Здесь мы описываем на основе ячеек пробирного чтобы количественно оценить Тау поглощение микроглии с целью создания исследуемого инструмент лучше характеризуют механизмы действия антител анти Тау.
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессивным нейродегенеративных состояние, в котором объединяются Тау и амилоидные белки накапливаются в мозг, вызывая нейрональных дисфункции, которая в конечном итоге приводит к когнитивными. Hyperphosphorylated Тау агрегатов в нейронах, что вызывают большую часть патологии, связанные с AD. Эти агрегаты предполагается, что будет выпущен в внеклеточной отсек и занимают соседние здоровые нейронов где они побудить далее Тау агрегации. Этот «китовая птичка как» распространение могут быть прерваны антитела способны привязки и «нейтрализации» внеклеточной Тау агрегатов, как показано в доклинических мыши модели AD. Одной из предлагаемых механизмов, которые терапевтических антител уменьшить патологии является антитела опосредованной поглощения и распродажа патологических форм агрегированных Тау, микроглии. Здесь мы описываем количественных на основе ячеек анализа для оценки поглощения Тау микроглии. Этот assay использует мышь Микроглии клеток линии БВ-2, позволяет высокая специфичность, низкой изменчивости и средней пропускной способности. Данные, полученные с этот assay может способствовать лучше характеристика антитела анти Тау эффекторных функций.
Болезнь Альцгеймера (AD) это прогрессивный нейродегенеративных состояние характеризуется конформационные изменения и самостоятельной сборки пептида и Тау белка амилоида β в патологических агрегаты. Нормальный растворимый β амилоида пептид преобразуется в олигомерных и фибриллярного амилоида β, хотя аномально фосфорилированных Тау накапливается олигомеров и нейрофибриллярных клубков1,2. Эти агрегаты белка причиной нейрональных смерти, приводит к потери памяти и последующего постепенного когнитивными. Другие факторы, включая непроизводственной neuroinflammation и снижение способности очистить смятых протеинов, могут усилить и ускорить заболевания. В настоящее время стратегии вмешательства против AD-основном симптоматическая облегчение, но нет Болезнь модифицирующие лечения или профилактики.
Все больше фактов предполагает ключевую роль hyperphosphorylated Тау агрегатов в патологии AD. В его не патологическое состояние Тау является изначально развернулось белок, который связывается с микротрубочками и способствует их сборку в нейрональных цитоскелета. Когда Тау становится hyperphosphorylated, он отсоединяется от цитоскелета и кластеров в Тау агрегаты в нейронах, которые полагают, вызывают большую часть патологии, связанные с AD3. Агрегированные Тау начинает накапливаться сначала внутриклеточно, но как болезнь прогрессирует, то предполагается, выйдет из пострадавших нейронов во внеклеточное пространство, из которого он может быть take up прилегающих или синаптически подключенных здорового нейронов в» китовая птичка как образом». После того, как внутреннюю, Тау агрегатная вызывает дальнейшие Тау агрегации через шаблонного конформационные изменения4.
Согласно этой гипотезе терапии, способных прерывая Тау посева может замедлить или обратить вспять курс Тау опосредованной нейродегенеративных заболеваний. В поддержку этого мышей сделал восприимчивыми к Таупатия генетической мутации и пассивно вводили с антитела анти Тау показывают снижение Тау патологии и улучшение когнитивных функций5,6,7,8 ,9. Однако механизмы, которыми терапевтических антител уменьшить патологии по-прежнему остаются недостижимой.
Одной из предлагаемых механизмов является антитела опосредованной поглощения и распродажа патологических агрегированных форм Тау, микроглии, резидентов иммунных клеток мозга. Недавние публикации предполагают, что микроглии может эффективно усвоить и ухудшить патологических Тау видов, и эта способность усиливается антитела анти Тау через Fc зависимых механизма с участием ФК рецепторов, выраженные на поверхности Микроглия и рецептор опосредованного фагоцитоза10,11. Эти данные определяют микроглии как потенциально важных эффекторов терапевтических антител.
Мы опишем здесь на основе ячеек пробирного чтобы количественно оценить Тау поглощение микроглии. Данные, полученные с этот assay может помочь определить механизмы действий антител анти Тау, таким образом представляя полезным инструментом для продвижения анти Тау антитела для дальнейших шагов по их развития в качестве возможного лечения AD.
Микроглии, иммунные клетки мозга-резидентов, недавно были признаны важными игроками в антитела опосредованной терапевтические подходы для tauopathies10,11. Антитела опосредованной Тау Распродажа по микроглии, а также блокирует поглощение нейронов9, ингибирование или дестабилизации фибриллярных формирования13,14 и распродажа инактивируемых фибриллами через лизосомальных все пути15, могли бы способствовать эффективности антитела анти Тау, наблюдается в мышиной модели Таупатия5,6,,78,9.
Мы описали здесь на основе ячеек пробирного чтобы количественно оценить Тау поглощение микроглии с целью создания исследуемого инструмент лучше характеризуют механизмы действия антител анти Тау.
Этот assay, взято из фанка и др. 11, использует БВ-2 клетки, которые являются увековечен мышиных Микроглии клеток. Хотя они не могут полностью по сравнению с первичной Микроглии клеток, они оснащены многие из характеристик первичных микроглии, включая способность надежно фагоцитировать значения и Тау фибриллами11,16,17 ,18,19. Кроме того они показали воспроизводимое поведение в vitro который сделал их хорошо подходит для анализа развития и количественных исследований, требующих минимальной экспериментальной изменчивости. Кроме того увековечен клеточных линий позволяют более пробирного высокую пропускную способность и устранить необходимость для жертвоприношения животных, по сравнению с использованием первичных микроглии.
Тау агрегатов, которые мы использовали в этом assay были получены с помощью высоко воспроизводимые в vitro агрегации описанные что мы недавно13и показать, аналогичными морфологии для парных винтовой нитей (PHFs), изолированных от мозги AD пациентов. Хотя мы не наблюдали любые неожиданные результаты, которые возможно были вызваны Тау приверженность агрегатов в пластиковых или стеклянных поверхностей, использование агрегатов стабильной и хорошо характеризуется Тау играет важную роль в воспроизводимость этот assay.
Другой аспект, который значительно способствовали пробирного воспроизводимость был плотность клеток. Число ячеек на хорошо описано в протоколе представляют плотность оптимальный клеток в описанных условиях.
По-разному чем фанк и др. 11 описал, мы помечены Тау агрегатов с рН чувствительных краски, что значительно увеличивает его флуоресценции после интернализации в кислой органеллы, что позволило внутриклеточные количественной оценки. Это, вместе с Пищеварение трипсина поверхности связаны immunocomplexes и/или Тау, гарантии, что флуоресценции сигнал измеряется проточной цитометрии является результатом Тау поглощения, вместо того, чтобы привязки на клеточной поверхности. Кроме того использования рН чувствительных краситель облегчает обнаружение интернализированных Тау агрегатов в микроскопии экспериментов без необходимости переваривания поверхности связаны immunocomplexes/Тау агрегатов, которые будут затем требуется повторно гальванических клеток и восстановления.
Мы также оптимизировали микроскопии считыванию нашего анализа, по сравнению с того, что ранее было описано11, с использованием высокоселективных краситель для кислых органеллы в наших экспериментах микроскопии, которые позволили нам не только для подтверждения антител опосредованной Тау поглощения, но и локализации Тау агрегатов в endolysosomal отсеке.
Assay, которую мы разработали, имеет оптимальную специфику, которая приводит к хорошее экспериментальной окно, позволяя строгого разделения между положительным и отрицательным образцы. Интересно, что assay косвенно обнаруживает различия в сродство антитела таким образом представляет собой мощный инструмент для исследования антител анти Тау эффекторных функций.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Альберто Carpinteiro Соареш за его ценную техническую помощь.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |