هنا يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية كمياً تقييم امتصاص تاو طريق microglia بهدف إنشاء أداة الفحص لوصف أفضل آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة.
مرض الزهايمر (ميلادي) هو شرط الأعصاب تدريجي التي جمعت تاو وبروتينات اميلويد تتراكم في الدماغ مما تسبب في خلل الخلايا العصبية الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى التدهور المعرفي. ويعتقد هايبرفوسفوريلاتيد تاو المجاميع في الخلايا العصبية تسبب معظم الأمراض المرتبطة بالإعلان. ويفترض أن يفرج عنها في حجرة خارج الخلية هذه المجاميع وتناول الخلايا العصبية السليمة المجاورة حيث أنهم الحث على مواصلة تجميع تاو. يمكن أن توقف هذا “بريون–مثل” نشر من الأجسام المضادة القادرة على “تحييد” المجاميع تاو خارج الخلية كما هو موضح في نماذج الماوس الإكلينيكية للإعلان وملزم. إحدى الآليات المقترحة التي تقلل الأجسام المضادة العلاجية علم الأمراض هو جسم بوساطة امتصاص وإزالة أشكال مجمعة المرضية تاو من microglia. هنا، يمكننا وصف مقايسة يستند إلى الخلية كمية لتقييم امتصاص تاو microglia. هذا التحليل يستخدم خط الخلية microglial الماوس بي-2، يسمح لخصوصية عالية وتقلب منخفض ومتوسط الإنتاجية. البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا التحليل يمكن أن تساهم في وصف أفضل لوظائف المستجيب تاو المضادة الأجسام المضادة.
مرض الزهايمر (ميلادي) شرط الأعصاب تدريجي تتسم بالتغير كونفورماشونال والتجميع الذاتي لبروتين بيتا اميلويد الببتيد وتأو في المجاميع المرضية. الببتيد بيتا اميلويد الذوبان المعتاد يتم تحويلها إلى بيتا اميلويد oligomeric وفيبريلار، بينما تتراكم تاو فوسفوريلاتيد طبيعي ليغومرات والتشابك نيوروفيبريلاري1،2. هذه المجاميع البروتين يسبب موت الخلايا العصبية مما يؤدي إلى فقدان الذاكرة والتدهور المعرفي التدريجي لاحقاً. قد يؤدي إلى تفاقم عوامل أخرى، بما في ذلك neuroinflammation غير الإنتاجية، وانخفاض قدرة على مسح تجمعات من البروتينات، والتعجيل بالمرض. حاليا، توفر استراتيجيات التدخل ضد الإعلان تخفيف الأعراض إلى حد كبير، ولكن هناك لا علاج أو الوقاية من المرض–تعديل.
أدلة متزايدة تشير إلى دور رئيسي هايبرفوسفوريلاتيد تاو المجاميع في علم الأمراض الإعلانية. في حالة غير مرضية، هو تاو بروتين تكشفت أصلاً بربط microtubules ويعزز بها الجمعية إلى سيتوسكيليتون الخلايا العصبية. عندما يصبح تاو هايبرفوسفوريلاتيد، يفصل من سيتوسكيليتون ومجموعات في المجاميع تاو في الخلايا العصبية، التي يعتقد أنها تسبب معظم الأمراض المرتبطة بإعلان3. تجميعه تاو يبدأ تراكم أولاً إينتراسيلولارلي، ولكن مع تقدم المرض، فمن المفترض أن يفرج عن الخلايا العصبية المتضررة في الفضاء خارج الخلية، التي يمكن أن يؤخذ بمجاورة أو متصلة سينابتيكالي صحية من الخلايا العصبية في ” بريون الشبيهة بطريقة “. بمجرد استيعابه، يدفع مجموع تاو مزيد تاو التجميع عن طريق تغيير conformational templated4.
ووفقا لهذه الفرضية، العلاجات القادرة على مقاطعة تاو البذر قد تبطئ أو عكس مسار المرض تاو بوساطة الأعصاب. ودعما لهذه تظهر الفئران أدلى الطفرات الوراثية عرضه تاوباثي وحقن سلبية مع الأجسام المضادة تاو تاو انخفاض الأمراض وتحسين الوظائف المعرفية5،،من67،8 ،9. غير أن الآليات التي تقلل الأجسام المضادة العلاجية علم الأمراض لا تزال بعيدة المنال.
واحدة من الآليات المقترحة هو جسم بوساطة امتصاص وإزالة أشكال مجمعة المرضية تاو من microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ. المنشورات الأخيرة توحي بأن microglia كفاءة يمكن أن تستوعب والحط من الأنواع المرضية تاو وهو تعزيز قدرة هذا تاو المضادة الأجسام المضادة عن طريق Fc تعتمد على الآلية التي تشمل مستقبلات Fc أعرب على سطح microglia ومستقبلات وساطة البلعمه10،11. وتحدد هذه البيانات microglia المستجيبة التي قد تكون هامة للأجسام المضادة العلاجية.
يصف لنا هنا مقايسة يستند إلى الخلية لتقييم كمي امتصاص تاو microglia. البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا التحليل يمكن أن يساعد على توضيح آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة وبالتالي يمثل أداة مفيدة للتقدم تاو المضادة الأجسام المضادة إلى مزيد من الخطوات لتنميتها كعلاج ميلادي محتمل.
Microglia، المقيم في الدماغ الخلايا المناعية، وقد حددت مؤخرا كعناصر فاعلة هامة في جسم بوساطة النهج العلاجي لمدة10،تاوباثيس11. إزالة تاو جسم بوساطة من microglia، جنبا إلى جنب مع إعاقة امتصاص الخلايا العصبية9أو تثبيط أو زعزعة استقرار فيبريل تشكيل13،14 وتطهير ييفات إينترانيورونال عبر تعويض مسار15، قد تسهم جميعها فعالية جسم تاو المضادة ملاحظة في نموذج الفأر من تاوباثي5،،من67،،من89.
وصفت لنا هنا تحليل يستند إلى الخلية كمياً تقييم امتصاص تاو طريق microglia بهدف إنشاء أداة الفحص لوصف أفضل آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة.
هذا التحليل، مقتبس من فونك et al. 11، يستخدم خلايا بي-2، وخلايا microglial مورين مخلدة. في حين أنها لا يمكن مقارنة تماما لخلايا microglial الأولية، تمتاز بالعديد من خصائص microglia الأولية، بما في ذلك القدرة قوة phagocytose Aβ وتأو ييفات11،،من1617 ،،من1819. وعلاوة على ذلك، أظهرت أنهم من سلوك استنساخه في المختبر مما جعلها مناسبة جداً لتطوير التحليل والدراسات الكمية، التي تتطلب الحد الأدنى من تقلب التجريبية. إلى جانب هذا، خطوط الخلايا مخلدة تسمح أعلى تحليل الإنتاجية والقضاء على الحاجة إلى التضحية الحيوانية مقارنة باستخدام microglia الأولية.
تم الحصول على المجاميع تاو استخدمنا في هذا التحليل استخدام استنساخه بدرجة عالية في المختبر تجميع الإجراء علينا وصف مؤخرا13، وإظهار مورفولوجيا مماثلة لإقران خيوط حلزونية (ففس) المعزولة من العقول للإعلان المرضى. في حين أننا لم تلاحظ أية نتائج غير متوقعة التي قد يكون ناجماً عن تاو المجاميع التمسك بالأسطح البلاستيكية أو الزجاجية، استخدام المجاميع تاو مستقرة وتتسم أيضا دوراً حاسما في إمكانية تكرار نتائج لهذا التحليل.
وكان الجانب الآخر الذي ساهم مساهمة كبيرة في إمكانية تكرار نتائج الاعتداء كثافة الخلية. تمثل أرقام الخلايا كل بئر الموصوفة في البروتوكول كثافة الخلية الأمثل في الظروف الموصوفة.
بشكل مختلف عن ما فونك et al. 11 الموصوفة، نحن المسمى tau المجاميع مع صبغة حساسة الأس الهيدروجيني مما يزيد بشكل ملحوظ الأسفار عند التدخيل في العضيات الحمضية، مما يسمح للقياس الكمي داخل الخلايا. هذا، جنبا إلى جنب مع التربسين هضم سطح ملزمة إيمونوكومبليكسيس و/أو تاو، الضمانات إشارة الأسفار التي تقاس بالتدفق الخلوي هو نتيجة لامتصاص تاو بدلاً من الربط إلى السطح الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتطلب استخدام يخفف صبغة حساسة الأس الهيدروجيني الكشف عن المجاميع تاو المدخلة في تجارب الفحص المجهري دون الحاجة إلى هضم سطح ملزمة إيمونوكومبليكسيس/تاو المجاميع التي سوف ثم إعادة طلاء الخلية والانتعاش.
ونحن أيضا زيادة الأمثل القراءة مجهرية من أعمالنا المقايسة، مقارنة بما قد سبق وصف11، باستخدام صبغة انتقائية للغاية العضيات الحمضية في تجاربنا الفحص المجهري الذي يسمح لنا ليس فقط لتأكيد جسم بوساطة امتصاص تاو، ولكن أيضا التعريب المجاميع تاو في حجرة اندوليسوسومال.
وقد المقايسة وضعنا، التحديد الأمثل الذي ينتج في نافذة تجريبية جيدة مما يتيح فصل قوي بين نماذج إيجابية وسلبية. من المثير للاهتمام، يكشف الفحص غير مباشر الاختلافات في تقارب الأجسام المضادة وبالتالي تمثل أداة قوية لدراسة وظائف المستجيب تاو المضادة الأجسام المضادة.
The authors have nothing to disclose.
نود أن أشكر ألبرتو كاربينتيرو سواريس له مساعدة تقنية قيمة.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |