כאן נתאר וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.
מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת שבה מצטברים טאו ולצבור חלבונים עמילואיד במוח גורם בתפקוד עצביים, מה שמוביל בסופו של דבר ירידה קוגניטיבית. Hyperphosphorylated טאו אגרגטים הנוירון הם האמין כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה. אגרגטים אלה הניחו להשתחרר לתוך תא חוץ-תאית, נלקח על ידי נוירונים סמוכים בריא איפה הם זירוז נוסף צבירת טאו. זה מתפשט “פריון כמו” יכול שתיקטע על-ידי נוגדנים מסוגל מחייב “נטרול” טאו חוץ-תאית אגרגטים כמוצג במודלים פרה העכבר של המודעה. אחד מנגנוני המוצעת שבו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה. כאן, אנו מתארים כמותיים מבוססת תא הנועד להעריך טאו ספיגת מאת מיקרוגלייה. זה וזמינותו ישתמש בשורת תא microglial העכבר BV-2, מאפשר ירידה לפרטים גבוה, נמוך השתנות של תפוקה בינונית. נתונים שנוצרו עם assay זה יכול לתרום אפיון טוב יותר של פונקציות אפקטור נוגדן אנטי-טאו.
מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת המאופיינת על ידי השינוי הסתגלותי, הרכבה עצמית של חלבון עמילואיד β פפטיד, טאו לתוך אגרגטים פתולוגי. פפטיד נורמלי β עמילואיד מסיסים מומר β עמילואיד oligomeric ו- fibrillar, בעוד טאו phosphorylated בצורה חריגה מצטברת oligomers ואת הישבן neurofibrillary1,2. אלה אגרגטים חלבון לגרום מוות עצביים המוביל לאובדן זיכרון לאחר מכן ירידה קוגניטיבית מתקדמת. גורמים אחרים, כולל neuroinflammation לא פרודוקטיביים ויכולת מופחתת כדי לנקות חלבונים misfolded, עשוי להחריף ולהאיץ את המחלה. כיום, אסטרטגיות התערבות נגד לספירה לספק הקלה סימפטומטי במידה רבה, אבל אין מחלות שינוי תרופה או מניעה.
הוכחה גוברת מרמזת על תפקיד מפתח של hyperphosphorylated טאו אגרגטים הפתולוגיה של המודעה. במצב שאינם פתולוגיים, טאו הוא מקורי פרש חלבון נקשר microtubules ומקדם את ההרכבה שלהם לתוך שלד התא עצביים. כאשר טאו הופך hyperphosphorylated, הוא מתנתק מן שלד התא, אשכולות לתוך אגרגטים טאו הנוירון, שלפי הסברה כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה3. המצטברים טאו מתחיל לצבור קודם intracellularly, אבל התקדמות המחלה, ההנחה היא להשתחרר מן הנוירונים המושפעת לחלל חוץ-תאית, שממנו זה שאפשר לקחת על ידי נוירונים בריא סמוכות או synaptically מחוברים ב ” פריון, כמו אופן”. ברגע הפנימו, טאו שסך כל גורם נוסף טאו צבירה באמצעות שינוי בתבניות הסתגלותי4.
על פי השערה זו, טיפולים מסוגל להפריע טאו זריעה עלול להאט או להפוך את הקורס של מחלות ניווניות בתיווך טאו. לתמיכה, להראות עכברים רגישים tauopathy מתוצרת מוטציה גנטית והזריקו פסיבי נוגדנים אנטי-טאו טאו מופחתת פתולוגיה ו פונקציה קוגניטיבית משופרת5,6,7,8 ,9. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה. עדיין נשארים חמקמקים.
אחד המנגנונים המוצע הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח. פרסומים אחרונים מראים כי מיקרוגלייה יכול ביעילות להפנים לבזות את טאו פתולוגיים מינים, יכולת זו מועצמת על ידי נוגדנים אנטי-טאו ויה תלויי-Fc מנגנון מעורבים קולטנים Fc באה לידי ביטוי על פני השטח של מיקרוגלייה, קולטן בתיווך מצרי phagocytosis10,11. נתונים אלה לזהות מיקרוגלייה effectors פוטנציאל חשוב של נוגדנים טיפולית.
נתאר בזאת וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה. נתונים שנוצרו עם assay הזה יכול לעזור שחקרתי את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו ובכך מייצג כלי שימושי כדי להתקדם נוגדנים אנטי-טאו נוספת שלבי התפתחותם כטיפול לספירה פוטנציאליים.
מיקרוגלייה, תאי מערכת החיסון של המוח תושב, זוהו לאחרונה כמו שחקנים חשוב בתיווך נוגדנים גישות טיפוליות עבור10,tauopathies11. טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה, יחד עם חסימת ספיגת עצביים9, עיכוב או הקשורה fibril היווצרות13,14 ואישור של הסיבים intraneuronal ויה lysosomal מסלול15, אולי כל מה לתרום היעילות נוגדן אנטי-טאו נצפתה במודל עכבר של tauopathy5,6,7,8,9.
אנו המתואר כאן וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.
זה וזמינותו, מ פאנק. et al. 11, משתמשת BV-2 תאים, אשר הם תאים מונצחים מאתר microglial. בעוד הם לחלוטין שלא להתפלא לתאים microglial העיקרי, הם כוללים רבים של מאפייני מיקרוגלייה הראשי, כולל את היכולת של robustly phagocytose Aβ וגם טאו הסיבים11,16,17 ,18,19. יתר על כן, הם הראו על התנהגות לשחזור במבחנה שהפך אותם המתאים מאוד לצרכי assay ופיתוח מחקרים כמותיים, אשר דורשים השתנות ניסיוני מינימלי. לצד זה, שורות תאים מונצחים מאפשרות תפוקה גבוהה יותר assay, לבטל את הצורך להקריב חיה לעומת השימוש מיקרוגלייה העיקרי.
מצרפי טאו שהשתמשנו ב- assay זו התקבלו באמצעות מאוד לשחזור במבחנה צבירת ההליך כי אנו המתואר לאחרונהבת 13, ואת הצג המורפולוגיה דומה כדי לזווג חוטים לוליינית (PHFs) מבודד מן המוח של AD מטופלים. אמנם לא נתבונן כל תוצאה לא צפויה אולי נגרמו על-ידי דבקות אגרגטים טאו משטחי פלסטיק או זכוכית, השימוש של טאו טוב מאופיין ויציבה אגרגטים שיחק תפקיד מכריע הפארמצבטית של זה וזמינותו.
היבט נוסף שלא תרמה בצורה משמעותית assay הפארמצבטית הייתה צפיפות התאים. המספרים של תאים לכל באר תיאר בפרוטוקול מייצגים את צפיפות תא אופטימלית בתנאים המתוארים.
באופן שונה ממה הפאנק et al. 11 תיאר, אנחנו כאנטי אגרגטים טאו עם צבע רגיש pH אשר מגביר באופן משמעותי את זריחה על הפנמה של organelles חומצי, ובכך מאפשר על כימות תאיים. זה, יחד עם טריפסין העיכול של השטח מאוגדים immunocomplexes ו/או טאו, ערבויות שאותות פלורסצנטיות נמדדת cytometry זרימה הוא התוצאה של טאו ספיגת ולא מחייב השטח הסלולר. יתר על כן, השימוש מקל על צבען רגיש pH גילוי של טאו למביטה אגרגטים בניסויים מיקרוסקופ ללא צורך לעכל משטח מאוגד אגרגטים immunocomplexes/טאו אשר היה אז דורש תא ציפוי מחדש ושחזור.
אנחנו גם הלאה ממוטב את read-out מיקרוסקופיה של שלנו assay, לעומת מה שהיה בעבר תיאר11, באמצעות צבע סלקטיבי מאוד עבור organelles חומצי בניסויים שלנו-מיקרוסקופיה אשר אפשרה לנו לא רק כדי לאשר נוגדן בתיווך ספיגת טאו, אך גם לוקליזציה של טאו אגרגטים בתוך התא endolysosomal.
וזמינותו שפיתחנו, יש ירידה לפרטים אופטימלי אשר התוצאות בחלון ניסיוני טוב המאפשר הפרדה חזק בין דגימות חיוביות ושליליות. מעניין, וזמינותו בעקיפין מזהה הבדלים זיקה נוגדן ובכך מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד נוגדן אנטי-טאו אפקטור פונקציות.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות אלברטו Carpinteiro סוארש לסיוע טכני יקר שלו.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |