여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.
Alzheimer의 질병 (광고)는 진보적인 신경 상태 집계 타우 이며 녹말 체 단백질 인지 감소를 이끌어 결국 신경 장애를 일으키는 두뇌에 축적. Hyperphosphorylated 타우 집계 신경에서 광고와 관련 된 병 리의 대부분을 일으키는 것으로 추정 된다. 이러한 집계는 extracellular 구획에 나올 생각 하 고 어디 그들은 유도 타우 집계 추가 인접 한 건강 한 신경에 의해 촬영. 이 “프리온-같은” 확산 항 체 바인딩 및 “중화” 광고의 전 임상 마우스 모델에서와 같이 extracellular 타우 집계에 의해 중단 될 수 있습니다. 항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia에 의해 타우의 치료 항 체 병 리를 줄일 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 여기, 우리 타우 글귀 microglia 평가를 양적 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 마우스 microglial 셀 라인 BV-2를 사용 하 여, 높은 특이성, 낮은 변동성 및 중간 처리량에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 함께 생성 된 데이터는 안티 타우 항 체 effector 기능 더 나은 특성화에 기여할 수 있다.
Alzheimer의 질병 (광고)은 병 적인 집계에 아 밀 로이드 β 펩 티 드와 타우 단백질의 구조적 변화에 의해 및 자기 조립 특징 진보적인 신경 퇴행 성 조건. 비정상적으로 phosphorylated 타우 올리고 neurofibrillary tangles1,2로 축적 하는 동안 정상적인 성 아 밀 로이드 β 펩 티 드 oligomeric 및 원 아 밀 로이드 β로 변환 됩니다. 이러한 단백질 집계 발생할 메모리 손실 및 연속적인 진보적인 인식 쇠퇴에 지도 하는 신경 죽음. 비 생산적 neuroinflammation를 misfolded 단백질 감소 능력 등 다른 요인 악화 하 고 질병을 가속 수 있습니다. 현재, 주로 징후 기복을 제공 하는 광고에 대 한 개입 전략 하지만 질병 수정 치료 또는 예방.
증거를 증가 광고의 병리학에서 hyperphosphorylated 타우의 중요 한 역할을 건의 한다. 비 병 적인 상태로 타우 microtubules에 바인딩하고 촉진 신경 세포 골격에 해당 어셈블리는 기본적으로 펼쳐진된 단백질입니다. 타우 된다 hyperphosphorylated, 골격에서 분리 하 고는 대부분 광고3와 관련 된 병 리 현상의 원인으로 신경, 타우 집계에 클러스터. 처음 침, 축적 하는 타우 시작 되지만 질병 진행에서 그것은 채택 될 수 있다 인접 또는 synaptically 연결 된 건강 한 신경에 의해 세포 외 공간으로 영향 받은 신경에서 출시 될 가정에 ” 프리온과 같은 방식으로 “. 내 면, 일단 타우 집계 추가 타우 집계를 통해 템플릿 기반 구조적 변화4을 유도 합니다.
이 가설에 따르면 타우 시드 중단 수 요법 감속 하거나 타우 중재 신경 질환의 과정을 반전 수 있습니다. 이, 지원 쥐 유전자 변이 의해 tauopathy에 취약 하 고 수 동적으로 안티 타우 항 체 주사 쇼 감소 타우 병리학과 향상 된 인지 기능5,6,7,8 ,9. 그러나, 치료 항 체 병 리를 줄일 메커니즘은 여전히 애매 남아.
항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia, 두뇌의 주민 면역 세포에 의해 타우의 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 최근 간행물 microglia 수 효율적으로 내 면화 하 고 병 적인 타우 종족 저하 안티 타우 항 체를 통해 Fc-종속 메커니즘의 표면에 Fc 수용 체를 포함 하 여이 능력은 향상 하 고 좋습니다. microglia 및 수용 체 중재 먹어서10,11. 이러한 데이터는 치료 항 체의 잠재적으로 중요 한 이펙터로 microglia를 식별합니다.
여기 타우 글귀 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 사용 하 여 생성 하는 데이터 사전 방지 타우 항 체 잠재적인 광고 치료로 그들의 발달의 더 단계에 유용한 도구를 대표 하는 따라서 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 elucidating 도울 수 있다.
Microglia, 거주 뇌의 면역 세포, 항 체 중재 치료 접근 tauopathies10,11에 대 한 중요 한 선수로 최근 확인 되었습니다. Microglia 차단 신경 통풍 관9, 억제 또는 fibril 형성13,14 의 불안 및 intraneuronal 소 통해 의 클리어런스는 lysosomal 함께 의해 항 체 중재 타우 클리어런스 통로15, 모든 tauopathy5,6,7,,89의 마우스 모델에서 안티 타우 항 체 효능에 기여할 수 있습니다.
우리 여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.
이 분석 결과, 펑크 외. 에서 적응 11, 불멸 하 게 murine microglial 셀 BV-2 세포를 사용 합니다. 그들은 완전히 기본 microglial 셀에 비교 될 수 없다, 그러나 그들은 많은 기능이 기본 microglia 특성의 Aβ와 타우 소11,,1617 phagocytose 견고의 기능을 포함 하 여 ,1819. 또한, 그들은를 재현할 동작에서 보여주었다 생체 외에서 분석 결과 개발 및 최소한의 실험적인 변화를 요구 하는 양적 연구에 매우 적합 한 그들을 만든. 이 옆에 불멸 하 게 셀 라인 높은 분석 결과 처리량을 허용 하 고 기본 microglia의 사용에 비해 동물 희생에 대 한 필요성을 제거.
우리는이 분석 결과에서 사용 하는 타우 집계 높은 재현성 생체 외에서 집계 설명 하는 절차는 우리가 최근13및 쇼에 유사한 형태학 짝 나선형 필 라 멘 트 (PHFs) 광고의 두뇌에서 격리를 사용 하 여 얻은 했다 환자입니다. 우리 타우 집계 준수 플라스틱이 나 유리 표면에 의해 발생 했을 수 있습니다 어떤 예기치 않은 결과 관찰 하지 않았다, 그러나 안정적이 고 잘 특징이 타우 집계를 사용 하 여가 분석이 결과의 재현성에 중요 한 역할을 했다.
또 다른 측면을 크게 시험의 재현성은 셀 밀도. 프로토콜에서 설명 잘 당 셀의 숫자 설명된 조건에서 최적의 셀 밀도를 나타냅니다.
다르게 무엇 보다 펑크 외. 11 설명, 우리가 분류는 크게 산 성 세포에서 국제화에는 형광 증가 pH 민감한 염료와 타우 집계 되므로 세포내 정량화에 대 한. 이, 표면의 트립 신 소화 함께 immunocomplexes 및 타우, 보장 그 형광 신호 측정 cytometry 타우 이해 보다는 세포 표면에 바인딩의 결과 이다. 또한, pH 민감한 염료 부드럽게 표면 소화의 필요성 없이 현미경 실험에서 내 면된 타우의 탐지 바인딩된 다음 것이 immunocomplexes/타우 집계를 사용 하 여 셀이 다시 도금 및 복구 필요 합니다.
우리는 또한 더 설명된11했던 이전에 비해, 우리의 분석 결과의 현미경 읽기 최적화, 산 성 세포는 안 봐도 우리의 현미경 실험에 대 한 매우 선택적인 염료를 사용 하 여 확인 하는 유일한 항 체-중재 타우 통풍 관, 아니라 endolysosomal 구획에 타우의 지역화.
우리가 개발 하 고, 분석 결과 긍정적이 고 부정적인 샘플 사이 강한 별거를 허용 하는 좋은 실험 창 최적의 특이성이 있다. 흥미롭게도, 분석 결과 직접 감지 하지 따라서 안티 타우 항 체 효과 기 기능을 공부 하는 강력한 도구를 대표 하는 항 체 선호도에 차이.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그의 귀중 한 기술 지원을 알베르토 Carpinteiro Soares 감사 하 고 싶습니다.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |