यहां हम एक सेल का वर्णन परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ के ऊपर का आकलन ।
अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative शर्त है जिसमें एग्रीगेटेड ताऊ और amyloid प्रोटीन मस्तिष्क में संचित होते हैं जिससे न्यूरॉन्स में शिथिलता आती है जो अंततः संज्ञानात्मक गिरावट की ओर ले जाती है. न्यूरॉन में Hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति का सबसे कारण माना जाता है । इन समुच्चय को extracellular डिब्बे में जारी किया और आसंन स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जहां वे आगे ताऊ एकत्रीकरण प्रेरित ग्रहण कर रहे हैं । इस “prion की तरह” फैल बाध्यकारी में सक्षम एंटीबॉडी द्वारा बाधित किया जा सकता है और “बेअसर” extracellular ताऊ समुच्चय के रूप में विज्ञापन के नैदानिक माउस मॉडल में दिखाया गया है । प्रस्तावित तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सीय एंटीबॉडी विकृति को कम करने का एक एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी है । यहां, हम एक मात्रात्मक कोशिका का वर्णन करने के लिए microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन परख आधारित है । यह परख माउस microglial सेल लाइन बी. वी.-2 का उपयोग करता है, उच्च विशिष्टता, कम परिवर्तनशीलता और मध्यम प्रवाह के लिए अनुमति देता है । इस परख के साथ उत्पंन डेटा विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों के एक बेहतर लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।
अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative हालत amyloid β पेप्टाइड और ताऊ प्रोटीन के रोग समुच्चय में गठन परिवर्तन और स्व-विधानसभा द्वारा विशेषता है । सामान्य घुलनशील amyloid β पेप्टाइड oligomeric और fibrillar amyloid β में कनवर्ट किया जाता है, जबकि असामान्य रूप से phosphorylated ताऊ oligomers और neurofibrillary पेचीदा1,2के रूप में जम जाता है । इन प्रोटीन समुच्चय कारण ंयूरॉन मौत स्मृति हानि और बाद में प्रगतिशील संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी । गैर-उत्पादक neuroinflammation और एक कम क्षमता वाले प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए, सहित अन्य कारकों, ख़राब हो सकता है और रोग में तेजी लाने के. वर्तमान में, विज्ञापन के खिलाफ हस्तक्षेप रणनीतियों मोटे तौर पर रोगसूचक राहत प्रदान करते हैं, लेकिन कोई बीमारी है-इलाज या रोकथाम को संशोधित ।
सबूत बढ़ाने से विज्ञापन की विकृति में hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय की एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है । अपने गैर रोग राज्य में, ताऊ एक देशी प्रोटीन है कि microtubules के लिए बांध और न्यूरॉन cytoskeleton में अपने विधानसभा को बढ़ावा देता है । जब ताऊ hyperphosphorylated हो जाता है, यह cytoskeleton और समूहों से अलग ंयूरॉन में ताऊ समुच्चय, जो3विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति के सबसे कारण माना जाता है । समुच्चय तौ पहले intracellularly जमा शुरू होता है, लेकिन के रूप में रोग की प्रगति, यह प्रभावित ंयूरॉंस से extracellular अंतरिक्ष में जारी किया है, जहां से यह एक में आसंन या synaptically जुड़ा स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जा सकता है माना जाता है ” prion तरह से “। एक बार आंतरिक रूप से, ताऊ समग्र टेंपलेट गठन परिवर्तन4 के माध्यम से आगे ताऊ एकत्रीकरण लाती है ।
इस परिकल्पना के अनुसार ताऊ सीडिंग में रूकावट डालने में सक्षम उपचारों से ताऊ-मध्यस्थ neurodegenerative रोग का पाठ्यक्रम धीमा या उल्टा हो सकता है । इस के समर्थन में, चूहों आनुवंशिक उत्परिवर्तन द्वारा tauopathy के लिए अतिसंवेदनशील और निष्क्रिय विरोधी ताऊ एंटीबॉडी दिखाने के साथ इंजेक्शन कम ताऊ पैथोलॉजी और बेहतर संज्ञानात्मक समारोह5,6,7,8 ,9. हालांकि, तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सकीय एंटीबॉडी कम विकृति अभी भी मायावी रहते हैं ।
प्रस्तावित तंत्रों में से एक है एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी, मस्तिष्क के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं. हाल के प्रकाशनों सुझाव है कि microglia कुशलतापूर्वक internalize और रोग ताऊ प्रजातियों को नीचा कर सकते है और इस क्षमता को एक एफसी पर निर्भर तंत्र के माध्यम से विरोधी ताऊ एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया एफसी रिसेप्टर्स की सतह पर व्यक्त शामिल microglia और रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis10,11. इन आंकड़ों चिकित्सीय एंटीबॉडी के संभावित महत्वपूर्ण प्रभाव के रूप में microglia की पहचान ।
हम वर्णन करवायी एक सेल परख के लिए मात्रात्मक microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन । इस परख के साथ उत्पंन डेटा elucidating विरोधी की कार्रवाई के तंत्र-ताऊ एंटीबॉडी इस प्रकार एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए अग्रिम विरोधी ताऊ एंटीबॉडी संभावित विज्ञापन उपचार के रूप में उनके विकास के आगे कदम के लिए मदद कर सकते हैं ।
Microglia, निवासी है मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं, हाल ही में एंटीबॉडी में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में पहचान की गई है-tauopathies10,11के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण मध्यस्थता । एंटीबॉडी-मध्यस्थता ताऊ microglia द्वारा मंजूरी, एक साथ न्यूरॉन्स के ऊपर के अवरुद्ध के साथ9, अवरोध या फाइब्रिल गठन के स्थिरीकरण13,14 और तंतुओं के माध्यम से intraneuronal lysosomal की मंजूरी 15मार्ग, सभी विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभावकारिता में योगदान हो सकता है tauopathy5,6,7,8,9के माउस मॉडल में मनाया ।
हम यहां वर्णित एक सेल परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन ।
यह परख, दुर्गंध एट अल से अनुकूलित । 11, वी. बी.-2 कोशिकाओं का उपयोग करता है, जो murine microglial कोशिकाओं अमर हैं । जबकि वे पूरी तरह से प्राथमिक microglial कोशिकाओं की तुलना नहीं की जा सकती, वे प्राथमिक microglia की विशेषताओं के कई विशेषता, मजबूती phagocytose की क्षमता सहित दोनों Aβ और ताऊ तंतुओं11,16,17 ,18,19. इसके अलावा, वे इन विट्रो जो उंहें उच्च परख विकास और मात्रात्मक अध्ययन, जो ंयूनतम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की आवश्यकता के लिए उपयुक्त बनाया में एक reproducible व्यवहार दिखाया । इस के अलावा, अमर सेल लाइनों उच्च परख प्रवाह की अनुमति और प्राथमिक microglia के उपयोग की तुलना में पशु बलि के लिए जरूरत को खत्म ।
ताऊ समुच्चय हम इस परख में इस्तेमाल किया गया अत्यधिक reproducible इन विट्रो एकत्रीकरण प्रक्रिया है कि हम हाल ही में 13वर्णित का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे, और समान आकृति विज्ञान के लिए युग्मित पेचदार रेशा (PHFs) विज्ञापन के दिमाग से अलग दिखा रोगियों. जब तक हम किसी भी अप्रत्याशित परिणाम है कि ताऊ समुच्चय प्लास्टिक या कांच सतहों के लिए पालन की वजह से किया गया है पर गौर नहीं किया, स्थिर और अच्छी तरह से विशेषता ताऊ समुच्चय का उपयोग इस परख के reproducibility में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
एक अंय पहलू है कि काफी परख reproducibility में योगदान सेल घनत्व था । अच्छी तरह से प्रोटोकॉल में वर्णित प्रति कोशिकाओं की संख्या वर्णित स्थितियों में इष्टतम कोशिका घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
अलग से क्या दुर्गंध एट अल । 11 वर्णित है, हम एक पीएच संवेदनशील डाई जो काफी अंलीय organelles में internalization पर अपनी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, इस प्रकार intracellular ठहराव के लिए अनुमति के साथ ताऊ समुच्चय लेबल । यह, सतह बाध्य immunocomplexes और/या ताऊ के trypsin पाचन के साथ साथ, गारंटी देता है कि प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometry द्वारा मापा संकेत के बजाय सेलुलर सतह के लिए बाध्यकारी ताऊ का नतीजा है । इसके अलावा, एक पीएच संवेदनशील डाई का उपयोग सतह बंधे immunocomplexes/ताऊ समुच्चय जो तब सेल फिर से चढ़ाना और वसूली की आवश्यकता होती है पचाने की आवश्यकता के बिना सूक्ष्म प्रयोगों में आंतरिक ताऊ समुच्चय का पता लगाने में आसानी ।
हम भी आगे माइक्रोस्कोपी पढ़ने के लिए अनुकूलित हमारे परख के बाहर, जो पहले11वर्णित किया गया है की तुलना में, हमारे सूक्ष्म प्रयोगों में अंलीय organelles के लिए एक उच्च चयनात्मक डाई का उपयोग करके जो हमें न केवल एंटीबॉडी की पुष्टि करने के लिए मध्यस्थता की अनुमति दी ताऊ जी, लेकिन यह भी endolysosomal डिब्बे में ताऊ समुच्चय का स्थानीयकरण ।
परख हम विकसित की है, इष्टतम विशिष्टता है जो एक अच्छा प्रयोगात्मक सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच एक मजबूत जुदाई की अनुमति खिड़की में परिणाम है । दिलचस्प है, परख परोक्ष रूप से एंटीबॉडी संबंध में मतभेदों का पता लगाता है इस प्रकार एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों का अध्ययन ।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए अल्बर्टो Carpinteiro सोरेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |