ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。
アルツハイマー病 (AD) は、進行性神経変性条件集計タウおよびアミロイド蛋白質を最終的に認知機能の低下につながる神経の機能障害を引き起こす脳の蓄積します。ニューロンの過リン酸化タウ凝集体は、広告に関連付けられている病理の主要な原因と考えられています。これらの集計はコンパートメントを細胞外に放出されると仮定されどこ彼らはタウ凝集を引き起こすさらに隣接する健康な神経細胞によってとら。この「プリオンのような”拡散は、バインドと細胞外タウ凝集体広告マウスの前臨床モデルで示すように、「中和」ことが出来る抗体によって中断すること。抗体が病態を減らす提案されたメカニズムの 1 つは、抗体吸収およびミクログリアでタウの病理学的集計フォームのクリアランスです。ここでは、ミクログリアでタウの取り込みを評価する定量的細胞アッセイについて述べる。この試金はマウスのミクログリア細胞株 BV 2 を使用して、高い特異性、変動の少ない、中程度のスループットが可能します。この試金によって生成されたデータは、反タウ抗体エフェクターの機能のより良い評価に貢献できます。
アルツハイマー病 (AD) は、病理学的集計への構造変化と自己集合アミロイド β ペプチドとタウ蛋白を特徴とする進行性の神経変性状態です。オリゴマーと原線維変化1,2として異常リン酸化タウが蓄積される一方、通常水溶性アミロイド β ペプチドはオリゴマーや繊維のアミロイド β に変換されます。これらのタンパク質の凝集体は、記憶喪失とその後進行性認知機能の低下につながる神経細胞死を引き起こします。非生産的 neuroinflammation 誤って折りたたまれたタンパク質をオフに削減するなど、他の要因が悪化して、病を加速します。現在、広告に対しての介入戦略は、症候性の救済を提供するが、疾患修飾治療や予防はありません。
証拠が増えている AD の病理学の過リン酸化タウ凝集体の重要な役割です。非病理学の状態、微小管に結合し、神経細胞の細胞骨格にそのアセンブリを促進するネイティブ折り畳まれていないタンパク質です。タウでは、過リン酸化になると、骨格から切り離されて、ほとんど広告3に関連付けられている病理を引き起こすと考えられているニューロンのタウ集計へのクラスターします。タウ開始細胞内で、最初の蓄積を集約が、病気が進むにつれて元にとることができるの隣接またはシナプス接続している健康的なニューロンによる細胞外スペースに影響を受けたニューロンから放出されると見なされます、」プリオンのような方法」。内面、一度タウ集計はさらにタウ凝集を介してテンプレート構造変化4を誘導します。
この仮説によればタウ シードを中断することができる治療は遅く、tau の神経変性疾患のコースを逆に。これを支持する遺伝子の変異によりタウオパチーに影響を受け、受動的反タウ抗体を注入したマウス表示減らされたタウ病理と認知機能の改善5,6,7,8 ,9。しかし、抗体が病態を減らすメカニズムはまだとらえどころのないままです。
提案されたメカニズムは、抗体吸収およびミクログリア、脳の免疫細胞によってタウの病理学的集計フォームのクリアランスがあります。最近の出版物は、ミクログリアが効率的に内面化し、病理学的タウ種が低下して、表面の Fc 受容体を含む機構を介してFc 依存反タウ抗体によりこの機能を拡張を提案します。ミクログリアと受容体を介した貪食10,11。これらのデータは、抗体医薬の可能性のある重要なエフェクターとしてミクログリアを識別します。
我々 はミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価するセルベースのアッセイをここに記述します。この試金によって生成されたデータは、従って潜在的な AD の治療薬としての開発のさらなるステップに反タウ抗体を進めるための便利なツールを表す反タウ抗体の作用のメカニズムの解明を助けることができます。
居住者の脳の免疫細胞、ミクログリアは、最近タウオパチー10,11の抗体治療アプローチで重要なプレーヤーとして識別されています。ライソゾーム神経取り込み9、抑制または線維形成13,14の不安定化と intraneuronal 線維を介してのクリアランスのブロックと共に、ミクログリアによって抗体を介したタウ クリアランス経路15タウオパチー5,6,7,8,9マウス モデルにおいて抗タウ抗体の有効性に貢献するかもしれないすべて。
我々 は良い反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価するセルベースのアッセイを紹介します。
このアッセイは、ファンクらから適応11BV 2 細胞は、不死化マウスのミクログリア細胞を使用します。彼らは多くを備えて完全には主要な小グリア細胞に比較できません中、a β とタウ線維11,16,17 を貪食確実の能力を含むプライマリ ミクログリアの特性、、18,19。また、彼らは、再現可能な動作の in vitroアッセイ開発と最小限の実験的変動を必要とする量的研究にきわめて適してさせ示した。この横に、不死化細胞株はスループット アッセイを許可して、プライマリ ミクログリアの使用と比較して動物の犠牲のための必要性を排除します。
我々 はこの試金で使用されるタウ凝集体は、13、および類似の形態対ヘリカル フィラメント (PHFs) 広告の脳から分離されたショーの説明を最近、再現性の高い体外集計の手順を使用して得られました。患者。プラスチックやガラスの表面にタウ凝集付着によって引き起こされた可能性があります、予期しない結果を観察しなかった我々 は、間安定してよく特徴付けられるタウ凝集体の使用はこの測定の再現性に重要な役割を果たした。
アッセイの再現性に著しく貢献したもう一つの側面は、細胞密度だった。プロトコルに記載されているウェルあたりの細胞数は、説明の条件に最適な細胞密度を表します。
どのようなファンクらとは異なる11記述されている、我々 は細胞内定量化することができます酸性オルガネラで内面に蛍光が増大、pH 敏感な染料にタウの凝集体をラベル付けされます。これは、表面のトリプシンの消化力と共にバインド immunocomplexes やタウ、フローサイトメトリーを用いて蛍光信号を保証は、タウの吸収ではなく、細胞表面へのバインドの結果。また、表面の消化を必要とせず顕微鏡実験で内面化されたタウ凝集体の検出バインド、なる immunocomplexes/タウ凝集 pH 敏感な染料容易の使用には、セルは再メッキと回復が必要です。
我々 はまたさらに我々 の分析は、以前説明した11をされているものと比較しての顕微鏡読み出しを最適化、顕微鏡実験ではない私たちを許可する酸性オルガネラの選択性の高い色素を使用して確認するのみ抗体タウの取り込みも endolysosomal コンパートメントでタウ凝集体の局在化。
我々 が開発したアッセイは、正と負のサンプル間の分離を許可する良い実験ウィンドウで結果を最適な特異性。興味深いことに、アッセイ直接検出されない従って反タウ抗体エフェクターの機能を研究するための強力なツールを表す抗体の親和性の違い。
The authors have nothing to disclose.
彼の貴重な技術支援のアルベルト ・ Carpinteiro soares さんに感謝したいと思います。
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |