Summary
Hier beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening waarin geaggregeerde tau en amyloïde eiwitten zich ophopen in de hersenen waardoor neuronale dysfunctie, die uiteindelijk tot cognitieve achteruitgang leidt. Hyperphosphorylated tau aggregaten in het neuron worden verondersteld te veroorzaken de meeste van de pathologie AD is gekoppeld. Deze aggregaten zijn verondersteld worden vrijgegeven in de extracellulaire compartiment en in beslag genomen door aangrenzende gezonde neuronen waar ze induceren verder tau aggregatie. Deze "prion-achtige" verspreiding kan worden onderbroken door antilichamen bindende en extracellulaire tau aggregaten zoals in preklinische Muismodellen van advertentie te "neutraliseren" staat. Een van de voorgestelde mechanismen waarop therapeutische antistoffen pathologie verminderen is antilichaam-gemedieerde opname en de ontmijning van pathologische geaggregeerde vormen van tau door microglia. Hier beschrijven we een kwantitatieve cel-gebaseerde test om te beoordelen tau opname door microglia. Deze test maakt gebruik van de muis microglial cellijn BV-2, zorgt voor een hoge specificiteit, lage variabiliteit en middellange doorvoer. Gegevens die zijn gegenereerd met deze test kan bijdragen tot een betere karakterisering van anti-tau antilichaam effector functies.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening gekenmerkt door de conformationele verandering en zelf-assemblage van β amyloïde peptide en tau-eiwit in pathologische aggregaten. De normale oplosbare amyloïde β-peptide wordt omgezet in oligomere en fibrillar amyloïde β, terwijl abnormaal gefosforyleerd tau als oligomeren en neurofibrillary klitten1,2 accumuleert. Deze eiwit-aggregaten veroorzaken neuronale dood leiden tot geheugenverlies en latere progressieve cognitieve daling. Andere factoren, met inbegrip van niet-productieve neuroinflammation en een verminderde capaciteit om te misfolded eiwitten, duidelijk kunnen verergeren en versnellen van de ziekte. Momenteel interventiestrategieën tegen AD grotendeels symptomatische verlichting geven, maar er is geen ziekte-aanpassen genezen of voorkomen.
Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert een sleutelrol van hyperphosphorylated tau aggregaten in de pathologie van AD. In de niet-pathologische toestand is tau een native ongevouwen eiwit dat bindt aan microtubuli en bevordert hun vergadering in de neuronale cytoskelet. Tau zodra hyperphosphorylated, het losgekoppeld van het cytoskelet en clusters in tau aggregaten in het neuron, die worden verondersteld te veroorzaken de meeste van de pathologie AD3is gekoppeld. Geaggregeerde tau begint eerst intracellulair accumuleren, maar naarmate de ziekte vordert, wordt uitgegaan van vrijgesteld van getroffen neuronen in de extracellulaire ruimte, waaruit het kan worden overgenomen door aangrenzende of synaptically verbonden gezonde neuronen in een " prion-achtige wijze". Eenmaal geïnternaliseerd, induceert de tau aggregaat verdere tau aggregatie via templated conformationele verandering4.
Volgens deze hypothese, kunnen therapieën kunnen onderbreken tau zaaien vertragen of omkeren van het verloop van tau-gemedieerde neurodegeneratieve ziekten. Ter ondersteuning van dit Toon muizen vatbaar voor tauopathy gemaakt door genetische mutatie en passief ingespoten met anti-tau antilichamen minder tau pathologie en verbeterde cognitieve functie5,6,7,8 ,9. De mechanismen waarmee therapeutische antistoffen pathologie verminderen blijven echter nog steeds ongrijpbaar.
Een van de voorgestelde mechanismen is antilichaam-gemedieerde opname en de ontmijning van pathologische geaggregeerde vormen van tau door microglia, de resident immuuncellen van de hersenen. Recente publicaties suggereren dat microglia kan efficiënt internaliseren en degraderen pathologische tau soorten en dit vermogen wordt versterkt door anti-tau antilichamen via een Fc-afhankelijk mechanisme waarbij Fc receptoren uitgedrukt op het oppervlak van Microglia en receptor gemedieerde fagocytose10,11. Deze gegevens identificeren microglia als potentieel belangrijke effectoren van therapeutische antistoffen.
Hierin beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia. Gegevens die zijn gegenereerd met deze test kunnen helpen ophelderen van de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen dus vertegenwoordigen een nuttig instrument om anti-tau antilichamen naar verdere stappen van hun ontwikkeling als potentiële AD behandeling.
Protocol
1. BV-2 cellen cultuur
Opmerking: Handvat BV-2 cellen onder insluiting van bioveiligheid niveau 2. De BV-2 cellijn produceert een omhuld recombinante ecotropic retrovirus (staat alleen lymfkliertest cellen infecteren)12; deze virussen zijn gekend voor hun in vitro transformeren vermogen en in vivo tumorigene potentieel.
- Cultuur BV-2 cellen in hoge glucose Dulbecco bewerkt eagle medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM L-Glutamine (hierna aangeduid als kweken medium voortaan) door het zaaien van de cellen op de 4 x 104 cellen/mL.
- Handhaven van culturen in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.
Opmerking: de cellen groeien losjes verbonden en in suspensie.
2. label recombinante Tau aggregaten met pH-gevoelige fluorescente kleurstof
Opmerking: Tau aggregaten waren voorbereid zoals beschreven in Apetri et al. 13 met het verschil dat er geen Thioflavin T (ThT) werd toegevoegd aan de buffer van de reactie. Geaggregeerde monsters werden verzameld in 1,5 mL centrifuge buizen. Definitieve fluorescentie signaal werd gecontroleerd door het mengen van 118 µL van het monster zwembad met 12 µL van een 50 µM ThT oplossing. Aggregaten werden gescheiden door centrifugering van het reactiemengsel aggregatie bij 20.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie werd geanalyseerd door SEC-MALS te bevestigen dat alle het monomeer tau werd omgebouwd tot aggregaten. Pellets (tau aggregaten) waren module bevroren en opgeslagen in een diepvriezer op-80 ° C.
- Resuspendeer tau aggregaten in 0,1 M natriumbicarbonaat buffer (NaHCO3) bij een pH 8,5 tot een concentratie van 1 mg/mL (~ 20 µM).
Opmerking: Concentratie van tau aggregaten is gebaseerd op de oorspronkelijke monomeren concentratie zoals beoordeeld door de absorptie van tau monomeren op 280 nm met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 0.31 mLmg-1cm-1. - Bewerk ultrasone trillingen ten de geresuspendeerde aggregaten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs te vermijden oververhit.
- Gebruik een amplitude van 65% (met ultrasoonapparaat van macht 250 W).
- Uitvoeren van 8 pulsen van 3 s met pauzes van 15 s tussen peulvruchten te voorkomen oververhitting.
- Bereiden een 8.9 mM stockoplossing van pH-gevoelige kleurstof (voortaan verwijzing naar als pH kleurstof) in dimethylsulfoxide (DMSO) volgens instructies van de fabrikant.
Opmerking: Altijd bereid een vers-oplossing en gebruik het alleen op de dag dat zij bereid is. - 10 mol kleurstof per mol van eiwit toevoegen aan een definitieve kleurstof concentratie van 0,2 mM.
- Meng door zachtjes op en neer pipetteren.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 45 – 60 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- In de tussentijd, monteren een kruislings gekoppelde dextran gel ontzouten kolom volgens de instructies van de fabrikant.
- De kolom met 25 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO equilibreer. Gooi de stroom door.
- Het product van de tau aggregaat labeling reactie op de kolom in een totaal volume van 2.5 mL toevoegen. Als het monster minder dan 2,5 mL is, voeg toe buffer tot een totaal volume van 2.5 mL wordt bereikt.
- Laat het monster volledig invoeren van het verpakte gel, negeren de doorstroming.
- Elueer met 3,5 mL 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 met 3% DMSO en verzamelen van het eluaat in 4 gelijkwaardige breuken in 2 mL tubes.
- Bepalen eiwit concentraties van de 4 breuken door bicinchoninic zuur (BCA) assay.
- De gelabelde proteïne in een vriezer van-20 ° C worden opgeslagen.
3. opname Assay met fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS) uitlezing
-
Dag 1 – zaad de cellen
- Wash BV-2 cellen in de kolf doordat kweken van middellange en toevoegen 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: Wassen volume zal variëren afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, wassen met 10 mL 1 x PBS. - Verwijderen van PBS van de kolf en losmaken van cellen door broeden met trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 0,05% bij 37 ° C en 5% CO2 , totdat de cellen van de kolf (ongeveer 5 min loskoppelen).
Opmerking: Volume van trypsine-EDTA 0,05% afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 2 mL trypsine-EDTA 0,05%. - Resuspendeer de cellen in het kweken van medium door pipetteren boven en beneden drie tot vijf keer.
Opmerking: Volume van medium kweken is afhankelijk van de grootte van de cel kolf gebruikt en dus het totale aantal cellen in de kolf. Bijvoorbeeld, voor een T175 kolf, gebruik 8 mL medium kweken. - Cellen tellen en maak een celsuspensie met een eindconcentratie van 1 x 105 cellen/mL in kweekmedium dat 200 μg/mL heparine.
- Plaat 250 µL celsuspensie (2.5 x 104 cellen) per putje in een 96-Wells weefselkweek platte bodemplaat.
- Incubeer plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
- Wash BV-2 cellen in de kolf doordat kweken van middellange en toevoegen 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
-
Dag 1 – voorbereiding Immunocomplexes
- Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs.
- Bereiden 65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in serumvrij medium (SFM) (hoge glucose DMEM aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 200 µg/mL van heparine).
- Maak de verdunningen van het antilichaam in 65 µl van SFM en bij een concentratie dubbele degene definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C.
-
Dag 2 – Immunocomplexes opname
- Verwijder kweken medium uit BV-2 cellen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS.
- Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder het medium van de incubatie van de cellen en verwerpen. Wassen cellen eens met 100 µL kamertemperatuur 1 x PBS.
- 1 x PBS verwijderen en behandelen van cellen met 50 µL trypsine-EDTA 0,25% gedurende 20 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Voeg 200 µL van kweken medium en resuspendeer goed door pipetteren omhoog en omlaag als u wilt loskoppelen van de cellen. Cellen overbrengen in een 96-Wells U-bodem plaat. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Zet de plaat in de ijskast, verwijder kweken van middellange en wassen cellen tweemaal door het resuspending van de cel pellets in 150 µL ijs koud 1 x PBS. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Cellen zetten ijs, toegevoegde 1 x PBS en wassen hen door resuspending pellets in 150 µL koude FACS buffer (1 x PBS, 0,5% bovien serumalbumine (BSA), 2 mM EDTA) cellen verwijderen. Centrifuge plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Cellen op ijs zet, verwijderen van toegevoegde FACS buffer en resuspendeer de cellen in 200 µL koude FACS buffer.
- Analyseren van monsters onmiddellijk door FACS verwerven van 2 x 104 gebeurtenissen in de levende cellen poort (zie stap 4.1).
4. FACS analyse
Nota: Verwijs naar Figuur 1 voor de gating strategie.
- Met behulp van de voorwaartse scatter-gebied (FSC-A) versus kant gebied (WS-A) dichtheid scatterplot, gate op levende cellen door met uitzondering van evenementen met lagere niveaus van de voorwaartse scatter (dat wil zeggen, vuil en dode cellen).
- Binnen de levende cel bevolking, gebruik FSC-A tegenover doorsturen scatter hoogte (FSC-H) mobiele paren en aggregaten uit te sluiten. Dit is de singlet-poort.
- Met de gebeurtenissen in de singlet-poort, genereren een pH kleurstof enkele parameter histogram.
- Bepalen gemiddelde fluorescentie intensiteit. Vast percentage pH kleurstof-tau positieve cellen door met uitzondering van de negatieve cellen als bepaald met behulp van het enige besturingselement BV-2.
5. Immunocomplexes opname met microscopie uitlezing
-
Dag 1 – zaad de cellen
- Bereiden BV-2 cellen zoals beschreven in stappen 3.1.1, 3.1.2 en 3.1.3.
- Cellen tellen en resuspendeer hen in het kweken van middellange tot een eindconcentratie van 104 cellen/mL.
- Plaat met 150 µL celsuspensie (1,5 x 103) per putje in een poly-D-Lysine gecoat 96-Wells zwarte plaat met duidelijke vlakke bodem.
- Incubeer plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
-
Dag 3 – opstellen Immunocomplexes
Opmerking: Milde ultrasoonapparaat van gelabelde tau aggregaten vóór incubatie met antilichaam, werd uitgevoerd ter verbetering van de resultaten van de microscopie.- Ontdooi pH kleurstof-tau op ijs en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een sonde ultrasoonapparaat terwijl op ijs. Gebruik een amplitude van 15% (ultrasoonapparaat kracht van 250 W). Uitvoeren van 30 pulsen van 2 s en wacht 20 s tussen pulsen.
- 65 μl per voorwaarde van een 500 nM oplossing van pH kleurstof-tau aggregaten in SFM voor te bereiden.
- Verdunde antilichamen in 65 µl van SFM tot een concentratie dubbele definitieve. Meng pH kleurstof-tau aggregaten en antilichamen in een 96-Wells u-bodemplaat. Eindvolume per voorwaarde is nu 130 µl en de pH kleurstof-tau aggregaten concentratie is 250 nM. Afdichting van de plaat verdunning en uit te broeden over nacht bij 37 ° C.
- Medium uit cel plaat verwijderen en vervangen met 150 µL van kweken medium aangevuld met 200 µg/mL heparine. Incubeer plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
-
Dag 4-Immunocomplexes opname
- Kweken medium verwijderen uit de BV-2 cellen. Breng 125 µL van immunocomplexes aan de cellen met behulp van een meerkanaalspipet.
- Incubeer de cellen met de immunocomplexes gedurende 1 uur en 45 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
Vlek celkernen met DNA-specifieke kleurstof en zure organellen met een sonde die selectief lage pH cellulaire compartimenten vlekken. Incubeer de cellen 15 min bij 37 ° C met 5% CO2.
Opmerking: Verdun de kleurstoffen in SFM. - Live-cel beeldvorming met behulp van een hoog gehalte screening confocal systeem uitvoeren Temperatuur ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Voor afbeeldingen van hoge kwaliteit, gebruik een 63 X water onderdompeling doelstelling en verwerven van 0,5 µm vliegtuigen (20 per Z-stack) per verbeelde veld.
Representative Results
Geaggregeerde recombinante tau werd covalent bestempeld met een pH-gevoelige groene kleurstof. Deze kleurstof verhoogt drastisch de fluorescentie bij de internalisering in zure organellen, waardoor voor intracellulaire kwantificering. Gelabelde tau aggregaten werden geïncubeerd met anti-tau monoklonale antilichamen. In het bijzonder, we gebruikten een chimeer versie (muis IgG1 Fc regio) van CBTAU-28.1. Deze menselijke antilichamen bindt aan de N-terminale invoegen regio van tau en vermag binden in vitro gegenereerd tau fibrillen13. In deze test, wij ook een affiniteit-verbeterde versie van CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1 getest. Fab fragmenten van CBTAU-28.1, in de ouderlijke en hoge-affiniteit mutant opmaken en een muis IgG1 isotype controle werden gebruikt als besturingselementen.
BV-2 cellen werden geïncubeerd met de pre-gevormde immunocomplexes of geaggregeerde tau alleen voor twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke tau opname. Na incubatie cellen waren trypsinized om te verwijderen het tau gebonden aan de extracellulaire membraan en werden geanalyseerd voor tau opname door stroom cytometry. Zoals we onlangs13 beschreven, vastgesteld we hebben dat CBTAU-28.1 varianten bevorderd opname voor tau in BV-2 cellen op een dosis-afhankelijke manier. De opname was Fc gemedieerde aangezien CBTAU-28.1 Fab-fragmenten niet basale tau opname (Figuur 2 verhogen). Bovendien, het hoge affiniteit dmCBTAU-28.1 antilichaam gemedieerde tau opname in BV-2 cellen in hogere mate dan het wild-type antilichaam (Figuur 2).
Antilichaam-gemedieerde tau opname- en lokalisatie van tau aggregaten in het compartiment van de endolysosomal werd bevestigd door confocale microscopie (Figuur 3) waar de zure cellulaire compartiment was gekleurd met behulp van een sonde selectieve voor lage pH organellen. Intracellulaire puncta van groene pH kleurstof label tau aggregaten werden waargenomen in de cellen die werden geïncubeerd met CBTAU-28.1. Bovendien, intracellulaire tau aggregaten vaak colocalized met de lage pH compartiment selectieve rode kleurstof zo suggereren aanwezigheid van tau aggregaten in de zure organellen. CBTAU-28.1 Fab-fragmenten verhogen niet tau opname nogmaals wordt gemeld een Fc-receptor gemedieerde internalisering mechanisme (Figuur 3).
Figuur 1: Gating strategie gebruikt in stroom cytometry analyse te detecteren tau internalisering door BV-2 cellen. Voorbeeld van gegevens uit BV-2 enige besturingselement (A-C), isotype controle (D-F) en dmCBTAU-28.1 (G-ik) worden weergegeven. BV-2-celpopulatie was omheinde op een perceel van FSC-A vs SSC-A dichtheid met uitzondering van puin en dode cellen (A, D, G). BV-2 cellen werden vervolgens verder omheinde op een perceel van FSC-A vs FSC-H dichtheid cel paren en aggregaten (B, E, H) te sluiten. Eencellige poort werd gebruikt voor het genereren van een pH kleurstof (FITC in deze representatieve resultaten) enkele parameter histogram (C, F, ik) en meetkundige gemiddelde fluorescentie intensiteit bepalen. Als alternatief, percentage pH kleurstof-tau positieve cellen werd berekend exclusief negatieve cellen zoals bepaald met behulp van het enige besturingselement BV-2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: CBTAU-28.1 bemiddelt opname van tau aggregaten in microglial BV-2 cellen. Geaggregeerde recombinante tau was covalent geëtiketteerd met groene fluorescentie pH-gevoelige kleurstof en geïncubeerd met een Chimeer muis-versie van het menselijk antilichaam voor anti-tau CBTAU-28.1, haar affiniteit verbeterde formaat aan, dmCBTAU-28.1, de bijbehorende Fab fragmenten, een muis IgG1 isotype controle antilichaam of geen antilichaam (tau aggregaten alleen). Immunocomplexes werden vervolgens geïncubeerd met BV-2 cellen gedurende twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke tau opname. Verbreiding van immunocomplexes werd beoordeeld door stroom cytometry en uitgedrukt als het meetkundige gemiddelde (GM) van de intensiteit van de fluorescentie (A) of percentage voor tau positieve (tau +) cellen (B). Foutbalken in (A) geven de standaarddeviatie van twee onafhankelijke experimenten, terwijl b toont een honkslag experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Tau aggregaten zijn geïnternaliseerd door BV-2 cellen en lokaliseren in cellulaire zure organellen. Voorgevormde tau-antilichaam immunocomplexes werden gedurende twee uur in de aanwezigheid van heparine te blokkeren van antilichaam-onafhankelijke opname geïncubeerd met BV-2 cellen. Na incubatie werden kernen gekleurd met een DNA-specifieke blauwe kleurstof en de zure cellulaire compartiment met een lage pH compartiment selectieve rode kleurstof. Live-cel imaging geopenbaard intracellulaire puncta van gelabelde tau aggregaten (groen) binnen de cellen die werden geïncubeerd met CBTAU-28.1 en dmCBTAU-28.1, maar niet met het besturingselement isotype. Bovendien, intracellulaire tau aggregaten vaak colocalized met de rode kleurstof (geel) dus suggereren aanwezigheid van tau aggregaten in de zure cellulaire compartiment. CBTAU-28.1 Fab-fragmenten verhogen tau opname met vermelding van een mechanisme voor Fc-receptor gemedieerde internalisering niet. Afbeeldingen vertegenwoordigen projecties van de maximumlichtsterkte van een 20 vliegtuigen Z-stack (0,5 µm vliegtuigen) verworven met een 63 X water onderdompeling doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Microglia, de resident hersenen immune cellen, onlangs hebben geïdentificeerd als belangrijke spelers in de antilichaam-gemedieerde therapeutische benaderingen voor tauopathies10,11. Antilichaam-gemedieerde tau goedkeuring door microglia, samen met het blokkeren van de neuronale opname9, remming of destabilisering van13,14 van de vorming van de fibril en de ontmijning van intraneuronal fibrillen via de lysosomale traject15, kunnen allemaal bijdragen aan de doeltreffendheid van de anti-tau antilichaam waargenomen in muismodel van tauopathy5,6,7,8,9.
We beschreven hier een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.
Deze bepaling, van Funk et al. aangepast 11, gebruikt BV-2 cellen, die zijn vereeuwigd lymfkliertest microglial cellen. Terwijl ze niet volledig te vergelijken met primaire microglial cellen, ze beschikken over veel van de kenmerken van primaire microglia, met inbegrip van de mogelijkheid van robuust phagocytose Aβ zowel tau fibrillen11,16,17 ,18,19. Bovendien toonden ze een reproduceerbare gedrag in vitro waardoor ze zeer geschikt voor test ontwikkeling en kwantitatieve studies, waarvoor minimale experimentele variabiliteit. Naast dit, vereeuwigd cellijnen toestaan van hogere assay doorvoer en elimineren de noodzaak voor dierlijke offer ten opzichte van het gebruik van primaire microglia.
De aggregaten van de tau we in deze test gebruikten werden verkregen met behulp van de zeer reproduceerbaar in vitro aggregatie dat we onlangs beschreven procedure13, en Toon soortgelijk morfologie aan gekoppeld spiraalvormige filamenten (PHFs), geïsoleerd van de hersenen van AD patiënten. Terwijl we geen onverwachte resultaten die kunnen zijn veroorzaakt door tau aggregaten naleving van kunststof of glazen oppervlakken niet waarnemen deed, het gebruik van aggregaten van stabiele en goed gekarakteriseerd tau een cruciale rol gespeeld in de reproduceerbaarheid van deze test.
Een ander aspect dat aanzienlijk bijgedragen tot de reproduceerbaarheid assay was celdichtheid. Het aantal cellen per putje in het protocol beschreven vertegenwoordigen de optimale celdichtheid in de beschreven voorwaarden.
Anders dan wat Funk et al. 11 beschreven, we gelabeld tau aggregaten met een pH gevoelig kleurstof die aanzienlijk verhoogt de fluorescentie op internalisering in zure organellen, waardoor intracellulaire kwantificering. Dit, samen met de spijsvertering van de Trypsine van oppervlakte immunocomplexes en/of tau gebonden, garanties dat fluorescentie signaal gemeten door stroom cytometry is het resultaat van tau opname in plaats van binding aan het cellulaire oppervlak. Bovendien vereist het gebruik van een pH gevoelig kleurstof versnellingen detectie van verinnerlijkte tau aggregaten in microscopie experimenten zonder de behoefte aan het verteren van oppervlak gebonden immunocomplexes/tau aggregaten die zou dan cel opnieuw plating en herstel.
Wij ook verder geoptimaliseerd de uitlezing van de microscopie van onze assay, in vergelijking met wat al eerder beschreven11, met behulp van een zeer selectieve kleurstof voor zure organellen in onze microscopie experimenten waardoor ons niet alleen om te bevestigen antilichaam-gemedieerde tau opname, maar ook lokalisatie van tau aggregaten in het compartiment van de endolysosomal.
De bepaling die we ontwikkeld, heeft optimale specificiteit, wat resulteert in een goede experimentele venster waarmee een sterke scheiding tussen positieve en negatieve monsters. Interessant is dat de bepaling niet indirect verschillen in antilichaam affiniteit vertegenwoordigt dus een krachtig hulpmiddel om te studeren van anti-tau antilichaam effector functies worden ontdekt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij wil Alberto Carpinteiro Soares bedanken voor zijn waardevolle technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
- Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
- Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
- Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
- Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
- Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
- Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
- Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
- Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
- Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
- Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
- Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
- Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
- Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
- Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).
