Hier beschreiben wir eine zellbasierte Assays um Tau Aufnahme von Mikroglia mit dem Ziel der Schaffung einer investigational Tool besser zu charakterisieren, die Mechanismen der Wirkung von Anti-Tau-Antikörpern quantitativ zu bewerten.
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive Neurodegenerative Zustand, in dem aggregiert Tau und Amyloid Proteine im Gehirn verursacht neuronale Dysfunktion führt schließlich zu kognitiven Fähigkeiten zu sammeln. Hyperphosphoryliertem Tau Aggregate in der Nervenzelle werden geglaubt, um die meisten der Pathologie mit Anzeige verbundenen verursachen. Diese Aggregate sind davon ausgegangen, dass in den extrazellulären Raum abgegeben werden und von angrenzenden gesunden Neuronen wo induzieren sie weitere Tau Aggregation. Diese “Prion-Like” Verbreitung kann durch Antikörper in der Lage zu binden und “Neutralisierung” extrazelluläre Tau Aggregate wie in präklinischen Mausmodelle der AD unterbrochen werden. Eines der vorgeschlagenen Mechanismen mit denen therapeutische Antikörper Pathologie reduzieren ist Antikörper-vermittelte Aufnahme und Clearance von pathologischen aggregierten Formen der Tau von Mikroglia. Hier beschreiben wir eine quantitative zellbasierte Assays Tau Aufnahme von Mikroglia bewerten. Dieser Assay nutzt die Maus Mikroglia Zellinie BV-2, ermöglicht eine hohe Spezifität, geringe Variabilität und mittleren Durchsatz. Mit diesem Test gewonnenen Daten können zu eine bessere Charakterisierung der Antikörper Anti-Tau-Effektor-Funktionen beitragen.
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive Neurodegenerative Bedingung gekennzeichnet durch die Konformationsänderung und Selbstmontage von Amyloid-β-Peptid und Tau-Protein in pathologischen Aggregate. Das normale lösliche Amyloid-β-Peptid wird in Oligomere und fibrillären Amyloid β umgewandelt, während ungewöhnlich phosphorylierten Tau als Oligomere und neurofibrillären Verschlingungen1,2ansammelt. Diese Protein-Aggregate verursachen neuronalen Tod führt zu Gedächtnisverlust und anschließenden progressive kognitive Abnahme. Andere Faktoren, einschließlich nicht-produktiven Neuroinflammation und eine reduzierte Fähigkeit, fehlgefaltete Proteine zu löschen möglicherweise verschärfen und Krankheit zu beschleunigen. Derzeit, Interventionsstrategien gegen AD weitgehend symptomatische Linderung, aber es gibt keine Disease modifying Heilung oder Prävention.
Erhöhung der Beweis schlägt eine zentrale Rolle des hyperphosphoryliertem Tau Aggregate in der Pathologie des AD. In seinem nicht-pathologischen Zustand ist Tau ein nativ entfaltet Protein, bindet an die Mikrotubuli und fördert deren Montage in neuronalen Zytoskeletts. Wenn Tau hyperphosphoryliertem wird, trennt das Zellskelett und Cluster in Tau-Aggregate in der Nervenzelle, die geglaubt werden, dazu führen, dass die meisten der Pathologie AD3zugeordnet. Aggregiert Tau beginnt zuerst intrazellulär ansammeln, aber Fortschreiten der Krankheit, es wird angenommen, dass von betroffenen Neuronen in den Extrazellulärraum freigesetzt werden aus denen es durch angrenzende oder synaptisch verbunden gesunde Neuronen in aufgegriffen werden kann eine ” Prion-Manier”. Einmal verinnerlicht, induziert das Tau-Aggregat weitere Tau Aggregation über templated Konformationsänderung4.
Nach dieser Hypothese Therapien in der Lage, Tau Aussaat zu unterbrechen möglicherweise verlangsamen oder den Lauf der Tau-vermittelten Neurodegenerative Erkrankung umzukehren. Zu diesem zeigen Mäuse anfällig für Tauopathie durch genetische Mutation und passiv mit Anti-Tau-Antikörper injiziert reduzierte Tau Pathologie und verbesserte kognitive Funktion5,6,7,8 ,9. Die Mechanismen, mit denen therapeutische Antikörper Pathologie reduzieren, bleiben jedoch nach wie vor schwer.
Eines der vorgeschlagenen Mechanismen ist Antikörper-vermittelte Aufnahme und Clearance von pathologischen aggregierten Formen der Tau von Mikroglia, resident Immunzellen des Gehirns. Aktuelle Publikationen legen nahe, dass Mikroglia effizient verinnerlichen und pathologischen Tau Arten beeinträchtigen kann und diese Fähigkeit wird durch Anti-Tau-Antikörper über eine Fc-abhängigen Mechanismus mit Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche des ausgedrückt Mikroglia und Rezeptor vermittelt Phagozytose10,11. Diese Daten identifizieren Mikroglia als potentiell wichtige Effektoren von therapeutischen Antikörpern.
Wir beschreiben hier eine zellbasierte Assays um Tau Aufnahme von Mikroglia quantitativ zu bewerten. Mit diesem Test gewonnenen Daten helfen Aufklärung der Mechanismen der Wirkung von Anti-Tau-Antikörper, die stellvertretend für eines nützlichen Werkzeugs, um weitere Schritte ihrer Entwicklung als mögliche AD Behandlung Anti-Tau-Antikörper zu gelangen.
Mikroglia, der Wohnsitz des Gehirns Immunzellen, vor kurzem wurden als wichtige Akteure bei Antikörper-vermittelten Therapieansätze für Tauopathies10,11. Antikörper-vermittelten Tau Freigabe durch Mikroglia, zusammen mit Sperrung der neuronalen Aufnahme9, Hemmung oder Destabilisierung der Fibrille Bildung13,14 und Abstand der intraneuronal Fibrillen über die lysosomale Weg15, könnten alle die Antikörper Anti-Tau-Wirksamkeit beobachtet im Mausmodell der Tauopathie5,6,7,8,9beitragen.
Wir beschrieben hier eine zellbasierte Assays um Tau Aufnahme von Mikroglia mit dem Ziel der Schaffung einer investigational Tool besser zu charakterisieren, die Mechanismen der Wirkung von Anti-Tau-Antikörpern quantitativ zu bewerten.
Dieser Assay, adaptiert von Funk Et al. 11, verwendet BV-2 Zellen, die unsterblich murinen Mikroglia-Zellen sind. Während sie voll mit primären Mikroglia-Zellen verglichen werden können, verfügen viele der Eigenschaften des primären Mikroglia, einschließlich der Möglichkeit der robust phagozytieren Aβ und Tau Fibrillen11,16,17 ,18,19. Darüber hinaus zeigten sie ein reproduzierbares Verhalten in Vitro machte sie sehr gut geeignet für Assay-Entwicklung und quantitative Studien, die minimale experimentelle Variabilität erfordern. Neben diesem immortalisierte Zelllinien ermöglichen höhere Assay-Durchsatz und beseitigen die Notwendigkeit für Tieropfer gegenüber dem Einsatz von primären Mikroglia.
Die Tau-Aggregate, die wir in diesem Test verwendet wurden erhalten mit dem hoch reproduzierbare in-vitro- Aggregation Verfahren, dass wir vor kurzem beschrieben13und zeigen ähnliche Morphologie, spiralförmigen Filamente (PHFs) isoliert von Gehirnen von AD gepaart Patienten. Während wir keine unerwartete Ergebnisse beobachten, die durch Tau Aggregate Einhaltung Kunststoff oder Glas Oberflächen verursacht worden sein könnte, Rolle die Verwendung von stabilen und gut charakterisierten Tau Aggregate eine entscheidende in der Reproduzierbarkeit des Assays.
Ein weiterer Aspekt, der wesentlich dazu beigetragen, die Reproduzierbarkeit assay war Zelldichte. Die Zahl der Zellen pro Bohrloch im Protokoll beschrieben stellen die optimale Zelldichte in den beschriebenen Bedingungen.
Anders als das, was Funk Et al. 11 beschrieben, mit der Bezeichnung wir Tau-Aggregate mit einem pH empfindlichen Farbstoff, der deutlich erhöht seine Fluoreszenz auf Internalisierung in sauren Organellen, wodurch intrazelluläre Quantifizierung. Dies, zusammen mit Trypsin-Verdauung der Oberfläche gebunden, Immunocomplexes und/oder Tau, Garantien, dass Fluoreszenzsignal Durchflusszytometrie gemessen ist das Ergebnis der Tau Aufnahme anstatt Bindung an der zellularen Oberfläche. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von ein pH empfindlichen Farbstoff erleichtert Erkennung von verinnerlichten Tau Aggregate in Mikroskopie Experimente ohne die Notwendigkeit der Verdauung Oberfläche Immunocomplexes/Tau Aggregate gebunden, die dann würde Zelle neu Plattieren und Erholung.
Wir auch weiter optimiert das Mikroskopie-Auslesen von unserem Assay, im Vergleich zu den bisher beschriebenen11, mithilfe eines hochselektiven Farbstoffs für sauren Organellen in unseren Mikroskopie-Experimenten, die uns nicht erlaubt, nur um zu bestätigen, Antikörper-vermittelten Tau-Aufnahme, sondern auch Lokalisierung von Tau Aggregate im Fach Endolysosomal.
Der Test, den wir entwickelt haben, hat optimale Besonderheit, die Ergebnisse in eine gute experimentelle Fenster, so dass eine starke Trennung zwischen positiven und negativen Proben. Interessant ist, erkennt der Assay indirekt Unterschiede in der Antikörper-Affinität, die stellvertretend für eines mächtigen Werkzeugs um Antikörper Anti-Tau-Effektor-Funktionen zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Alberto Carpinteiro Soares für seine wertvolle technische Hilfe danken.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |