skillnad, nämligen att en ohotad mus vid denna ålder ingen visade FTR-slö beteende. Endast möss utmanas med polymikrobiella sepsis har observerats för att bli FTR-slöa; Detta svar kan därför vara en markör för sjukdomens svårighetsgrad. Att uppmärksamma brytpunkten på 90° vinkel från horisontell för hip rörelse tillåter för konsekventa och korrekta tilldelning av slö eller mobila hip rörelse hos möss. Tidsramen för 4 s för att se om en mus kan rätt själv valdes eftersom ohotad möss kunde konsekvent rätt sig inom denna tidsram. Upprepad mätning av samma mus undveks, medan tiden till höger själva och mätning av höft rörlighet begränsades till 4 s, undvika alltför tröttande musen, som annars kan påverka dess förmåga att få mat och värme och kan påverka dess prognosen att bli bättre. Rätande sig från både vänster och höger sida observerades och den högre av poängen användes för att avgöra om musen var på en human slutpunkt, eftersom vissa möss visade för att Visa FTR-Nonmobile på ena sidan ännu har en högre rörlighet på andra sida och b e kunna återhämta sig så småningom.
Det poängsystem som används till att utvärdera musen hälsan åberopade tillämpningen av kategoriska cutoffs på vad är ett spektrum av rörelse och därför kunde vara benägna att enskilda bias. Personalen utbildades tillsammans att säkerställa varje person gjorde mössen samma; Det kommer dock sannolikt att förbli en nivå av subjektivitet som leder till variation. Konsekvens av scoring utvärderades genom att ha sju forskare som inte hade tidigare utfört neonatal mus övervakning Läs kraven som anges i detta protokoll och video och sedan självständigt tilldela beteenden och bestämma humana slutpunkten. En 97% noggrannhet observerades med scoring utförs på 60 utmanade möss, vilket tyder på att enskilda bias inte spelar en betydande roll i de beteendemässiga uppdrag av denna modell. Presenterade beteendemässiga övervakning protokollet är baserat på observationer av djur utmanas på DOL 7, men möss som är yngre än 6 dagar i en ohotad felfritt tillstånd kan inte konsekvent just själva. Således kunde kriterierna som beskrivs humana slutpunkten inte appliceras direkt på yngre möss. Om yngre möss som används i denna experimentella modell eller om en annorlunda utmaning modell med olika sjukdomen kinetik används, måste sedan lämplig Human slutpunkt kriterier utvecklas och lotsade Undvik dödshjälpen av möss som skulle annars, så småningom, återställa. Poängsystem som visar en robust metod att förbättra humana slutpunkten klassificering som, med provning och bekräftelse, skulle potentiellt kunna tillämpas på andra modeller.
Varje beredning av cecal slam eller användning av en ny mus stam krävs retitration av cecal flytgödsel dosen att administrera för att uppnå en liknande dödlig dos. Varje gång sedan standardiserades av uppläsningen av intresse, nämligen överlevnad, snarare än att ge samma bakterie räkningen. Varje cecal flytgödsel beredningens livskraftig bakteriell koncentration varierade något, eventuellt på grund av skillnader i givarens kommensaler bakterier eller på grund av variationer i vikt kvar i cellen silen av den cecal flytgödsel lager postfiltration. Under titrering av cecal slam, de första två kullarna var indelade i två grupper och varje halva av kullen utmanades med en av de två doserna så att var och en av doserna som skulle testas i två kullar. Om den resulterande överlevnaden inte matchade nivån som krävs, sedan utmaningen dosen var antingen ökat eller minskat med 5% - 10% och experimentet upprepas. Flera kullar har använts för att redogöra för kull-till-kullen skillnader som kunde orsaka resistens eller ökad känslighet för sepsis över en kull. Det var viktigt att korrekt titer cecal flytgödsel beståndet med varje nytt preparat att säkerställa att nya titrering av cecal flytgödsel var jämförbar med föregående cecal flytgödsel preparat. Perioder av överflödigt buller och vibrationer, särskilt under den komprimering av asfalt och byggandet av en närliggande byggnad och road, observerades för att öka stress i dammarna. Detta korrelerade med ökad förekomst av cannibalization, och påverkade dödligheten hos de överlevnad experiment, även påverkar ohotad möss, vilket indikerar att det kan finnas ovidkommande påverkan på neonatal överlevnad som också behöver styras för.
Tidigare metoder för cecal flytgödsel lager förberedelsen ingår antingen användning av färska cecal flytgödsel eller beredning av frysta cecal flytgödsel, med hjälp av olika metoder, inklusive lagring i glycerol som oundvikligen skulle överföras under utmaningen. Även användningen av färska cecal flytgödsel ger fördelen av att ha en bakteriell sammansättning som är närmast original cecal innehållet, finns risken för variansen mellan enskilda givare möss på grund av kommensaler bakterier. Medan detta var minimeras genom att använda cecal givare från samma leverantör med minimal tid mellan ankomst och progression av experimentet, detta kunde bli en kostnad-oöverkomliga alternativ för vissa laboratorier och presenterade en annan timing logistik utmaning att ha åldersmatchade möss tillgängliga när vederbörande inleder en cecal slurry experimentera i neonatala möss som var 7 dagar gamla. En alternativ metod att använda färska cecal flytgödsel utnyttjades, där flera vuxna givarnas cecal innehållet var poolade, resuspended i D5W, fryst vid-80 ° C utan glycerol, och tinade en alikvot i taget för experiment. Utnyttjandet av vuxen donator cecal flytgödsel att studera neonatal sepsis kunde potentiellt överföra arter av bakterier som finns i den cecal flytgödsel som neonatal musen inte har utsatts för, men det är en strategi som möjliggör studier av sepsis hos neonatala möss och har använts för att studera neonatal mus biologi i den tidigare13,14,15. Cecal flytgödsel var utspädd i D5W att ge näring till bakterier, vilket möjliggjorde upprättandet av en aktiv infektion när bakterierna var injiceras, och gjordes för att efterlikna tillgången på näringsämnen i peritoneal hålighet under nekrotiserande enterokolit. Glycerol ingick inte som en stabiliserande agent i frysning bakterier på grund av de potentiella negativa biverkningar som kan uppstå från glycerol injektion ensam. Om glycerol hade inkluderats i cecal flytgödsel beredning, då den potentiella skadan att glycerol ensam kunde framkalla skulle behöver testas för genom att inkludera en glycerol-bara (saknar cecal slurry) injektion i möss, vilket skulle ha ökat mus användning. Bakterier livskraft cecal flytgödsel bestånden testades efter frysning cecal flytgödsel beståndet utan glycerol och befanns vara konstant, med ingen förändring i bakterier koncentration i separata portioner av samma cecal flytgödsel preparatet lagras vid-80 ° C över en 6 månadersperiod. Detta tyder på att lagring utan glycerol är genomförbart att tillhandahålla ett konsekvent biologiska resultat. Användningen av en bulk-beredd frysta cecal flytgödsel lager tillåtet också för användning av möss föds upp internt, minska kostnaden och därför utnyttja hanmöss som annars skulle vara överflödig från avel, minska slöseri med musen.
Identifiering av misslyckade utmaningar hos möss var viktigt att undvika att lägga extra buller till systemet. Efter att ha genomgått en intraperitoneal injektion cecal slurry, observerades möss för förekomsten av en utbuktning under huden, som indikerade en misslyckad injektion som var faktiskt subkutan. Möss observerades efter läckor på injektionsstället, både omedelbart efter nålen borttagning och ger dem möjlighet att ta ett steg efter injektionen, eftersom möss skulle ibland (sällan) läcka bara efter att ha flyttat delgrunden injektionsstället genom att ta ett steg. Förekomsten av en utbuktning eller läcka efter injektionen resulterade i att ta bort musen från analysen. Efter alla, kan endera av dessa leda till en annan utgång på grund av de felaktiga cecal flytgödsel injiceras som en 5% skillnad i utmaning dos har observerats påverka efterföljande överlevnad.
Cecal flytgödsel utmaning experimenterar ofta krävs varierande mål dödliga doser med varierande vikt justerade doser. På grund av detta, kan injektionsvolymer variera från så lite som 20 µL och upp till 100 µL. Den proportionella experimentella fel i samband med döda nål volym ändras också tillsammans med injektionsvolymen, ökar svårigheten för att direkt jämföra olika doser. Med enkel ändring av standardisera injektionsvolymen, tas denna källa av variansen bort från experimentet.
Musens neonatal beteendemässiga övervakningssystem, som används i detta protokoll är först i sitt slag. Forskare avsikt att bedriva etisk forskning med nyfödda möss ställs ofta inför utmanande bristen på resurser att bedöma djurens välbefinnande vid denna ålder. Presenterade intuitivt och konsekvent övervakningssystemet börjar att åtgärda bristen på denna kunskap. Allt detta bevis-driven strategi inte bara ökar kvaliteten på den experimentella data som erhållits men, samtidigt, också minskar lidandet för försöksdjuren.
Disclosures
Dr. James Wynn får stöd från National Institutes of Health (NIH) / nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper (R01GM128452) och NIH /Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen (NICHD) () R01HD089939).
Acknowledgments
Speciellt tack till Claire Harrison och Animal Care anläggningen på British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) för deras stöd i djurens arbete samt Dr Po-Yan Cheng för deras vägledning och ingång på djur övervakning och välbefinnande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
