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Neuroscience

सेल ने परख कर पढ़ाई एंटीबॉडी-मध्यस्थता करने वाले ताऊ को Microglia ने मंजूरी

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58576
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 3, 4, 3
1Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Belgium, 2Department of Hematopoiesis, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, The Netherlands, 3Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, The Netherlands, 4Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Pennsylvania

Summary

यहां हम एक सेल का वर्णन परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ के ऊपर का आकलन ।

Abstract

अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative शर्त है जिसमें एग्रीगेटेड ताऊ और amyloid प्रोटीन मस्तिष्क में संचित होते हैं जिससे न्यूरॉन्स में शिथिलता आती है जो अंततः संज्ञानात्मक गिरावट की ओर ले जाती है. न्यूरॉन में Hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति का सबसे कारण माना जाता है । इन समुच्चय को extracellular डिब्बे में जारी किया और आसंन स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जहां वे आगे ताऊ एकत्रीकरण प्रेरित ग्रहण कर रहे हैं । इस "prion की तरह" फैल बाध्यकारी में सक्षम एंटीबॉडी द्वारा बाधित किया जा सकता है और "बेअसर" extracellular ताऊ समुच्चय के रूप में विज्ञापन के नैदानिक माउस मॉडल में दिखाया गया है । प्रस्तावित तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सीय एंटीबॉडी विकृति को कम करने का एक एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी है । यहां, हम एक मात्रात्मक कोशिका का वर्णन करने के लिए microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन परख आधारित है । यह परख माउस microglial सेल लाइन बी. वी.-2 का उपयोग करता है, उच्च विशिष्टता, कम परिवर्तनशीलता और मध्यम प्रवाह के लिए अनुमति देता है । इस परख के साथ उत्पंन डेटा विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों के एक बेहतर लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।

Introduction

अल्जाइमर रोग (AD) एक प्रगतिशील neurodegenerative हालत amyloid β पेप्टाइड और ताऊ प्रोटीन के रोग समुच्चय में गठन परिवर्तन और स्व-विधानसभा द्वारा विशेषता है । सामान्य घुलनशील amyloid β पेप्टाइड oligomeric और fibrillar amyloid β में कनवर्ट किया जाता है, जबकि असामान्य रूप से phosphorylated ताऊ oligomers और neurofibrillary पेचीदा1,2के रूप में जम जाता है । इन प्रोटीन समुच्चय कारण ंयूरॉन मौत स्मृति हानि और बाद में प्रगतिशील संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी । गैर-उत्पादक neuroinflammation और एक कम क्षमता वाले प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए, सहित अन्य कारकों, ख़राब हो सकता है और रोग में तेजी लाने के. वर्तमान में, विज्ञापन के खिलाफ हस्तक्षेप रणनीतियों मोटे तौर पर रोगसूचक राहत प्रदान करते हैं, लेकिन कोई बीमारी है-इलाज या रोकथाम को संशोधित ।

सबूत बढ़ाने से विज्ञापन की विकृति में hyperphosphorylated ताऊ समुच्चय की एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है । अपने गैर रोग राज्य में, ताऊ एक देशी प्रोटीन है कि microtubules के लिए बांध और न्यूरॉन cytoskeleton में अपने विधानसभा को बढ़ावा देता है । जब ताऊ hyperphosphorylated हो जाता है, यह cytoskeleton और समूहों से अलग ंयूरॉन में ताऊ समुच्चय, जो3विज्ञापन के साथ जुड़े विकृति के सबसे कारण माना जाता है । समुच्चय तौ पहले intracellularly जमा शुरू होता है, लेकिन के रूप में रोग की प्रगति, यह प्रभावित ंयूरॉंस से extracellular अंतरिक्ष में जारी किया है, जहां से यह एक में आसंन या synaptically जुड़ा स्वस्थ ंयूरॉंस द्वारा लिया जा सकता है माना जाता है " prion तरह से "। एक बार आंतरिक रूप से, ताऊ समग्र टेंपलेट गठन परिवर्तन4 के माध्यम से आगे ताऊ एकत्रीकरण लाती है ।

इस परिकल्पना के अनुसार ताऊ सीडिंग में रूकावट डालने में सक्षम उपचारों से ताऊ-मध्यस्थ neurodegenerative रोग का पाठ्यक्रम धीमा या उल्टा हो सकता है । इस के समर्थन में, चूहों आनुवंशिक उत्परिवर्तन द्वारा tauopathy के लिए अतिसंवेदनशील और निष्क्रिय विरोधी ताऊ एंटीबॉडी दिखाने के साथ इंजेक्शन कम ताऊ पैथोलॉजी और बेहतर संज्ञानात्मक समारोह5,6,7,8 ,9. हालांकि, तंत्र है जिसके द्वारा चिकित्सकीय एंटीबॉडी कम विकृति अभी भी मायावी रहते हैं ।

प्रस्तावित तंत्रों में से एक है एंटीबॉडी-मध्यस्थता और microglia द्वारा ताऊ के रोग एकत्रित रूपों की मंजूरी, मस्तिष्क के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं. हाल के प्रकाशनों सुझाव है कि microglia कुशलतापूर्वक internalize और रोग ताऊ प्रजातियों को नीचा कर सकते है और इस क्षमता को एक एफसी पर निर्भर तंत्र के माध्यम से विरोधी ताऊ एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया एफसी रिसेप्टर्स की सतह पर व्यक्त शामिल microglia और रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis10,11. इन आंकड़ों चिकित्सीय एंटीबॉडी के संभावित महत्वपूर्ण प्रभाव के रूप में microglia की पहचान ।

हम वर्णन करवायी एक सेल परख के लिए मात्रात्मक microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन । इस परख के साथ उत्पंन डेटा elucidating विरोधी की कार्रवाई के तंत्र-ताऊ एंटीबॉडी इस प्रकार एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए अग्रिम विरोधी ताऊ एंटीबॉडी संभावित विज्ञापन उपचार के रूप में उनके विकास के आगे कदम के लिए मदद कर सकते हैं ।

Protocol

1. बी. वी.-2 कोशिकाओं संस्कृति

नोट: वी. बी.-2 कोशिकाओं को संभालें-सुरक्षा स्तर 2 रोकथाम । बी. वी.-2 सेल लाइन एक लिफाफा रिकॉमबिनेंट ecotropic retrovirus (केवल murine कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम)12का उत्पादन; इस तरह के वायरस अपने इन विट्रो में क्षमता को बदलने और vivo tumorigenic क्षमता के लिए जाना जाता है ।

  1. संस्कृति बी. वी.-उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 2 कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin और 2 मिमी एल-Glutamine (अब से संवर्धन माध्यम के रूप में संदर्भित) 4 x 10 4 पर कोशिकाओं बोने के द्वारा कोशिकाओं/
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के एक humidified वातावरण में संस्कृतियों का रखरखाव ।
    नोट: कोशिकाओं ढीला संलग्न और निलंबन में वृद्धि हुई है ।

पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ 2. Label रिकॉमबिनेंट तौ समुच्चय

नोट: ताऊ समुच्चय के रूप में Apetri एट अल में वर्णित तैयार थे । 13 अंतर के साथ कि कोई Thioflavin टी (थट) प्रतिक्रिया बफर करने के लिए जोड़ा गया था । एकत्रित नमूनों १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में एकत्र किए गए । फाइनल प्रतिदीप्ति सिग्नल को मिलाकर चेक किया गया ११८ µ l के साथ पूल सैम्पल की 12 µ l के साथ एक ५० µ मी थट सॉल्यूशन. समुच्चय 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए २०,००० x g पर एकत्रीकरण प्रतिक्रिया मिश्रण केंद्रापसारक द्वारा अलग किया गया । supernatant ने सेक-मलों का विश्लेषण कर यह पुष्टि की थी क सभी monomeric तौ को समुच्चय में बदल दिया गया था. छर्रों (ताऊ समुच्चय) स्नैप जमे हुए थे और एक फ्रीजर में-८० डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत ।

  1. ०.१ एम सोडियम बिकारबोनिट बफर (NaHCO3) पीएच ८.५ में 1 मिलीग्राम/एमएल (~ 20 µ एम) की एकाग्रता में ताऊ समुच्चय resuspend ।
    नोट: ताऊ समुच्चय की एकाग्रता २८० एनएम पर ताऊ मोनोमर के अवशोषण द्वारा मूल्यांकन के रूप में प्रारंभिक मोनोमर एकाग्रता पर आधारित है ०.३१ mLmg-1cm-1के एक विलुप्त गुणांक का उपयोग कर ।
  2. Sonicate resuspend समुच्चय एक जांच sonicator का उपयोग करते हुए बर्फ पर रखते हुए से अधिक ताप से बचने के लिए ।
    1. ६५% (पावर २५० W के sonicator के साथ) के एक आयाम का उपयोग करें ।
    2. overheating से बचने के लिए दालों के बीच 15 एस के pauses के साथ 3 एस के 8 दालों प्रदर्शन.
  3. एक ८.९ mM स्टॉक समाधान के लिए पीएच-संवेदी डाई (आगे के रूप में पीएच डाई के लिए संदर्भ) dimethyl sulfoxide (DMSO) में निर्माता के निर्देश के बाद तैयार करें ।
    नोट: हमेशा एक ताजा समाधान तैयार करने और इसे तैयार किया जाता है दिन पर ही इसका इस्तेमाल करते हैं ।
  4. ०.२ mM के एक अंतिम डाई एकाग्रता के लिए प्रोटीन के तिल प्रति डाई के 10 तिल जोड़ें ।
  5. मिश्रण धीरे से ऊपर और नीचे pipetting ।
  6. 45-कमरे के तापमान पर 60 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन ।
  7. इस बीच, निर्माता के निर्देशों के बाद एक क्रॉस-लिंक्ड dextran जेल साल्टिंग कॉलम को इकट्ठा करें ।
  8. Equilibrate ०.१ मीटर NaHCO3 बफर पीएच ८.५ के 25 मिलीलीटर के साथ कॉलम 3% DMSO युक्त । के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
  9. २.५ मिलीलीटर की कुल मात्रा में इस स्तंभ के लिए ताऊ समग्र लेबलिंग रिएक्शन के उत्पाद जोड़ें । नमूना २.५ मिलीलीटर से कम है, तो बफ़र २.५ मिलीलीटर की कुल मात्रा प्राप्त है जब तक जोड़ें ।
  10. नमूना पैक जेल पूरी तरह से प्रवेश करते हैं, प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  11. Elute की ३.५ मिलीलीटर के साथ ०.१ मीटर NaHCO3 बफर पीएच ८.५ 3% DMSO युक्त और 2 मिलीलीटर ट्यूबों में 4 समकक्ष भागों में eluate इकट्ठा ।
  12. bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा 4 भागों के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं ।
  13. एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लेबल प्रोटीन की दुकान ।

3. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) के साथ आगे की परख पढ़ें-आउट

  1. 1 दिन-बीज कोशिकाओं
    1. संवर्धन मीडियम निकालकर और 1x फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) को जोड़ने के द्वारा बी. वी.-2 कोशिकाओं को धो लें ।
      नोट: वॉशिंग वॉल्यूम सेल कुप्पी के आकार के आधार पर भिन्न होगा । उदाहरण के लिए, एक T175 कुप्पी के लिए, 1x पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    2. की कुप्पी से पंजाबियों निकालें और trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ३७ डिग्री सेल्सियस और 5%2 सह जब तक कोशिकाओं कुप्पी (लगभग 5 मिनट) से अलग से मशीन के साथ गर्मी से अलग कोशिकाओं ।
      नोट: trypsin की मात्रा-EDTA ०.०५% इस्तेमाल सेल कुप्पी के आकार पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, एक T175 कुप्पी के लिए, trypsin-EDTA ०.०५% की 2 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    3. संवर्धन माध्यम में कोशिकाओं को pipetting अप और तीन से पांच बार नीचे resuspend ।
      नोट: संवर्धन माध्यम की मात्रा इस्तेमाल किया सेल कुप्पी के आकार के आधार पर बदलता है और इस प्रकार कुप्पी में कोशिकाओं की कुल संख्या । उदाहरण के लिए, एक T175 कुप्पी के लिए, संवर्धन मध्यम के 8 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    4. कोशिकाओं की गणना और एक अंतिम एकाग्रता के साथ एक सेल निलंबन बनाने 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल युक्त संस्कृति माध्यम में २०० μg/एमएल हेपरिन ।
    5. प्लेट २५० सेल निलंबन के µ एल (२.५ x 104 कोशिकाओं) प्रति अच्छी तरह से एक ९६-ऊतक संस्कृति फ्लैट नीचे प्लेट में ।
    6. ३७ ° c और 5% सह2पर रात भर थाली मशीन ।
  2. दिन 1-तैयार Immunocomplexes
    1. गल पीएच डाई-ताऊ बर्फ पर ।
    2. एक ५०० एनएम के प्रति शर्त ६५ μl तैयार पीएच डाई-ताऊ समुच्चय के सीरम मुक्त माध्यम (SFM) में (उच्च ग्लूकोज DMEM १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin और २०० µ g/एमएल के साथ पूरक हेपरिन) ।
    3. SFM के ६५ µ एल में एंटीबॉडी कमजोरियां तैयार है और एक एकाग्रता पर अंतिम एक डबल । एक ९६-well u-नीचे थाली में पीएच डाई-ताऊ समुच्चय और एंटीबॉडी मिश्रण । प्रति शर्त अंतिम मात्रा अब १३० µ एल और पीएच डाई-ताऊ समुच्चय एकाग्रता २५० एनएम है । कमजोर पड़ने प्लेट सील और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी ।
  3. दिवस २ – Immunocomplexes
    1. वी. बी.-2 कोशिकाओं से संवर्धन मध्यम निकालें । १०० µ एल कमरे के तापमान 1x पंजाबियों के साथ एक बार धो कोशिकाओं ।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को immunocomplexes के १२५ µ एल स्थानांतरण । ३७ ° c और 5% CO 2 पर 2 h के लिए immunocomplexes के साथ कोशिकाओंकी मशीन ।
    3. कोशिकाओं से गर्मी मध्यम निकालें और इसे त्यागें । १०० µ एल कमरे के तापमान 1x पंजाबियों के साथ एक बार धो कोशिकाओं ।
    4. 1x पंजाबियों निकालें और ५० µ l trypsin-EDTA ०.२५% के साथ ३७ ° c और 5% सह 2 पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं का इलाज।
    5. संवर्धन माध्यम के २०० µ एल जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से resuspend । एक ९६-well U-नीचे थाली में स्थानांतरण कोशिकाओं । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर प्लेट केंद्रापसारक ।
    6. बर्फ पर प्लेट रखो, संवर्धन मध्यम और धो कोशिकाओं को दो बार १५० µ एल आइस कोल्ड 1x पंजाबियों में सेल छर्रों resuspend द्वारा निकालें । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर प्लेट केंद्रापसारक ।
    7. बर्फ पर कोशिकाओं रखो, जोड़ा 1x पंजाबियों को हटाने और १५० µ एल कोल्ड FACS बफर (1x पंजाब, ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 2 मिमी EDTA) में कोशिकाओं छर्रों resuspend द्वारा उंहें धो लो । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर प्लेट केंद्रापसारक ।
    8. बर्फ पर कोशिकाओं रखो, जोड़ा FACS बफर निकालें और २०० µ l शीत FACS बफर में कोशिकाओं resuspend ।
    9. FACS प्राप्त 2 x 104 लाइव कक्ष गेट में घटनाओं (४.१ कदम देखें) द्वारा तुरंत नमूने का विश्लेषण करें ।

4. FACS विश्लेषण

नोट: गेटिंग कार्यनीति के लिए चित्र 1 देखें.

  1. आगे तितर बितर क्षेत्र (FSC-a) बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (SSC-a) घनत्व साजिश, लाइव कोशिकाओं पर गेट कम आगे स्कैटर स्तर के साथ घटनाओं को छोड़कर द्वारा का उपयोग करना (यानी, मलबे और मृत कोशिकाओं).
  2. लाइव सेल जनसंख्या के भीतर, सेल दोहरी और समुच्चय को बाहर करने के लिए FSC-A बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई (FSC-H) का उपयोग करें । यह स्वेटर गेट है ।
  3. स्वेटर गेट में घटनाओं का उपयोग करना, एक पीएच डाई एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम उत्पन्न करते हैं.
  4. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण । बी. वी.-2 केवल नियंत्रण का उपयोग निर्धारित के रूप में नकारात्मक कोशिकाओं को छोड़कर द्वारा पीएच डाई-ताऊ सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें ।

5. माइक्रोस्कोप के साथ Immunocomplexes आगे पढ़ें-बाहर

  1. 1 दिन-बीज कोशिकाओं
    1. 3.1.1, 3.1.2 और 3.1.3 चरणों में वर्णित के रूप में बी. वी.-2 कोशिकाओं को तैयार ।
    2. कोशिकाओं गिनती और उन्हें संवर्धन माध्यम में 104 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए resuspend/
    3. प्लेट १५० सेल निलंबन के µ एल (१.५ x 103) प्रति अच्छी तरह से एक पाली में डी-Lysine लेपित ९६-स्पष्ट सपाट नीचे के साथ अच्छी तरह से काली प्लेट ।
    4. ३७ ° c और 5% सह2 पर थाली मशीन ४८ एच के लिए ।
  2. 3 दिन-तैयार Immunocomplexes
    नोट: एंटीबॉडी के साथ गर्मी से पहले बला ताऊ समुच्चय के हल्के sonication, सूक्ष्म परिणाम में सुधार करने के लिए प्रदर्शन किया गया था ।
    1. गल पीएच डाई-ताऊ बर्फ पर और बर्फ पर रखते हुए एक जांच sonicator का उपयोग sonicate । 15% (२५० W की sonicator पावर) के एक आयाम का उपयोग करें । 2 s के 30 दालों का प्रदर्शन करें और दालों के बीच 20 एस प्रतीक्षा करें ।
    2. SFM में पीएच डाई-ताऊ समुच्चय के एक ५०० एनएम समाधान के प्रति शर्त ६५ μl तैयार करें ।
    3. SFM के ६५ µ एल में एंटीबॉडी पतला करने के लिए एक एकाग्रता डबल अंतिम एक । एक ९६-well u-नीचे थाली में पीएच डाई-ताऊ समुच्चय और एंटीबॉडी मिश्रण । प्रति शर्त अंतिम मात्रा अब १३० µ एल और पीएच डाई-ताऊ समुच्चय एकाग्रता २५० एनएम है । कमजोर पड़ने प्लेट सील और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी ।
    4. सेल प्लेट से मध्यम निकालें और संवर्धन मध्यम २०० µ g/एमएल हेपरिन के साथ पूरक के १५० µ एल के साथ बदलें । ३७ ° c और 5% सह2पर रात भर थाली मशीन ।
  3. ४ दिवस – Immunocomplexes
    1. बी. वी.-2 कोशिकाओं से संवर्धन मध्यम निकालें । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को immunocomplexes के १२५ µ एल स्थानांतरण ।
    2. 5% CO2के साथ ३७ ° c में 1 ज और ४५ मिनट के लिए immunocomplexes के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
      दाग एक जांच जो चुनिंदा कम पीएच सेलुलर डिब्बों दाग के साथ डीएनए विशिष्ट डाई और अंलीय organelles के साथ सेल नाभिक । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं 15 मिनट मशीन ।
      नोट: SFM में रंजक पतला ।
    3. एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग फोकल प्रणाली का उपयोग कर लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन । ३७ ° c और 5% CO2के लिए तापमान सेट करें । उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के लिए, एक 63X जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें और imaged क्षेत्र प्रति ०.५ µm विमानों (जेड-स्टैक प्रति 20) का अधिग्रहण ।

Representative Results

कुल मिलाकर रिकॉमबिनेंट तौ एक पीएच के प्रति संवेदनशील ग्रीन डाई के साथ covalently बला था । यह डाई नाटकीय रूप से अम्लीय organelles में अपनी internalization पर अपनी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, जिससे intracellular ठहराव के लिए अनुमति देता है । लेबल ताऊ समुच्चय विरोधी ताऊ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ मशीन थे । विशेष रूप से, हम CBTAU-२८.१ के एक chimeric संस्करण (माउस IgG1 एफसी क्षेत्र) का उपयोग किया । यह मानव एंटीबॉडी ताऊ के एन-टर्मिनल सम्मिलित क्षेत्र को बाँधता है और इन विट्रो में उत्पन्न तौ तंतुओं१३को बाँधने में सक्षम है. इस परख में, हम भी एक संबंध का परीक्षण-CBTAU-२८.१-dmCBTAU-२८.१ के संस्करण में सुधार । CBTAU के फैब टुकड़े-२८.१, माता पिता और उच्च संबध उत्परिवर्ती प्रारूप में, और एक माउस IgG1 isotype नियंत्रण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

वी. बी.-2 कोशिकाओं को पहले से बनाई immunocomplexes या एकीकृत तौ अकेले हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-निर्दलीय ताऊ के रूप में । गर्मी के बाद, कोशिकाओं को extracellular झिल्ली से बंधे ताऊ को दूर trypsinized थे और ताऊ के लिए विश्लेषण किया गया था प्रवाह cytometry द्वारा तेज । जैसा कि हमने हाल ही में13का वर्णन किया है, हमने देखा कि CBTAU-२८.१ वेरिएंट ने एक खुराक-निर्भर तरीके से बी. वी.-2 कोशिकाओं में ताऊ की अधिकता को बढ़ावा दिया । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़ों में वृद्धि नहीं हुई बेसल के बाद से था एफसी मध्यस्थता ताऊ जी (चित्रा 2) । इसके अलावा, उच्च अपनत्व dmCBTAU-२८.१ एंटीबॉडी की मध्यस्थता ताऊ वी. बी.-2 कोशिकाओं में एक उच्च हद तक जंगली प्रकार एंटीबॉडी (चित्रा 2) की तुलना में ।

एंटीबॉडी-मध्यस्थता ताऊ तेज और ताऊ समुच्चय के स्थानीयकरण endolysosomal डिब्बे में फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) जहां अंलीय सेलुलर डिब्बे कम पीएच organelles के लिए एक जांच चयनात्मक का उपयोग दाग था द्वारा की पुष्टि की थी । Intracellular puncta ग्रीन पीएच डाई लेबल ताऊ समुच्चय CBTAU-२८.१ के साथ मशीन थे कि कोशिकाओं के अंदर मनाया गया । इसके अलावा, intracellular ताऊ समुच्चय अक्सर कम पीएच डिब्बे चयनात्मक लाल डाई इस प्रकार के अम्लीय organelles में ताऊ समुच्चय की उपस्थिति का सुझाव के साथ colocalized । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़े वृद्धि नहीं किया ताऊ फिर से एक एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता internalization तंत्र का संकेत (चित्रा 3).

Figure 1
चित्रा 1: वी. बी.-2 कोशिकाओं द्वारा ताऊ internalization का पता लगाने के लिए फ्लो cytometry एनालिसिस में गेटिंग स्ट्रैटेजी का इस्तेमाल किया । बी. वी.-2 से नमूना डेटा केवल नियंत्रण (ए सी), isotype नियंत्रण (डी एफ) और dmCBTAU-२८.१ (जी-I) दिखाया गया है । बी. वी.-2 सेल जनसंख्या एक FSC-ए बनाम एसएससी-मलबे और मृत कोशिकाओं को छोड़कर एक घनत्व भूखंड पर gated था (ए, डी, जी) । बी. वी.-2 कोशिकाओं को फिर आगे एक FSC-a बनाम FSC-एच घनत्व भूखंड पर सेल दोहरी और समुच्चय (ख, ई, एच) को बाहर करने के लिए gated थे । सिंगल सेल गेट एक पीएच डाई उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (इन प्रतिनिधि परिणामों में FITC) एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम (सी, एफ, आई) और ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण. वैकल्पिक रूप से, बी. ए.-2 केवल नियंत्रण का उपयोग करके निर्धारित के रूप में नकारात्मक कोशिकाओं को छोड़कर पीएच डाई-ताऊ सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: CBTAU-२८.१ microglial वी. बी.-2 कोशिकाओं में ताऊ समुच्चय की मध्यस्थता । एग्रीगेट रिकॉमबिनेंट तौ हरे प्रतिदीप्ति पीएच के साथ covalently लेबल था संवेदनशील डाई और मानव विरोधी के एक माउस chimeric संस्करण के साथ मशीन-ताऊ एंटीबॉडी CBTAU-२८.१, अपने अपनत्व में सुधार स्वरूप, dmCBTAU-२८.१, इसी फैब टुकड़े, एक माउस IgG1 isotype नियंत्रण एंटीबॉडी या कोई एंटीबॉडी (ताऊ समुच्चय अकेला) । Immunocomplexes बाद में बी. वी. के साथ-2 कोशिकाओं को हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-निर्दलीय ताऊ के साथ मशीन थे । immunocomplexes के तेज प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था और ज्यामितीय माध्य (जीएम) के रूप में व्यक्त की प्रतिदीप्ति तीव्रता (ए) या ताऊ का प्रतिशत सकारात्मक (ताऊ +) कोशिकाओं (बी). (a) में त्रुटि पट्टियां दो स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन को इंगित करती हैं, जबकि (B) एक एकल प्रयोग दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ताऊ समुच्चय वी के द्वारा आंतरिक है-2 कोशिकाओं और सेलुलर अंलीय organelles में information । पहिले ताऊ-एंटीबॉडी immunocomplexes वी. के.-2 कोशिकाओं के साथ हेपरिन की उपस्थिति में दो घंटे के लिए एंटीबॉडी-स्वतंत्र को रोकने के लिए मशीन थे । गर्मी के बाद, नाभिक एक डीएनए विशिष्ट नीले रंग और एक कम पीएच डिब्बे चयनात्मक लाल रंग के साथ अंलीय सेलुलर डिब्बे के साथ दाग थे । Live-सेल इमेजिंग से पता चला intracellular puncta के लेबल ताऊ समुच्चय (हरा) के अंदर कोशिकाओं है कि CBTAU-२८.१ और dmCBTAU-२८.१ के साथ मशीन थे, लेकिन isotype नियंत्रण के साथ नहीं है । इसके अलावा, intracellular ताऊ समुच्चय अक्सर लाल डाई (पीला) के साथ colocalized अम्लीय सेलुलर डिब्बे में ताऊ समुच्चय की उपस्थिति का सुझाव देते हैं । CBTAU-२८.१ फैब टुकड़े नहीं वृद्धि हुई ताऊ एक एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता internalization तंत्र का संकेत । छवियाँ एक 63X जल विसर्जन उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत एक 20 विमानों जेड-टैक (०.५ µm विमानों) के अधिकतम तीव्रता अनुमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

Microglia, निवासी है मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं, हाल ही में एंटीबॉडी में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में पहचान की गई है-tauopathies10,11के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण मध्यस्थता । एंटीबॉडी-मध्यस्थता ताऊ microglia द्वारा मंजूरी, एक साथ न्यूरॉन्स के ऊपर के अवरुद्ध के साथ9, अवरोध या फाइब्रिल गठन के स्थिरीकरण13,14 और तंतुओं के माध्यम से intraneuronal lysosomal की मंजूरी 15मार्ग, सभी विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभावकारिता में योगदान हो सकता है tauopathy5,6,7,8,9के माउस मॉडल में मनाया ।

हम यहां वर्णित एक सेल परख के लिए मात्रात्मक एक जांच उपकरण बनाने के लिए बेहतर विरोधी ताऊ एंटीबॉडी की कार्रवाई के तंत्र की विशेषता के साथ microglia द्वारा ताऊ जी का आकलन ।

यह परख, दुर्गंध एट अल से अनुकूलित । 11, वी. बी.-2 कोशिकाओं का उपयोग करता है, जो murine microglial कोशिकाओं अमर हैं । जबकि वे पूरी तरह से प्राथमिक microglial कोशिकाओं की तुलना नहीं की जा सकती, वे प्राथमिक microglia की विशेषताओं के कई विशेषता, मजबूती phagocytose की क्षमता सहित दोनों Aβ और ताऊ तंतुओं11,16,17 ,18,19. इसके अलावा, वे इन विट्रो जो उंहें उच्च परख विकास और मात्रात्मक अध्ययन, जो ंयूनतम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की आवश्यकता के लिए उपयुक्त बनाया में एक reproducible व्यवहार दिखाया । इस के अलावा, अमर सेल लाइनों उच्च परख प्रवाह की अनुमति और प्राथमिक microglia के उपयोग की तुलना में पशु बलि के लिए जरूरत को खत्म ।

ताऊ समुच्चय हम इस परख में इस्तेमाल किया गया अत्यधिक reproducible इन विट्रो एकत्रीकरण प्रक्रिया है कि हम हाल ही में 13वर्णित का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे, और समान आकृति विज्ञान के लिए युग्मित पेचदार रेशा (PHFs) विज्ञापन के दिमाग से अलग दिखा रोगियों. जब तक हम किसी भी अप्रत्याशित परिणाम है कि ताऊ समुच्चय प्लास्टिक या कांच सतहों के लिए पालन की वजह से किया गया है पर गौर नहीं किया, स्थिर और अच्छी तरह से विशेषता ताऊ समुच्चय का उपयोग इस परख के reproducibility में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।

एक अंय पहलू है कि काफी परख reproducibility में योगदान सेल घनत्व था । अच्छी तरह से प्रोटोकॉल में वर्णित प्रति कोशिकाओं की संख्या वर्णित स्थितियों में इष्टतम कोशिका घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

अलग से क्या दुर्गंध एट अल । 11 वर्णित है, हम एक पीएच संवेदनशील डाई जो काफी अंलीय organelles में internalization पर अपनी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, इस प्रकार intracellular ठहराव के लिए अनुमति के साथ ताऊ समुच्चय लेबल । यह, सतह बाध्य immunocomplexes और/या ताऊ के trypsin पाचन के साथ साथ, गारंटी देता है कि प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometry द्वारा मापा संकेत के बजाय सेलुलर सतह के लिए बाध्यकारी ताऊ का नतीजा है । इसके अलावा, एक पीएच संवेदनशील डाई का उपयोग सतह बंधे immunocomplexes/ताऊ समुच्चय जो तब सेल फिर से चढ़ाना और वसूली की आवश्यकता होती है पचाने की आवश्यकता के बिना सूक्ष्म प्रयोगों में आंतरिक ताऊ समुच्चय का पता लगाने में आसानी ।

हम भी आगे माइक्रोस्कोपी पढ़ने के लिए अनुकूलित हमारे परख के बाहर, जो पहले11वर्णित किया गया है की तुलना में, हमारे सूक्ष्म प्रयोगों में अंलीय organelles के लिए एक उच्च चयनात्मक डाई का उपयोग करके जो हमें न केवल एंटीबॉडी की पुष्टि करने के लिए मध्यस्थता की अनुमति दी ताऊ जी, लेकिन यह भी endolysosomal डिब्बे में ताऊ समुच्चय का स्थानीयकरण ।

परख हम विकसित की है, इष्टतम विशिष्टता है जो एक अच्छा प्रयोगात्मक सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच एक मजबूत जुदाई की अनुमति खिड़की में परिणाम है । दिलचस्प है, परख परोक्ष रूप से एंटीबॉडी संबंध में मतभेदों का पता लगाता है इस प्रकार एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए विरोधी ताऊ एंटीबॉडी प्रभाव कार्यों का अध्ययन ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए अल्बर्टो Carpinteiro सोरेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV-2 cells ICLC Interlab Cell Line Collection ATL03001
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 10010-015
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300-054
DMEM 4.5 g/dL glucose Gibco 41966-029
Fetal Bovine Serum Gibco 10091-148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605E
EasYFlask Nunc 156499 / 159910
pHrodo Green STP ester Life Technologies P35369 
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM
DMSO Sigma D2650-100ml
PD10 columns GE Healthcare 17-0851-01
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Greiner 665180
Falcon 96-Well Assay Plates Falcon 353910
Heparin Sigma  H3393-50KU
Trypsin-EDTA 0.25% Sigma T4049-100ml
BSA Sigma A7030-100G
EDTA 0.5 M, pH8
FACS Canto II BD
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Fisher Scientific 62249
LysoTracker Deep Red Thermo Fisher Scientific L12492
Opera Phenix Perkin Helmer HH14000000

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References

  1. Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
  2. Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
  3. Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
  4. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  5. Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
  6. Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
  7. Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
  8. Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
  9. Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
  10. Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
  11. Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
  12. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
  13. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
  14. Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
  15. Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
  16. Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
  17. Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
  18. Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
  19. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४१ अल्जाइमर tauopathy ताऊ एकत्रीकरण microglia बी. वी.-2 के लिए निकासी ।
सेल ने परख कर पढ़ाई एंटीबॉडी-मध्यस्थता करने वाले ताऊ को Microglia ने मंजूरी
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De Marco, D., Taggenbrock, R.,… More

De Marco, D., Taggenbrock, R., Crespo, R., Koudstaal, W., Ramsburg, E., Apetri, A. Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia. J. Vis. Exp. (141), e58576, doi:10.3791/58576 (2018).

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