Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

Summary

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Abstract

Une variété de processus biologiques implique des interactions cellule-cellule, généralement véhiculées par les protéines qui interagissent à l’interface entre les cellules voisines. D’intérêt, seulement quelques essais sont capables de sonder précisément ces interactions directement dans les cellules vivantes. Nous présentons ici un test pour mesurer la liaison des protéines exprimées à la surface des cellules voisines, aux contacts de cellules. Ce test comprend deux étapes : mélange des cellules exprimant les protéines d’intérêt fusionné à différentes protéines fluorescentes, suivie de mesures de spectroscopie de fluorescence fluctuation aux contacts de cellules à l’aide d’un laser confocal microscope à balayage. Nous démontrer la faisabilité de ce test dans un contexte biologiquement pertinent en mesurant les interactions de la protéine amyloïde de précurseurs comme 1 (APLP1) jonctions cellule-cellule. Nous fournissons des protocoles détaillés sur l’acquisition de données à l’aide de techniques axées sur la fluorescence (analyse spectroscopie de corrélation de fluorescence, nombre de corrélation croisée et l’analyse de la luminosité) et l’étalonnage de l’instrument requis. De plus, nous discutons des étapes essentielles dans l’analyse des données et la façon d’identifier et de corriger les variations de signal externe, parasites, telles que celles dues à un mouvement de photoblanchiment ou cellule.

En général, l’analyse présentée est applicable à tout homo - ou d’une interaction de protéines hétérotypiques à contacts de cellule-cellule, entre les cellules des types identiques ou différents et peut être implémentée sur un laser confocal commercial microscope à balayage. Une exigence importante est la stabilité du système, qui doit être suffisante pour sonder par diffusion dynamique des protéines d’intérêt pendant plusieurs minutes.

Introduction

Beaucoup de processus biologiques se produire sur les sites des interactions cellule-cellule, par exemple, cellules adhérence^1,2,3, cellule-cellule fusion⁴ et reconnaissance cellulaire⁵. Ces événements sont particulièrement importants lors du développement des organismes pluricellulaires et pour la communication de cellule-cellule, par exemple, au cours de la réponse immunitaire. Ces processus sont généralement véhiculées par des protéines qui sont localisés à la surface, c'est-à-dire à la membrane plasmique (PM) des cellules voisines et subissent des interactions spécifiques au contact cellule-cellule qui sont précisément réglementées dans l’espace et le temps. Dans de nombreux cas, ces interactions sont directement homo - ou des interactions protéine-protéine hétérotypiques trans , mais peuvent aussi comporter des ions ou des ligands agissant comme linkers extracellulaire¹. Bien que d’une importance fondamentale, il y a un manque d’essais probing ces interactions protéine-protéine spécifique directement dans l’environnement natif des cellules vivantes. Plusieurs méthodes nécessitent soit désorganisation cellulaire (par exemple, des tests biochimiques comme co-immunoprécipitation⁶), la fixation (par exemple, certaines des techniques de microscopie optique de Super-résolution et microscopie électronique de cellules contacts⁷), ou sont non spécifiques, par exemple, agrégation / adhérence dosages^8,9. Pour résoudre ce problème, techniques de fluorescence ont été appliquées à l’issu de la fluorescence resonance energy transfert (FRET)¹⁰ ou fluorescence complémentation¹¹. Toutefois, pour atteindre suffisamment petites distances entre les fluorophores, ces méthodes nécessitent des étiquettes fluorescentes du côté extracellulaire des protéines¹⁰, potentiellement interférer avec des interactions de trans .

Nous présentons ici une analyse alternative de basés sur la fluorescence pour interactions protéine-protéine à contacts cellule-cellule. Cette approche combine des approches de corrélation de fluorescence (balayage spectroscopie de corrélation de fluorescence (sFCCS), nombre de corrélation croisée et la luminosité (ccN & B)) et le mélange des cellules exprimant une construction de fusion de la protéine de intérêt, par exemple, un récepteur d’adhésion. Les récepteurs étudiés dans les deux cellules qui interagissent sont étiquetés avec deux protéines fluorescentes spectralement séparés (FPs), de l’intracellulaire (voir Figure 1 a).

Les méthodes employés reposent sur l’analyse statistique des variations de fluorescence induite par le mouvement diffusif fluorescent des protéines de fusion par le biais du volume focal d’un confocal laser scanning microscope. Plus en détail, le test des sondes la diffusion conjointe des protéines d’intérêt dans les deux voisins PMs à contacts cellule-cellule. Si les protéines subissent des interactions de trans , ces complexes trans portera des protéines fluorescentes émettant dans les deux canaux spectraux, provoquant des fluctuations de corrélation de fluorescence des deux émetteurs. En revanche, si aucune liaison se produit, les fluctuations des protéines numéros face à PMs sera indépendantes, ne causant aucune fluctuation corrélées. L’acquisition peut être effectuée de deux façons : 1) sFCCS repose sur une analyse en forme de ligne au travers le contact de cellule-cellule et sondes efficacement les interactions dans un endroit situé dans la région de contact. Grâce à une analyse temporelle des variations de fluorescence, sFCCS renseigne aussi dynamique, c'est-à-dire, les coefficients de diffusion des complexes protéiques ; 2) ccN & B repose sur une analyse d’un d’une séquence d’images acquises dans les régions de contact cellule-cellule. Il a une capacité à sonder et le long de l’ensemble des interactions de carte contact région (dans un plan focal), mais ne fournit pas d’informations sur la dynamique. Les deux méthodes peuvent être combinées avec une analyse de la luminosité moléculaire, c'est-à-dire le signal de fluorescence moyenne émise dans l’unité de temps par simple diffusion complexes de protéines et, ainsi, fournir des estimations de la stoechiométrie des complexes protéiques au contacts de cellule-cellule.

Dans cet article, nous fournissons des protocoles détaillés pour la préparation des échantillons, d’étalonnage des instruments, d’acquisition de données et d’analyse effectuer l’essai présenté sur un laser confocal commercial microscope à balayage. Les expériences peuvent être effectuées sur n’importe quel instrument équipé de comptage de photons ou détecteurs analogiques et un objectif à grande ouverture numérique. Plus loin, nous discutons des étapes critiques du protocole et fournissent des systèmes de correction pour plusieurs processus causant des fluctuations artéfactuelles signal, par exemple, bruit de détecteur, photoblanchiment ou cellule mouvement. Développé à l’origine pour sonder les interactions entre cellules adhérentes, l’essai peut être modifié pour les cellules en suspension, ou adaptée aux systèmes à membrane modèle, par exemple, les vésicules unilamellaires géant (GUVs) ou le plasma géant vésicules de la membrane (GPMVs), ce qui permet la quantification des interactions dans des environnements différents lipides ou en l’absence d’un cytosquelette organisé^12,13.

Spectroscopie de corrélation de fluorescence de balayage est une version modifiée de la spectroscopie de corrélation de fluorescence¹⁴ et a été spécialement conçu pour sonder la lente par diffusion dynamique de membranes lipidiques¹⁵. Il repose sur une acquisition de balayage ligne perpendiculaire à la PM contenant les protéines fluorescentes d’intérêt. Pour sonder les interactions entre les deux espèces de protéines marquées différemment, l’acquisition est effectuée en deux canaux spectraux en utilisant deux lignes laser et deux fenêtres de détection de fluorophores spectralement séparés. En raison de la dynamique de diffusion lente des protéines dans la MP (D≤ ~ 1 µm2/s), une mesure cross-talk-gratuit peut être effectuée en alternance le régime de l’excitation de la ligne à la ligne¹⁵. L’analyse commence par : 1) l’alignement algorithme correction de mouvement latéral cellulaire basé sur block-wise avec une moyenne de ~ 1000 lignes, 2) Détermination de la position avec fluorescence maximum signal, c'est-à-dire la PM position dans chaque bloc et 3) shifting de tous les blocs d’une commune origine^12,15, séparément pour chaque voie. Puis, une sélection automatique des pixels correspondant à la PM est exécutée en sélectionnant la zone centrale d’un ajustement gaussien de la somme de toutes les lignes alignées (c.-à-d., Centre ± 2.5σ). Intégration du signal de chaque ligne donne la série temporelle de fluorescence membranaire f (t) dans chaque canal (g = vert canal, r = canal rouge). Notez que la taille du pixel doit être assez petit par exemple, < 200 nm, pour reconstruire la forme du point de fonction d’étalement et de trouver son centre, correspondant à la position de la MP. En présence de photoblanchiment substantiel, les séries chronologiques de fluorescence dans chaque canal peuvent être modélisés par une fonction exponentielle double et puis corrigés avec la formule suivante :¹⁶

.    (1)

Il est important de noter que cette formule corrige efficacement tant les amplitudes et les heures de diffusion obtenues par l’analyse de corrélation de f (t)^c, par rapport aux estimations de paramètre qui seraient obtenues à partir du non corrigée f (t). Ensuite, les fonctions auto - et la corrélation croisée (ACFs / CCP) de la fluorescence des signaux sont calculées :

, (2).

, (3).

où δF_j’ai = F_i(t) - F_i(t) et i = g, r.

Un modèle de diffusion bidimensionnelle est ensuite ajusté à toutes les fonctions de corrélation (CFs) :

.   (4)

Ici, N désigne le nombre de protéines fluorescentes dans le volume de l’observation et τ_d le temps de diffusion pour chaque canal. Ce modèle prend en compte que dans le cadre expérimental décrit, diffusion des protéines dans la MP se produit dans le plan x-z, contrairement à la configuration courante de corrélation de fluorescence spectroscopy (FCS) expériences sur les membranes de palpage diffusion dans le plan x-y du confocal volume¹⁷. La taille w₀ et le facteur de structure S, décrivant l’allongement w_z du volume focal en z, S = wz/w₀, sont obtenues à partir d’une mesure de calibration de FCS point effectuée avec colorants spectralement similaires et les mêmes paramètres optiques à l’aide de valeurs déjà disponibles pour le coefficient de diffusion D_colorant:

, (5).

où τ_{d, colorant} est le temps de diffusion moyenne mesurée des molécules de colorant, obtenu à partir d’un modèle pour la diffusion en trois dimensions des données, compte tenu des transitions de compte d’une fraction T de toutes les molécules de N à un état triplet avec une constante de temps τ_τ:

.   (6)

Enfin, les coefficients de diffusion (D), les valeurs de luminosité moléculaire (ε) et la corrélation croisée relative des données sFCCS (rel.cc.) sont calculées comme suit :

, (7).

, (8).

, (9).

où G_Croix(0) est l’amplitude de la fonction de corrélation croisée et est l’amplitude de la fonction d’autocorrélation dans le canal du je-th.

Cette définition de la relative corrélation croisée, c'est-à-dire à l’aide de max au lieu de signifier l’équation 9, tient compte du fait que le nombre maximal de complexes des deux espèces de protéines présents à des concentrations différentes est limité par la espèces présentes dans un nombre inférieur.

Luminosité et nombre de corrélation croisée repose sur une analyse de l’instant de l’intensité de fluorescence pour chaque pixel d’une image de pile a acquis au fil du temps à une position fixe dans l’échantillon, généralement composé de ~ 100-200 cadres, avec deux spectrale des canaux () g = vert canal, r = canal rouge). D’après la moyenne temporelle je_{et la variance} , la luminosité moléculaire ε_i et numéro n_j’ai sont calculées dans chaque pixel et de canaux spectraux (j’ai = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

Il est important de noter que les équations données s’appliquent pour le cas idéal d’un vrai détecteur de comptage de photons. Pour les systèmes de détection analogique, les équations suivantes s’appliquent à^19,20:

, (12).

.   (13)

Ici, S est le facteur de conversion entre les photons détectés et les comtes numériques enregistrées, est le bruit de lecture et offset fait référence à l’offset d’intensité de détecteur. Généralement, ces quantités doivent être étalonnées, pour n’importe quel type de détecteur, basée sur la mesure de la variance du détecteur en fonction de l’intensité d’éclairage constant¹⁹, par exemple, une surface métallique réfléchissante ou solution de colorant séchées. Le décalage peut être déterminé en mesurant le taux de comptage pour un échantillon sans lumière d’excitation. En effectuant une régression linéaire de la variance associée à détecteur contre le tracé de l’intensité (I), S et peut être déterminée¹⁹:

.   (14)

Enfin, la luminosité de la corrélation croisée est calculée dans chaque pixel et est définie en général comme²¹

, (15).

où est la Croix et la variance .

Pour filtrer les fluctuations à long terme, toutes les ccN & calculs B sont effectuées suivant un wagon couvert, filtrage, indépendamment pour chaque pixel²². En bref, n_i, ε_j’ai (j’ai = g, r) et B_cc sont calculées en glissant des segments de p. ex. cadres de 8-15. Les valeurs ainsi obtenues peuvent être ensuite la moyenne pour obtenir le pixel final les valeurs de nombre et de la luminosité.

Analyse de stoechiométrie
Afin d’estimer la stoechiométrie des complexes protéiques à contacts cellule-cellule, la luminosité moléculaire peut être analysée séparément pour chaque voie spectral pour le sFCCS ou le ccN & B data. Dans sFCCS, une valeur de luminosité est obtenue par la mesure de chaque canal. Dans la ccN & B, on obtient un histogramme de luminosité des pixels situés correspondant au contact cellule-cellule et la valeur moyenne (ou médiane) peut servir de luminosité représentative pour la mesure. En effectuant la même analyse sur une référence monomère, toutes les valeurs de luminosité peuvent être normalisées pour obtenir directement l’État oligomère moyenne des complexes protéine détectée. À ce stade, il est important de corriger la présence de FPs non fluorescent pouvant entraîner une sous-estimation de l’État oligomère. Ceci est généralement effectuée par la mesure de la luminosité d’un homo-dimère référence protéine^23,24 utilisant une couleur SCTS-m ou le numéro et la luminosité (N & B).

Protocol

1. préparation : Cellules mélange dosage

Remarque : Le protocole suivant décrit la procédure de mélange pour les cellules adhérentes. Il peut être modifié pour les cellules cultivées en suspension.

1. Un nombre adéquat de cellules sur une plaque 6 puits, par exemple, 800 000 cellules HEK 293 t (comptées avec un Neubauer chambre de comptage), un jour avant la transfection des semences. Le nombre peut être modifié selon le délai entre l’amorçage et de transfection et ajusté pour les autres types de cellules. Pour réaliser une expérience de base (c.-à-d., les protéines d’intérêt et de contrôle négatif), préparer au moins 4 puits. Des cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans un milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, additionné de sérum de veau fœtal (10 %) et de la L-glutamine (1 %).
2. Transfecter cellules selon les instructions du fabricant (voir la Table des matières).
   1. Pour réaliser une expérience de base, transfecter, en puits séparés, plasmides pour la protéine d’intérêt fondue à un « vert » (p. ex., monomère meilleure protéine fluorescente verte (mEGFP), ou une protéine fluorescente jaune (mEYFP)) ou « rouge » (p. ex., mCherry, ou mCardinal) protéine fluorescente.
      Remarque : Dans ce protocole, nous nous concentrons sur APLP1-mEYFP et APLP1-mCardinal¹²et le contrôle négatif correspondant, par exemple, myristoylated-palmitoylées-mEYFP (myr-palm-mEYFP) et - mCardinal (myr-palm-mCardinal)¹². En général, de 200 ng - 1 µg d’ADN plasmidique suffisent. Efficacité de transfection élevé augmente les chances de trouver des cellules « rouges » et « verts » en contact. Modifier la quantité de réactif de plasmides et de transfection pour optimiser l’efficacité de transfection. Critique : Confluence de la cellule devrait être d’environ 70 % lorsque transfectants des cellules. Si les cellules sont trop anastomosé, diminue l’efficacité de transfection. Si les cellules ne sont pas assez confluentes, transfection et le mélange peuvent induire des contraintes et prévenir plusieurs cellules d’une bonne fixation après mélange.
3. Effectuer le mélange ~4 ± 2 h après la transfection de cellules.
   1. Enlever le milieu de croissance et laver chaque bien doucement avec 1 mL de PBS additionné de Mg^{2 +} et Ca^{2 +}. Ensuite, retirez le PBS. (Critique) Drop PBS sur bord bien pour éviter le détachement des cellules pendant le lavage.
   2. Ajouter goutte-à-goutte ~ 50 µL trypsine tétraacétique (EDTA) une solution d’acide dans chaque puits pour faciliter le détachement des cellules. Incuber à 37 ° C pendant 2 min. par la suite, secouez doucement la plaque 6 puits latéralement pour détacher les cellules.
      Remarque : Les durées d’incubation prolongée peuvent être requises pour certains types de cellules.
   3. Ajouter 950 µL de milieu de culture dans chaque puits et remettre en suspension les cellules en pipettant également, quelques fois monter et descendre, détachant ainsi toutes les cellules du fond du puits. (Critique) S’assurer que les cellules sont correctement remis en suspension et détachés de l’autre en vérifiant visuellement l’absence d’agrégats de grandes cellules après la remise en suspension. Dans le cas contraire nombreux contacts « rouges »-« rouges » ou « verts »-« vertes » seront obtenus après mélange.
   4. Transférer la solution de la cellule d’un puits (protéine d’intérêt ou de témoin négatif) dans le correspondant, c'est-à-dire, « rouge » (par exemple, APLP1-mCardinal transfectée) « vert » (par exemple, APLP1-mEYFP transfectée) des cellules. Mélanger doucement pipetage quelques fois de haut en bas. Puis, les cellules mixtes sur plats en bas 35 mm verre (1 mL de solution de cellules mixtes par plat), ainsi que 1 mL de milieu de culture et de la culture de semences graines cellules pour une autre journée à 37 ° C, 5 % de CO₂.

Figure 1 . Des flux de travail expérimental et représentation schématique du balayage, spectroscopie de corrélation de fluorescence et d’analyse de nombre et de la luminosité de la corrélation croisée à contacts cellule-cellule. (A) schéma de préparation des échantillons : deux populations de cellules transfectées par la protéine d’intérêt (p. ex., APLP1), fusionnée à deux protéines fluorescentes spectralement distinctes (par exemple, mEYFP et mCardinal) sont mélangées après la transfection. Contacts des cellules transfectées différemment sont sélectionnés dans les expériences de microscopie. Pour éviter toute interférence avec les domaines de liaison extracellulaire, la protéine fluorescente doit être fondue jusqu’au terminus intracellulaire de la protéine d’intérêt. (B) mesures de balayage SCCC (sFCCS) sont effectué perpendiculairement au contact cellule-cellule dans deux canaux spectraux (canal 1, verte et le canal 2, rouge). Lignes de balayage (représentées par kymographs) sont alignés et additionnés de pixels de la membrane. Puis, ACFs CCFs sont calculés et les traces d’intensité F_i(t). ACFs sont représentés en rouge et vert. CCF est représentée en bleu. (C) la corrélation croisée N & B (ccN & B) acquisition résulte dans une pile d’image en trois dimensions (x-y-temps). Un retour sur investissement est sélectionné autour du contact cellule-cellule. Puis le canal et la corrélation croisée de luminosité (ε₁, ε₂et B_cc) les valeurs sont calculées à chaque pixel de contact cellule-cellule. Les résultats sont ensuite visualisées comme les histogrammes, mise en commun de tous les pixels sélectionnés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

2. préparation de l’échantillon : Contrôle positif pour des expériences de corrélation croisée et la construction de l’Homo-dimère pour l’analyse de la luminosité

1. 600 000 cellules HEK 293 t, a compté avec une cellule comptant chambre, sur les plats en bas 35 mm verre un jour avant la transfection des semences. Les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans le milieu DMEM complet de la culture (voir étape 1.1) pour un autre jour.
2. Transfecter cellules avec ~ 250 ng d’ADN plasmidique conformément aux instructions du fabricant. Pour le contrôle positif de corrélation croisée, utilisez un plasmide codant une protéine fluorescente ancrées à membrane hétéro-dimères, par exemple, myr-palm-mCherry-mEGFP ou myr-palm-mCardinal-mEYFP¹² correspondant à la FPF de la protéine d’intérêt. Pour l’étalonnage de la luminosité, utiliser des plasmides codant une membrane ancrées monomère FP et homo-dimère correspondant à la FPF fondue à la protéine d’intérêt, par exemple, myr-palm-mEYFP et myr-palm-mEYFP-mEYFP pour calibrer l’analyse de la luminosité de APLP1-mEYFP¹².
3. La culture de cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans le milieu DMEM complet (Voir l’étape 1.1) pour un autre jour.

3. confocal Laser Scanning Microscopy : Configuration et calibrage Volume Focal

Remarque : Le protocole suivant est écrit pour les expériences réalisées avec mEGFP/mEYFP et mCherry/mCardinal sur le laser scanning microscope confocal utilisée dans cette étude. La configuration optique, les paramètres du logiciel (lignes laser, miroirs dichroïques, filtres) et choix de colorants d’étalonnage peuvent être modifiées pour les autres configurations FPs et microscope.

1. Allumez le microscope et le laser au moins une heure avant l’expérience pour assurer la stabilité de laser et d’équilibrage de la température.
2. Préparer 100-200 µL des solutions appropriées colorant fluorescent soluble dans l’eau (voir la Table des matières pour des exemples) dans l’eau ou PBS pour calibrer le volume focal, avec des concentrations dans la gamme de 10 à 50 nM.
3. Placer les solutions de teinture sur un plat de fond verre propre 35 mm #1.5, c'est-à-dire ayant une épaisseur de 0,16-0,19 mm.
   NOTE : Idéalement, utilisez des plats avec couvercle en verre haute performance ayant une tolérance de faible épaisseur, par exemple, 0,170 ± 0,005 mm, ce qui permet une correction de bague collier optimal (étape 3.6). Il est important d’utiliser le même type de plat tel qu’utilisé plus tard pour les expériences suivantes.
4. Placer la capsule contenant la solution de colorant directement sur l’objectif (de préférence, immersion dans l’eau, avec NA 1.2) afin d’assurer la mise au point dans la solution. Vous pouvez également placer la capsule sur le porte-échantillon et le focus dans l’échantillon (par exemple, 10 à 20 µm au-dessus du fond du plat).
   Remarque : Nous ne recommandons pas l’utilisation d’objectifs de pétrole en raison du mauvais signal obtenu lorsque nous nous concentrons profond dans des échantillons aqueux.
5. Le chemin d’accès d’excitation et d’émission, par exemple, de choisir le laser à 488 nm, un miroir dichroïque de 488/561 nm, détection fenêtre 499-552 nm et une taille de trou d’épingle de 1 unité aérée (UA). Assurez-vous que la taille du trou d’épingle est le même que celui qui sera utilisé dans les mesures de corrélation croisée.
6. Ajustez la position de trou d’épingle (ajustement de trou d’épingle) et la bague collier objective afin de maximiser les taux de comptage. Dans ce but, tournez la bague collier jusqu'à ce que le taux de comptage maximale est détecté.
   NOTE : La correction de bague collier représente l’épaisseur spécifique du couvercle verre utilisé. Maximiser le taux de comptage, i.e., recueillant le plus grand nombre de photons par molécule que possible, est crucial pour maximiser le rapport signal-bruit (RSB) des mesures.
7. Effectuer une série de mesures (par exemple, 6 mesures à différents endroits, composées chacune de 15 répétitions de 10 s, c'est-à-dire 2,5 min Durée totale, échantillonné avec temps de pause de 1 µs ou moins) de la FCS point à la même puissance de laser que celui utilisé dans la corrélation croisée mesures (généralement ~ 1 %, c'est-à-dire, ~ 1-2 µW).
8. Ajuster un modèle de diffusion en trois dimensions dont une contribution de triplet (équation 6) aux données.
   Remarque : En règle générale, les temps de diffusion obtenues sont environ 30 µs et le facteur de structure est d’environ 4-8.
9. Calculer la taille w₀ du temps de diffusion moyenne mesurées et les valeurs publiées pour le coefficient de diffusion du colorant utilisé à température ambiante²⁵ selon l’équation 5. Valeurs typiques sont de 200 à 250 nm.
10. Répétez la routine de calibration (étapes 3,4-3,9) avec un colorant fluorescent différent pour un deuxième canal de détection si nécessaire (par exemple, 561 nm excitation et détection entre 570 nm et 695 nm). Gardez la position du trou d’épingle et la taille telle qu’elle a été définie pour la première chaîne de détection.
11. Calculer la luminosité moléculaire (équation 8) par les mesures d’étalonnage et stocker les valeurs obtenues.
    Remarque : Les valeurs typiques pour le programme d’installation utilisé sont ~8-10 kHz/molécule (MOL) pour 1,8 puissance d’excitation de µW à 488 nm. Plus faibles que les valeurs usuelles pouvant indiquer la poussière sur l’objectif, le désalignement de la configuration ou une sortie laser réduit. Vérifier et stocker les puissances de sortie du laser à l’objectif régulièrement à l’aide d’un wattmètre. Pour comparaison des configurations différentes, luminosité moléculaire normalisée par la puissance de laser d’excitation est le paramètre plus significatif pour évaluer la performance de microscope.

4. analyse spectroscopie de corrélation de Fluorescence : Acquisition

Remarque : Le protocole suivant est écrit pour les expériences réalisées avec mEGFP/mEYFP (« vert ») et mCherry/mCardinal (« rouge ») sur le microscope confocal à balayage laser utilisé dans cette étude. La configuration optique et les paramètres du logiciel (lignes laser, miroirs dichroïques, filtres) peuvent être différents pour les autres configurations FPs ou microscope.

1. Mettre en place le chemin optique, par exemple, 488 nm et une excitation 561 nm et un miroir dichroïque de 488/561 nm, sténopé sur 1 pour une excitation 488 nm. Pour éviter l’interférence spectrale, sélectionnez deux pistes séparées pour exciter et de détecter les mEGFP/mEYFP (488 excitation nm, canal vert) et mCherry / mCardinal (561 excitation nm, canal rouge) dans l’ordre et sélectionnez le commutateur suit chaque ligne. Pour la détection, utilisez les filtres appropriés pour les deux canaux, par exemple, 499-552 nm dans le canal vert et 570-695 nm dans le canal rouge.
2. Si excitation alternée n’est pas possible, utilisez les paramètres de filtre approprié pour le canal rouge afin de minimiser la diaphonie spectrale (c'est-à-dire détecter fluorescence mCherry/mCardinal pas en dessous de 600 nm). Cela peut réduire la quantité de photons détectés dans le canal rouge et ainsi réduire la SNR.
3. Placer la capsule contenant les cellules mixtes sur le porte-échantillon. Attendre au moins 10 min pour assurer l’équilibrage de la température et pour réduire la dérive de la mise au point.
4. Mettre l’accent sur les cellules à l’aide de transmission lumineuse dans le menu Rechercher .
5. Vous recherchez une paire de « rouge » et une cellule « verte » en contact avec l’autre. Pour la corrélation croisée positive ou homo-dimère, réglage de la luminosité (voir chapitre 2), recherche sur une cellule isolée émettant de fluorescence dans les deux canaux ou le signal de l’homo-dimère respectifs PM.
   NOTE : (Critique) Minimisez échantillon l’exposition tout en cherchant des cellules éviter le blanchiment préalable, qui peut réduire la corrélation croisée²⁶. Par conséquent, scan à la vitesse de balayage plus rapide et les pouvoirs de laser faible. Pour éviter la saturation du détecteur tout en imagerie exprimant fortement les cellules, une recherche en mode d’intégration. Toutefois, pour minimiser l’exposition, la numérisation à plus faibles puissances de laser est possible en mode comptage de photons .
6. Sélectionnez une perpendiculaire de chemin d’accès de scan de contact cellule-cellule (ou heures d’une seule cellule pour le contrôle de luminosité de corrélation croisée ou homo-dimère positif) en utilisant le bouton rogner , comme illustré dans les Figures 1 b et 2 a.
   Remarque : Certains microscopes anciens ne permettent pas de scan arbitraire directions. Dans ce cas, des contacts de cellules avec une orientation perpendiculaire à la direction de l’analyse doivent être situé.
7. Zoom pour atteindre une taille de pixel de 50-200 nm et sélectionnez ligne en Mode Scan. Taille de l’image la valeur 128 × 1 pixel.
   Remarque : Taille de pixel typique est de 160 nm, correspondant à une longueur de balayage d’environ 20 µm.
8. La valeur vitesse de numérisation jusqu'à la valeur maximale autorisée, par exemple, 472,73 µs par ligne.
   Remarque : Pour un mécanisme de rechange excitation, cela correspond à 954,45 µs de temps de scan, soit ~ 1000 scans/s sur la configuration utilisée. La vitesse de balayage peut être ajustée selon le coefficient de diffusion de la protéine d’intérêt. Pour les protéines ancrées à membrane, diffusion typique temps est autour de 10-20 m, le temps d’acquisition doit être au moins dix fois plus petit que les temps de diffusion. À basse vitesse de balayage peut induire photoblanchiment plus fort et nécessitent des puissances d’éclairage inférieurs. Alternativement, on peut imposer une pause, par exemple, 5 ms, entre chaque balayage diffusant très lentement complexes à l’aide de délai dans le sous-menu de Séries chronologiques .
9. Choisissez les puissances de laser approprié, par exemple, ~ 1-2 µW à 488 nm et ~ 5-10 µW pour une excitation 561 nm.
   Remarque : Des puissances supérieures de laser améliorer SNR, mais augmentent le photoblanchiment. Par conséquent, puissances de laser doivent être choisis tels que photoblanchiment est inférieure à 50 % du tarif compteur initial.
10. Sur les 100 000-500 000 Cycles .
    Remarque : Le nombre de balayages, savoir, la durée de la mesure, peuvent varier : mesure plus longs amélioreront SNR et peuvent être plus appropriés pour diffuser lentement les molécules, cependant, le mouvement des cellules et le photoblanchiment limitent la mesure maximale temps. Les données présentées ici ont été régulièrement acquises pour ~ 3-6 min, soit 200 000-400 000 ligne scans.
11. La valeur des détecteurs mode de comptage de photons . Appuyez sur Expérience de démarrage pour démarrer l’acquisition. Répétez les étapes 4,5-4.11 pour mesurer une autre cellule.
    Remarque : Il est recommandé de mesurer les 10-15 cellules par exemple à des niveaux d’expression différents. (Critique) Éviter la saturation de détecteur à des niveaux de haute expression. Le taux de comptage maximale ne doit pas dépasser environ 1 MHz.
12. Si l’analyse de luminosité est effectuée afin de déterminer les États oligomériques, effectuer des homo-dimère luminosité étalonnage mesures suivant étapes mis à jour le 4.1-4.11 : mesurer chaque protéine fluorescente homo-dimère séparément (dans les cellules isolées, établie à l’aide Protocole 2 de l’article) et effectuer des mesures que dans un seul canal spectral.

5. analyse spectroscopie de corrélation croisée de Fluorescence : Analyse des données

Remarque : Le protocole suivant fait suite à une mise en œuvre de la procédure d’analyse décrite en détail dans précédents articles^12,15. Le code du logiciel est disponible sur demande aux auteurs.

1. Exporter les fichiers de données brutes (p. ex., CZI) vers une image RVB TIFF au format de données brutes. Ce fichier contiendra une kymographes avec le vert et les données des canaux rouge, dans le chenal appelé G et R de l’image, respectivement.
2. Importer le fichier TIFF avec le logiciel d’analyse appropriée et procéder à l’analyse.
   Remarque : Les étapes suivantes (étapes de 5,3 à 5,7) sont appliquées séparément pour chaque canal :
3. Aligner les lignes en effectuant une moyenne de temps segment-wise ou mobiles avec des blocs de lignes 500-1000. Déterminer la position de la membrane, c'est-à-dire la position de pixel avec le taux de comptage maximale, dans chaque bloc. Mettez tous les blocs à la même position latérale. Cette procédure corrige pour un déplacement latéral du contact cellule-cellule, par exemple, en raison du mouvement de la cellule.
4. Résumer toutes les lignes alignées le long de l’axe du temps et correspondait au profil d’intensité moyenne à l’aide d’une fonction gaussienne. En présence d’importants antécédents intracellulaire, utiliser une gaussienne, plus une fonction sigmoïde. Définir les pixels correspondant à la membrane comme tous les pixels dans la ±2.5σ de la position de la membrane et les résumer l’intensité de ces pixels dans chaque ligne, l’obtention d’une valeur de signal de fluorescence unique pour chaque point dans le temps (c'est-à-dire, pour chaque analyse de ligne).
5. Le cas échéant (p. ex., fond > 10 % du signal membrane), appliquer une correction de fond en soustrayant l’intensité moyenne de pixel dans le cytoplasme multiplié par 2.5σ (en unités de pixels) de la fluorescence de la membrane, en blocs de 1000 lignes. Éviter des vésicules intracellulaires lumineuses lors de la sélection des pixels de l’arrière-plan.
6. Si on observe le photoblanchiment, appliquer une correction de blanchiment. Par conséquent, adapter la série de temps de fluorescence membranaire avec une fonction exponentielle double et applique la correction appropriée de l’équation 1 formule,¹⁶.
   Remarque : Vous pouvez également Fourier spectre basé correction régimes peuvent être appliquée²⁷. (Critique) Si photoblanchiment est présent mais pas corrigée pour, les SADC peuvent être sévèrement déformée et estimations des paramètres peuvent être fortement biaisées (par exemple, voir la Figure 5E).
7. Calculer l’ACFs et cadres de coopération selon les équations 2 et 3 en utilisant, par exemple, un algorithme de multiple-tau²⁸. Pour améliorer la fiabilité de l’analyse et éviter les artéfacts, effectuer les calculs pour les 10-20 segments égaux de la mesure totale. Inspecter les séries chronologiques de fluorescence et le CFs dans chaque segment et supprimer des segments clairement déformées (voir exemples dans la Figure 4 a- 4D). Moyenne de tous les segments sans distorsion.
   Remarque : Cette procédure peut être automatisée pour éviter un biais subjectif pour les données de²⁹. Pour les mesures très instables, ayant beaucoup de courts segments peut être utile. Toutefois, la longueur d’un segment soit encore au moins trois ordres de grandeur au-dessus de la durée de diffusion pour éviter statistique sous-échantillonnage erreurs^29,30,17.
8. Ajuster un modèle de diffusion bidimensionnelle, équation 4, aux SADC obtenu. Par conséquent, fixer le facteur de structure à la valeur obtenue en mesure de calibration (protocole, article 3). La précision de l’ajustement peut être améliorée en effectuant un ajustement pondéré en utilisant les poids statistiques de chaque point de données obtenues de l’algorithme de tau multiples.
9. Calculer le coefficient de diffusion à l’aide de la taille calibrée selon l’équation 7.
10. Calculer la luminosité moléculaire en divisant l’intensité de fluorescence moyenne dans chaque canal par le nombre de particules, équation 8 correspondant. Normaliser la valeur de luminosité déterminé dans chaque canal par la luminosité moyenne de la référence monomère correspondante pour obtenir l’État oligomère, prenant en compte non fluorescent FPs²³. À cette fin, déterminer les valeurs de luminosité moyenne homo-dimère unicolore analyse pour calculer la fraction non fluorescent FPs²³.
11. Calculer la corrélation croisée relative selon l’équation 9.

6. corrélation croisée nombre et luminosité : étalonnage du détecteur

Remarque : Le protocole suivant fournit une orientation générale concernant comment calibrer le système de détection. Cette procédure est obligatoire pour les systèmes de détection analogique, mais il n’est pas strictement nécessaire lorsqu’on utilise des détecteurs de comptage de photons vrai.

1. Faire sécher des solutions appropriées de colorant soluble dans l’eau (voir Table des matières par exemple) sur un plat de fond de verre de 35 mm. Définissez le chemin optique en conséquence, c'est-à-dire, 488 ou 561 nm excitation et détection à 499-552 nm ou 570-695 nm, respectivement.
   NOTE : En tant qu’alternativement, une surface métallique réfléchissante peut être utilisée au lieu de solutions de colorant séchées en plaçant le morceau de métal directement sur le dessus de l’objectif.
2. Mesurer une couleur N & B dans les régions avec des concentrations de teintes différentes ou à des puissances différentes. Par conséquent, utiliser Zoom pour atteindre une taille de pixel de 300 nm, vitesse de numérisation de définir temporisation pixel appropriées, par exemple, 25 µs et Cycles à 100-200 cadres.
3. Set de détecteurs de comptage de photons (ou mode analogique si les mesures sont réalisées avec détection analogique) et appuyez sur Expérience de démarrage pour démarrer l’acquisition. Effectuer la mesure à zéro puissance d’excitation afin de déterminer le décalage de l’intensité.
4. Tracer la variance pixel en fonction de l’intensité du pixel pour tous les pixels mesurées et effectuer un ajustement linéaire de ces données. Déterminer S comme la pente de l’ajustement linéaire. Calculer le bruit de lecture de l’ordonnée à l’origine, à l’aide de S et le décalage d’intensité déterminée selon l’équation 14.

7. la corrélation croisée nombre et luminosité : Acquisition

1. Suivez les étapes 4.1 à 4.4 du protocole d’acquisition de la sFCCS.
2. Permet de sélectionner une image de 512 × 128 pixels autour d’un contact de cellule-cellule (ou isolés PM pour contrôle de luminosité de homo-dimère) récolte et Zoom pour atteindre une taille de pixel de 50 à 100 nm.
3. Utilisez la vitesse de numérisation pour définir temporisation pixel appropriées, par exemple, 6,3 µs.
   Remarque : En N & B, le temps de pause de pixel devrait être beaucoup plus petit que le temps de diffusion de la protéine d’intérêt. Si un schéma d’excitation remplaçant est choisi, par ex., changement des pistes chaque ligne, le temps entre les deux pistes devrait être inférieur à l’heure de diffusion de la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire la corrélation croisée détectable est réduite.
4. La valeur de Cycles à 100-200 cadres.
   Remarque : Un nombre plus élevé de cadre améliorera le SNR, cependant, les mouvement cellulaire peut limiter la durée de la mesure totale. Le temps de scan par image devrait être beaucoup plus élevé que le temps de diffusion de la protéine d’intérêt. Sinon, la luminosité apparente est réduite, c'est-à-dire, les particules semblent être immobile. Complexes de diffus très lentement, impose une pause, par exemple, 2 s, entre les deux images à l’aide d’intervalle dans le sous-menu de Séries chronologiques .
5. Définir les puissances de laser des valeurs appropriées (valeurs typiques sont ~ 1-2 µW à 488 nm et ~ 5-10 µW pour une excitation 561 nm).
   Remarque : La cheftaine laser conduit à luminosité plus élevée et SNR amélioré, mais aussi amélioré photoblanchiment. Puissances de laser devraient être assez élevés pour atteindre une luminosité détectée d’au moins 1 ~ kHz/MOL mais maintenu assez bas pour éviter plus de photoblanchiment de 10 à 20 %. Pour mEGFP/mEYFP ou mCherry/mCardinal, à moins de 10 % le photoblanchiment sont généralement obtenus.
6. La valeur de détecteurs de comptage de photons (ou mode analogique si les mesures sont réalisées avec détection analogique). Appuyez sur Expérience de démarrage pour démarrer l’acquisition.
7. Évaluer le taux de comptage de photons. Si les taux de comptage en pixels contact cellule-cellule dépassent 1 MHz, réduire la puissance du laser ou sélectionner des cellules avec des niveaux d’expression. Répétez les étapes 7.2 à 7.7. pour mesurer la prochaine paire de cellules. Il est recommandé de mesurer les 10-15 cellules par expérience à des niveaux d’expression différents.
8. Si l’analyse de luminosité est réalisée afin de quantifier l’oligomérisation, effectuer des homo-dimère luminosité étalonnage mesures suivant étapes mis à jour le 7.1 à 7.7 : mesurer chaque protéine fluorescente homo-dimère séparément (dans les cellules isolées, établie à l’aide Protocole 2 de l’article) et effectuer des mesures que dans un seul canal spectral.

8. corrélation croisée nombre et luminosité : analyse des données

Remarque : Le protocole suivant fait suite à une analyse décrite précédemment procédure^12,31. Le code du logiciel est disponible auprès des auteurs sur demande.

1. Importer les données brutes (par exemple, les fichiers CZI peuvent être importés en utilisant le paquet de³² Bioformats). Moyenne de tous les cadres et sélectionnez une région d’intérêt (ROI) autour du contact cellule-cellule.
2. Effectuez une image alignement algorithme³³, par exemple, en maximisant la corrélation spatiale entre les ROIs dans les trames suivantes pour des traductions arbitraires latérales, en moyenne sur les deux canaux. Cette procédure permettra de corriger pour le mouvement latéral des cellules.
3. Appliquer un filtre de boxcar²² afin de réduire les fluctuations de longue durée de vie étrangères, provenant, par exemple, le mouvement cellulaire résiduel ou de blanchiment de fond. Par ailleurs, une méthode de redressement peut être appliquée pour corriger la photobleaching³⁴.
   Remarque : Si aucune analyse segment-wise ou dissociation est appliqué, l’éclat apparent peut être largement surestimé.
   1. Définir des segments coulissants de, par exemple, 8 et 15 cadres (par exemple, 1 à 8, 2 à 9 et ainsi de suite) et calculer les valeurs de luminosité de canal et de la corrélation croisée selon les équations 10, 11 et 15 un dans chaque segment. Si les détecteurs ne sont pas vrai photon comptant des détecteurs, prendre les paramètres du détecteur étalonné en compte lors du calcul de la luminosité, c'est-à-dire utilisation équations 12 et 13 au lieu de cela.
      Remarque : Calcul des valeurs de luminosité dans les segments de 8 à 15 images conduit à une sous-estimation de 10 à 20 % de la luminosité absolue et une surestimation de 10 à 20 % du nombre de particules. Néanmoins, les ratios de luminosité (par exemple, le dimère de luminosité monomère) ne sont pas affectés, aussi longtemps que la longueur du segment est maintenue constante tout au long de l’analyse (données non présentées). L’erreur statistique pour une longueur de segment donné peut être déterminée au moyen de simulations et ainsi corrigé.
   2. Moyenne des valeurs de luminosité obtenue pixel-wise sur tous les segments. Dans cette étape, on peut retirer le maximum et minimum 5 % des valeurs de luminosité de segment par rapport à la moyenne ou exclure segments qui montrent une déformation claire dans l’intensité, en raison, par exemple, une vésicule intracellulaire ou agrégat transitoirement présent dans ces pixels.
4. Tracer les valeurs de luminosité des pixels en fonction de l’intensité du pixel, puis sélectionnez la population de pixels qui correspond au contact cellule-cellule. Pixels de fond auront des valeurs de très faible intensité. À ce stade, ré-évaluer le taux de comptage maximale. Exclure les pixels avec le taux de comptage au-dessus de 1 MHz à prévenir les effets de carambolage.
5. Créer des histogrammes de luminosité channel et la corrélation croisée de cellule-cellule sélectionnée pixels contact et obtenir les valeurs de luminosité moyenne ROI. Normaliser la valeur de luminosité du canal moyen par la luminosité moyenne de la référence monomère correspondante pour obtenir l’État oligomère, prenant en compte non fluorescent FPs²³. Par conséquent, déterminer des valeurs de luminosité moyenne homo-dimère d’unicolore analyse pour calculer la fraction non fluorescent FPs²³.
6. À titre d’illustration, tracer des cartes de luminosité de canal et de la corrélation croisée.

Representative Results

Un premier test pour le test d’interaction protéine-protéine, c.-à-d., mélange de cellules exprimant des protéines fluorescentes spectralement distinctes suivies sFCCS/ccN & mesures B (Figure 1), doit être effectué sur les protéines qui ne sont pas censés interagir au contact cellule-cellule (par exemple, un contrôle négatif). Par conséquent, les cellules HEK 293 t exprimant myristoylated-palmitoylées-mEYFP (myr-palm-mEYFP) ou mCardinal - ont été mélangés, et le sFCCS a été réalisée au travers le contact de cellule-cellule (Figure 2A). Dans un cas idéal, le signal de fluorescence dans chaque canal est censé pour fluctuer autour d’une moyenne stable, par suite de la motion par diffusion des protéines dans le PM et les variations statistiques du nombre de protéines dans le volume focal. Pour les protéines qui n’interagissent pas, les fluctuations dans les deux voies sont indépendantes les uns des autres et, par conséquent, la corrélation croisée spectrale devrait fluctuer autour de zéro. En effet, une corrélation croisée relative proche de zéro a été observée dans les mesures typiques (Figure 2C). L’ACFs montrent des périodes d’affaiblissement caractéristique de ~ 10 à 20 ms (correspondant, en moyenne, D_myr-palm = 1,3 ± 0,3 µm2/s (moyenne ± écart-type, n = 20 cellules)), comme prévu pour la diffusion de myr-palm-mEYFP et - mCardinal dans la MP, par exemple, D_myr-palm = 0,88 ± 0,11 µm2/s (moyenne ± SEM) basé sur la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) expériences³⁵. Notamment, ces dynamiques plutôt lents permettent l’utilisation d’un système d’excitation alternance, c'est-à-dire passer seulement excitation rouge verte et seulement et détection chaque ligne, entraînant ainsi des délais ~0.5 ms entre les signaux dans les deux voies, mais suppression interférence spectrale. En moyenne, une très faible corrélation croisée moyenne de ± 0,08 0,10 (moyenne ± écart-type, n = 17 cellules) a été obtenue pour le témoin négatif (Figure 3E), comme prévu.

Ensuite, un témoin positif de corrélation croisée a été utilisé pour calibrer la corrélation croisée possible maximale dans la configuration optique. Par conséquent, la membrane ancrées hétéro-dimères myr-palm-mCardinal-mEYFP a été exprimé dans des cellules HEK 293 t et sFCCS mesures ont été effectuées sur des cellules individuelles (Figure 2B). Les cadres de coopération obtenues avait amplitudes positives et a montré des périodes d’affaiblissement similaire comme l’ACFs, encore ~ 10 à 20 ms (Figure 2D). En moyenne, une corrélation croisée relative de 0,96 ± 0,18 (moyenne ± écart-type, n = 14 éléments) a été mesurée pour le contrôle positif (Figure 3E).

Figure 2 . Analyse des mesures de contrôle d’intercorrélation spectroscopie de fluorescence. (A) des images représentatives de mixte HEK 293 t cellules exprimant myr-palm-mEYFP /-mCardinal comme contrôle négatif pour les interactions de trans . La flèche jaune indique les sFCCS scan chemin. Barreaux de l’échelle est de 5 µm. (B) images représentatives des cellules HEK 293 t exprimant myr-palm-mCardinal-mEYFP hétéro-dimères (gauche : couche verte, droite : canal rouge) comme contrôle positif de corrélation croisée. La flèche jaune indique les sFCCS scan chemin. Barreaux de l’échelle est 5 µm. (C) représentant CFs (vert : ACF dans le canal vert (mEYFP), rouge : ACF dans le canal rouge (mCardinal), bleu : CCF) obtenues en sFCCS des mesures de contrôle négatif. Lignes pleines montrent s’adapte d’un modèle de diffusion bidimensionnelle à la SFC. (D) représentant CFs (vert : ACF dans le canal vert (mEYFP), rouge : ACF dans le canal rouge (mCardinal), bleu : CCF) obtenu en sFCCS mesure du contrôle positif. Lignes pleines montrent s’adapte d’un modèle de diffusion bidimensionnelle à la SFC. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La pertinence de ce test a été ensuite étudiée dans un contexte biologiquement pertinent en sondant les interactions trans de la protéine amyloïde de précurseurs comme 1 (APLP1), un type j’ai une protéine transmembranaire qui a été proposée d’agir comme une adhésion neuronale récepteur. Dans ce but, APLP1 fusionné au mEYFP ou mCardinal a été exprimé dans des cellules HEK 293 t. Pour exclure des interférences avec les domaines de liaison extracellulaire, les FPs ont été fusionnés à l’extrémité C-terminale de la APLP1, c'est-à-dire, au niveau du domaine intracellulaire (voir Figure 1A). Puis, sFCCS mesures ont été effectuées sur les contacts de cellules entre APLP1-mEYFP et APLP1-mCardinal exprimant des cellules (Figure 3A), d'où ACFs et CCP (Figure 3-C) qui fournit des informations sur la diffusion de APLP1 et les interactions. Une corrélation croisée relative positive de 0,45 ± 0,21 (moyenne ± écart-type, n = 17 cellules) a été observée, c'est-à-dire une valeur nettement supérieure à celle du contrôle négatif (Figure 3E). Fait intéressant, la corrélation croisée relative moyenne était inférieure à celle du contrôle positif (Figure 3E), indiquant la liaison partielle trans .

Enfin, le test a été utilisé pour montrer que les ions zinc facilitent renforcée APLP1 trans lie^12,31. Le sFCCS SFC obtenue des mesures dans l’ensemble de clusters de APLP1 au contacts de cellule-cellule (caractérisées par une forte co-localisation des APLP1-mEYFP-APLP1-mCardinal et formant rapidement en présence d’ions de zinc, Figure 3B) a montré fortement dynamique réduite, telle qu’elle apparaît de périodes d’affaiblissement important et les oscillations à grand décalage fois (Figure 3D). Néanmoins, l’analyse des amplitudes à temps de latence courte a révélé une augmentation significative de la corrélation croisée relative à 0,8 ± 0,3 (moyenne ± écart-type, n = 17 cellules), c'est-à-dire, environ 80 % du maximum calibré (Figure 3E). Il est à prévoir que telle dynamique lente induire de graves distorsions des courbes corrélation (voir Figure 3D) raison du nombre limité d’événements diffusifs qui peuvent être détectés pendant le temps de mesure finie, induisant des particules que l'on appelle le bruit de³⁰. Pour une quantification précise, le temps de latence maximale doit être au moins 3 ordres de grandeur plus haut le temps de diffusion (voir précédent commentaires sur^30,17 pour plus de détails).

La luminosité moléculaire de le sFCCS APLP1 de données a été analysée plus loin, le contrôle négatif de myr-palm en utilisant comme référence monomère dans chaque canal et correction pour la quantité de protéines fluorescentes²³. Lors de l’addition d’ions zinc, la luminosité moléculaire a significativement augmenté de petites oligomères (~ dimères) aux plus grands multimères consistant en ~ 10-50 monomères sur chaque cellule (Figure 3-F). Ainsi, en moyenne, jusqu'à ~ 100 APLP1 monomères sont présents dans un groupe de protéines entières sur la jonction des cellules.

Figure 3 . Analyse des mesures de spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence des interactions APLP1 à contacts cellule-cellule. (A, B) Les images représentant des cellules HEK 293 t exprimant APLP1-mEYFP (vert) / APLP1-mCardinal (rouge) avant (A) et 30 min après zinc traitement ion (B, cellules différentes). Les flèches jaunes indiquent que les sFCCS scan chemins. Barreaux de l’échelle est 5 µm. (C, D) représentant CFs (vert : ACFs dans le canal vert (mEYFP), rouge : ACFs dans le canal rouge (mCardinal), bleu : CCFs) obtenu en sFCCS mesures pour APLP1 (C) avant le traitement ion zinc et (D) après traitement de l’ion de zinc. Les lignes pleines montrent s’adapte d’un modèle de diffusion bidimensionnelle pour les diagrammes en boîte SFC. (E) de corrélation croisée relative a obtenu de sFCCS analyse de contrôle négatif (« négatif »), APLP1 en absence et en présence d’ions de zinc et positif contrôle de la corrélation croisée (« positive »). Diagrammes montrent les valeurs médianes et les moustaches allant de minimum aux valeurs maximales. (F) Box parcelles normalisée éclat moléculaire dans le canal vert (mEYFP) obtenue de l’analyse de sFCCS des APLP1 à contacts cellule-cellule en absence et en présence d’ions de zinc. Les valeurs de luminosité ont été corrigées pour mEYFP non fluorescent basée sur des mesures de myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimères exprimés dans les cellules 293 t HEK, mesurées dans les mêmes conditions²³SCTS-m. Diagrammes montrent les valeurs médianes et les moustaches allant de minimum aux valeurs maximales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Toutes les cotes indiquées jusqu'à présent ont été corrigées pour les fluctuations supplémentaires, parasites qui se produisent dans les cellules qui, si ne pas pris en compte, rendrait difficile l’analyse de sFCCS. Pour le témoin négatif, par exemple, ces peuvent provoquer une intercorrélation faux-positifs, si aucun schémas de correction ne sont appliquées. Deux grands processus peuvent altérer gravement le CFs sont : 1) instabilités dans la fluorescence enregistrée du signal due à des vésicules intracellulaires qui transitoirement entrez le volume focal ou ralentissent la dynamique de la membrane, par exemple, dérive dans z-direction et 2) photoblanchiment. Pour identifier une certaine instabilité transitoire, il est recommandé de diviser les mesures complets en segments de tailles de 10-20 et d’inspecter visuellement les séries chronologiques intensité et CFs dans chaque segment. Cette procédure est illustrée dans la Figure 4, qui donne un exemple des segments clairement déformées obtenus dans l’analyse d’une mesure de contrôle négatif. Un CCF ayant des valeurs négatives (Figure 4B, le segment 1) peut entraîner une certaine instabilité transitoire (Figure 4A, traces de l’intensité des segments 1 et 2) ou une haute faussement positif corrélation croisée (Figure 4B, segment 2). En règle générale, ces instabilités sont visibles dans la série d’intensité comme des variations de signal lente (Figure 4A). Le SCF correspondant s’écartent généralement fortement de la SCF de la plupart des segments, affichant, par exemple, supérieur amplitude et périodes d’affaiblissement beaucoup plus lents sur le ~ deuxième échelle (voir Figure 4 b-4D). Il est recommandé de retirer ces segments de l’analyse et pour calculer le SCF final par une moyenne de tous les segments sans distorsion, c'est-à-dire, de segments caractérisés par SFC n’écartent ne pas en général, la majorité des SADC. cela se fait dans un graphique interface en examinant 1) de manière itérative les segments, 2) supprimant clairement déformée de segments à partir de la moyenne et 3) inspectant le SCF de restant segmente en ce qui concerne le SCF moyens actualisé de segments qui n’étaient pas supprimés. En appliquant cette procédure, les mesures longues partiellement déformées (Figure 5A), montrant lentement en décomposition (corrompu) la SFC (Figure 5B) ont été corrigées avec succès et les courbes de corrélation significative sont récupéré (Figure 5C). Généralement, cette procédure de correction peut être automatisée²⁹, évitant une inspection visuelle de l’utilisateur, qui peut-être être sujette à un biais subjectif. En comparaison de l’intensité de la fonction filtrage méthodes³⁶, dans lequel les petits bacs de la mesure sont évaluées basées sur leur intensité par rapport à l’intensité moyenne de la pleine mesure et enlevée si supérieure à un paramètre de seuil, le décrit procédure ne dépend pas des paramètres externes et est sensible également à des instabilités mineures.

Afin de compenser le photoblanchiment, la correction mathématique décrite, l’équation 1, a été appliquée. En général, photoblanchiment peut être identifié par une décroissance exponentielle des signaux de fluorescence (Figure 5D), qui domine le SCF, qui ensuite montrer un faux-positif corrélation croisée et temps de désintégration sur le ~ échelle min (voir la forme de la courbe typique dans la Figure 5E). La procédure de correction récupéré du SCF sans distorsion (Figure 5F). Comme déjà mentionnée, de même intensité variations au sein de mesures simples peuvent être causées par le mouvement PM, par exemple, z-dérive ou grandes structures qui se déplace lentement. Cependant, si semblables désintégrations exponentielles apparaissent dans toutes les mesures, photoblanchiment sera la source la plus probable. En général, systèmes de correction peuvent être combinés, par exemple, intensité filtrage, CF base de filtrage et autres méthodes telles que la transformation de Fourier basé filtrage des variations de signal lente fréquence espace²⁷.

Figure 4 . Segment-Wise analyse de l’analyse des mesures de spectroscopie de corrélation de fluorescence de contrôle négatif de la corrélation croisée. (A) intensité de la Fluorescence en vert (F₁) et la couche rouge (F₂) des deux segments de temps différents (chaque mesure a été analysée dans 20 segments de ~ 20 s de chaque), obtenu de la sFCCS mesure de contrôle négatif. (B) cadres de coopération de chacun des 20 segments. Les cadres de coopération pour les segments 1 et 2 sont mises en évidence en rouge et orange, respectivement. (C, D) ACFs de chaque segment en vert (C) et rouge (D) canal. L’ACF pour les segments 1 et 2 est mises en évidence en rouge et orange, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 . Perturbations dans l’analyse des mesures de spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence à contacts cellule-cellule, illustrées pour contrôle négatif de la corrélation croisée. (A) séries fluorescence complet pour une mesure exemplaire en vert (F₁) et la couche rouge (F₂). Les lignes rouges solides représentent un ajustement exponentiel double de la série temporelle dans chaque canal. (B, C) CFs (vert : ACFs dans le canal vert, rouge : ACFs dans le canal rouge, bleu : CCP) de la fluorescence série temporelle montrée A, calculée par (B) corréler la mesure entière ou (C) corrélant 20 segments séparément et en moyenne la moins déformée SCF de ~ 80 % (couche verte) et environ 50 % (canal rouge) des segments. Les lignes pleines représentent ajustement d’un modèle de diffusion bidimensionnelle aux données. (D) série de fluorescence plein temps et ajustement exponentiel double (lignes rouges solides) de mesure caractérisé par le blanchiment substantielle en vert (F₁) et la couche rouge (F₂). (E, F) CFs (vert : ACFs dans le canal vert, rouge : ACFs dans le canal rouge, bleu : CCP) de la fluorescence série temporelle montrée D, calculée en (E) corréler la mesure entière ou (F) appliquer la correction de blanchiment, l’équation 1, corrélation entre 20 segments séparément et en moyenne le SCF moins déformé de ~ 90 % (les deux canaux) des segments. Les lignes pleines représentent ajustement d’un modèle de diffusion bidimensionnelle aux données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Comme une approche complémentaire à sFCCS, ccN & B (Figure 1C) peuvent être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine après mélange de la cellule. Contrairement à sFCCS, ccN & B ne fournit aucune information sur la dynamique des protéines, mais permet de mesurer les interactions trans le long du contact de cellule-cellule entière dans un plan focal. Mesures sur des échantillons de APLP1 ont été effectuées avant et après traitement avec 50 µM ZnCl₂, ainsi que sur le contrôle négatif myr-palm. Ces mesures sont sensibles aux mouvements cellulaires, en particulier pour les échantillons d’ion traitée zinc, exigeant des délais d’acquisition prolongée pour tenir compte de la dynamique lente des grappes APLP1. Par conséquent, un algorithme d’alignement image a été mis en œuvre pour corriger les mouvements latéraux de la cellules³³. En outre, un wagon couvert filtres²² (8 cadres boîte taille, ~ 5 s) a été appliqué pour éliminer les fluctuations de basse fréquence des signaux mesurés. Cette procédure est très similaire à d’autres filtres utilisés dans l’analyse N & B impliquant des locaux avec une moyenne de³⁷ ou dissociation^18,34, mais conserve les données d’origine sans modification, c'est-à-dire, les pixels sont traitées indépendamment et sans en moyenne ou soustraction des signaux est effectuée. Cette procédure supprime efficacement les fluctuations à long terme sur des échelles de temps plus longues que la case taille²². Suite à l’analyse de ces données, les valeurs de luminosité de la corrélation croisée de tous les échantillons ont été comparés par mise en commun de tous les pixels de contact cellule-cellule dans un histogramme de luminosité de corrélation croisée. Pour APLP1 en l’absence d’ions zinc (Figure 6 a et 6D), une moyenne positif B_cc de 0,068 ± 0,004 (moyenne ± SEM, n = 18 cellules) a été observée. Après l’addition d’ions zinc (Figure 6B et 6E), la valeur de_cc B a augmenté à 0,266 ± 0.006 (moyenne ± SEM, n = 19 cellules). Pour le contrôle négatif (Figure 6C et 6F), une luminosité de corrélation croisée moyenne inférieure a été détectée (B_cc = 0.022 ± 0,002, moyenne ± et, n = 26 cellules). Pour estimer la stoechiométrie des complexes APLP1 à contacts cellule-cellule, la luminosité de la APLP1-mEYFP a été normalisée à l’aide de la valeur moyenne obtenue pour myr-palm-mEYFP (i.e., témoin négatif) et corrigée pour le montant non fluorescent ²³de protéines. En accord avec les données de sFCCS, la distribution de la luminosité était centrée autour d’une valeur correspondant aux dimères (Figure 6G), en l’absence d’ions de zinc, ce qui suggère une moyenne 2,2 stoechiométrie. Après traitement de zinc d’ion, la luminosité normalisée fortement déplacée vers des valeurs plus élevées, allant de ~ 10 à ~ 60 (Figure 6H), c'est-à-direstoechiométries d’au moins 10:10 ou plus, à nouveau en bon accord avec les données de sFCCS.

Figure 6 . Mesures de nombre et de la luminosité intercorrélation des interactions APLP1 à contacts cellule-cellule. (A-C) Représentant ccN & B image images des contacts de cellules entre APLP1-mEYFP et APLP1-mCardinal des cellules HEK 293 t exprimant sans (A) et de zinc (B) les ions ou myr-palm-mEYFP et myr-palm-mCardinal exprimant cellules comme négatif contrôle de la corrélation croisée (C). Barreaux de l’échelle est 5 µm. (D-F) histogrammes de luminosité (B_cc) de corrélation croisée de pixels tout examinés et cellules provenant de la ccN et B analyse de contacts de cellules dans des échantillons de APLP1 (D), imprégnées de zinc APLP1 échantillons () E) et les échantillons contenant myr-palm-mEYFP et myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normalisée des histogrammes de luminosité des échantillons de APLP1 (G: sans ions zinc, H: avec des ions de zinc) pour le canal vert (mEYFP) obtenu par l’analyse de la luminosité des mêmes cellules et ROIs servant au calcul de B_cc. Encart dans G montre un grossissement dans la gamme de luminosité normalisée de -2 à 10. Les valeurs de luminosité ont été corrigées pour mEYFP non fluorescent basée sur des mesures de myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimères exprimés dans les cellules 293 t HEK, mesurées dans les mêmes conditions²³N & B. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Afin d’effectuer la ccN & B analyse, un étalonnage minutieux des détecteurs doit être effectué. Pour le montage expérimental utilisé dans cette étude, la nécessité d’une telle un étalonnage est apparente lorsque la luminosité moléculaire a été analysée dans les échantillons fixes (c'est-à-dire, en l’absence de fluctuations de numéro). Dans ce cas, la luminosité moléculaire devrait être zéro selon l’équation 10, étant donné que l’écart ne doit uniquement provenir de bruit du détecteur. Toutefois, lorsqu’un ROI qui contient uniquement les pixels de fond (immobile) a été analysée (Figure 7A et 7 b), une luminosité positive de ~0.1 cts./(MOL x dwell time) a été déterminée. Une valeur similaire a été obtenue N performant & mesures B des cellules HEK 293 t exprimant mCherry glycosylphosphatidylinositol (GPI-mCherry, Figure 7C) avec différents laser pouvoirs et en extrapolant la luminosité moléculaire mesurée à nulle puissance du laser. Pour corriger cet effet, nous avons effectué un étalonnage systématique du détecteur, comme indiqué précédemment (voir équation 12)^19,20. Nous avons donc mesuré la variation en fonction du taux de comptage du détecteur sur un échantillon consistant en une solution de colorant fluorescent séchées et déterminé les paramètres S, et le décalage taux sombre. Ce dernier a été obtenu de la mesure de l’intensité à zéro puissance laser et a été, dans notre cas, négligeable. D’un ajustement linéaire de la variance versus intrigue d’intensité, nous avons déterminé, conformément à l’équation 14, une pente de S = 1.1 et un bruit de lecture négligeable. Les valeurs déterminées (S = 1,1, = 0, décalage = 0) ont ensuite été utilisés pour calculer correctement la luminosité moléculaire et nombre selon les équations 12 et 13¹⁹. Alternativement, un système de correction plus empirique peut être appliqué basée sur le fait qu’un bruit de détecteur de superpoissonian, c'est-à-dire, environ 10 % de bruit plu que poissonnienne tourné bruit, expliquerait aussi l’observation d’un éclat moléculaire positive dans pixels sans fluctuations numéros. À l’aide de cette hypothèse, la luminosité déterminée de ~0.1 cts./(MOL x dwell time) dans ces pixels peut être considérée comme une luminosité constante compensée et devrait donc être déduite de toutes les valeurs de luminosité calculés avec l’équation 10. Surtout, ont décrit les approches plomb aux mêmes résultats lors du calcul des ratios de luminosité, aussi longtemps que et offset sont négligeables. Il est à noter que parmi les différents microscopes du même type (même fournisseur, même modèle, GaAsP détecteurs en mode de comptage de photons) différentes valeurs de S ont été observées, en soulignant la nécessité d’un étalonnage du détecteur attentif sur chaque installation individuelle.

Un plus important paramètre influant sur les performances du détecteur dans les mesures de luminosité est le temps mort du détecteur. Comme il a été démontré précédemment, le temps mort du détecteur peut réduire considérablement la luminosité moléculaire détectée, même à des taux de comptage moyenne (au-dessus de²-10 10³ kHz)³⁸. Pour éviter cet artefact, mesures doivent être effectuées soit à des taux inférieurs de comte, ou le temps mort doit être étalonné basée sur l’exécution des N & B ou FCS dans une série de dilutions de, par exemple, EGFP dans la solution tampon. Puis, taux de comptage mesurés peuvent être corrigées à l’aide d’un temps mort calibré³⁸. Pour la configuration utilisée dans cette étude, tel un étalonnage à l’aide de N & B sur les solutions de colorant dilué ont révélé des valeurs de luminosité moléculaire stable jusqu'à des taux de comptage de ~0.5 MHz et un temps mort correspondant de ~ 6 ns (Figure 7E). La diminution à des taux plus élevés de comte peut être ainsi corrigée à l’aide d’une correction publiées antérieurement formule³⁸, résultant en une valeur de luminosité constante de ~ 8 kHz/MOL.

Figure 7 . Étalonnage du détecteur pour l’analyse de nombre et de la luminosité. (A) image représentative des mesures N & B des cellules HEK 293 t exprimant GPI-mCherry. Un retour sur investissement (rectangle en pointillé bleu) a été sélectionné à l’arrière-plan. (B) histogramme de luminosité du Pixel de tous les pixels correspondant au ROI montré à A. La luminosité moyenne pixel, obtenue à partir d’ajustement de l’histogramme de luminosité des pixels avec une fonction gaussienne, est ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Des données ont été acquises à temps de pause pour le pixel 25 µs. (C) luminosité moléculaires obtenue par l’analyse N & B de GPI-mCherry exprimé dans les cellules HEK 293 t, mesurée à trois puissances différentes (6 cellules chaque, 561 excitation nm, temps de pause pour le pixel 25 µs). Données sont affichées en moyenne ± SD Une régression linéaire (ligne rouge) fournit une valeur de décalage de 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) emplacement de la variance de pixel en fonction de l’intensité des pixels de mesures N & B d’une solution séchée d’un colorant fluorescent (excitée à 561 nm), mise en commun de tous les pixels de plusieurs mesures dans différentes régions de l’échantillon. La ligne rouge pleine indique un ajustement linéaire des données, ce qui entraîne une pente de 1.1, fournissant le facteur S de l’étalonnage du détecteur. Luminosité moléculaire (E) en fonction du taux de comptage de détecteur, obtenue à partir des mesures N & B de solutions diluées de fluorophore (excitée à 488 nm). Une correction publiées antérieurement schéma³⁸ a été appliqué à l’aide de différentes valeurs possibles pour le temps mort du détecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La procédure expérimentale décrite ici permet l’étude des protéines des interactions trans à contacts de cellule-cellule, employant des techniques de spectroscopie par fluorescence fluctuation, à savoir sFCCS et ccN & B. Ces méthodes impliquent une analyse statistique des variations de fluorescence émise par deux FPs spectralement séparés fusionnés pour les protéines d’intérêt au contact de deux cellules voisines, chacune exprimant l’un ou l’autre protéine de fusion. La présence de complexes trans est quantifiée en sondant le degré de diffusion co des protéines en PMs voisines. En plus des protocoles détaillés sur la préparation des échantillons, acquisition de données et d’analyse, cet article fournit des preuves expérimentales de l’application réussie de l’essai sur la protéine neuronale APLP1. Nous montrons que la APLP1 subit spécifiques, interactions homotypiques trans contacts cellule-cellule. En outre, des ions de zinc promouvoir la formation d’amas de APLP1 à des contacts de cellules qui fournissent une plate-forme multivalente trans interactions et, ainsi, induisent la liaison améliorée trans .

Contrairement à précédentes analyses pour détecter de telles interactions basées sur des méthodes biochimiques perturbateur⁶, l’approche présentée peut être effectuée directement sur les cellules vivantes, sans nécessité de la fixation ou l’isolement de complexes protéiques. En outre, il donne spécificité moléculaire par détection de protéines fluorescentes génétiquement fondue à la protéine d’intérêt, contrairement à précédentes analyses qualitatives^8,9. Différemment d’autres approches de fluorescence basé comme frette¹⁰ et fluorescence complémentation¹¹, il n’y a aucune exigence pour les étiquettes fluorescentes à localiser du côté extracellulaire (potentiellement interférer avec interactions de protéine-protéine). Néanmoins, il est à noter que FPs C-terminal pourrait encore modifier la liaison aux composants intracellulaires, par exemple, les protéines d’adaptateur qui négocient des interactions avec le cytosquelette. Notamment, l’essai est applicable à la fois homo - et interactions hétérotypiques.

Quelques exigences pour une application réussie de l’essai présenté sont à noter. Les méthodes de fluctuation de fluorescence effectués reposent sur des mesures temporelles nécessitant lumineux et photostable monomère FPs, ce qui constitue un obstacle majeur pour beaucoup de FPs rouge²³. Même si le système de balayage présenté est particulièrement bien adapté pour l’étude de la dynamique lente des protéines transmembranaires, qui sont généralement impliqués dans les interactions cellule-cellule, photoblanchiment résiduel peut-être encore se produire. Par conséquent, nous présentons une description détaillée des programmes de correction, c'est-à-dire une correction blanchiment pour filtre sFCCS et wagon couvert pour le ccN chambres d’hôtes, qui réduisent au minimum les perturbations. En outre, nous discuter des algorithmes d’alignement numérique qui corrigent efficacement des autres perturbations systématiques, comme le mouvement latéral des cellules et donner des directives pour supprimer une certaine instabilité transitoire. Une source majeure de ces instabilités est transport vésiculaire, c.-à-d. intracellulaire vésicules transportant la protéine d’intérêt que transitoirement entrez le volume focal. Bien que variant au cas par cas, ce phénomène peut en général gravement perturber l’analyse et acquisition de données. Toutefois, l’application d’algorithmes de correction améliore la stabilité de l’acquisition, ce qui permet de mesure élargie fois qui sont nécessaires pour sonder la particulièrement dynamique par diffusion lente. À cet égard, il faut souligner que la présence de diffusion dynamique est une condition essentielle de la méthode fonctionne. L’exemple de l’ion zinc médiée APLP1 clustering montre un exemple drastique des complexes de protéine importante, très lent (D/s ≈ 0,001 µm²) qui poussent la technique à ses limites et éviter une quantification précise de la dynamique sous-jacente, à cause du grand bruit induite par l’acquisition limitée temps^30,17.

Dans ce contexte, les progrès récents sur peignage SCTS-m et Super-résolution approches, par exemple, balayage émission stimulée appauvrissement FCS (STED-FCS), peuvent être bénéfiques en fournissant une plus petite focale volume et donc plus petite diffusion efficace fois^{39 ,},⁴⁰. Cela pourrait aussi contribuer à résoudre les amas de protéines dans le cas d’une localisation inhomogène de la protéine d’intérêt dans les contacts de cellule-cellule, tel qu’observé pour APLP1 en présence de zinc. Malheureusement, une implémentation de la corrélation croisée de numérisation STED-FCS, c.-à-d. STED-FCC, qui pourrait être appliquée directement ici, n’a pas été correctement démontrée encore en raison de la difficulté de trouver des colorants compatibles pour deux couleurs STED-FCS. Dans le cas de la dynamique suffisamment rapide (D ≥ ~0.05 µm2/s), analyse de sFCCS permet de quantifier la diffusion des protéines à contacts cellule-cellule ou dans d’autres régions de la PM¹².

En outre, une analyse de luminosité peut être effectuée pour toutes les données (sFCCS et ccN & B), fournir une estimation de la stoechiométrie des trans complexes protéiques. Il convient de mentionner que l’exactitude de la quantification de la stoechiométrie augmente avec la quantité de protéines qui se lient en trans (c'est-à-dire, s’il y a seulement quelques complexes cis qui pourraient aussi affecter la détermination de la luminosité). Analyse de luminosité ne permet pas de résoudre les mélanges de différents États d’oligomères, monomères e.g.,cis et trans tétramères. Plus en général, il convient de noter que le N & B ne peut pas résoudre des mélanges de différentes espèces d’oligomères distribuées de façon homogène dans un échantillon. Si plusieurs espèces sont présentes dans un pixel, une seule valeur de luminosité sera mesurée (c.-à-d., une moyenne pondérée de la luminosité de chaque espèce oligomérique). La distribution statistique des valeurs observées de luminosité (par exemple, en différents pixels) n’est pas directement reliée à la quantité relative de l’espèce oligomérique. Pour résoudre ces mélanges, autres méthodes doivent être utilisées (p. ex., intensité spatiale distribution analyse (SpIDA)⁴¹, photon counting histogramme (PCH)⁴²). De même, la quantification de la corrélation croisée spectrale en sFCCS fournit une quantification précise de la fraction des protéines liées et non liées uniquement pour les stoechiométries simples et connus, par exemple, 1:1. Pour une stoechiométrie plus complexe, plus des hypothèses doivent être prises à⁴³. Dans l’ensemble, l’analyse luminosité reste un puissant outil expérimental, si le système de détection et de la fraction de FPs non fluorescent sont calibrés²³ tel que décrit dans les protocoles.

Bien que la demande présentée ici se concentre sur les interactions protéine-protéine dans les cellules adhérentes, l’essai peut être appliqué à un large éventail d’échantillons, par exemple, cellules en suspension. Pour de tels systèmes, correction de mouvement latéral cellulaire pourrait être particulièrement cruciale. En outre, il peut être facilement appliqué pour modéliser des systèmes membranaires telles que GUVs ou GPMVs, ce qui permet la quantification des interactions moléculaires dans des conditions bien contrôlées, par exemple, les compositions de différents lipides ou membranes manque organisée cytosquelette. Lors de l’exécution sFCCS sur ces vésicules, mouvement vertical peut causer des fluctuations de signalisation supplémentaires, mais peut être réduit lorsqu’on se concentre sur les grandes vésicules. Dans ce contexte, plusieurs combinaisons sont prometteurs, par exemple, GUV- / GPMV-cellule mélanger¹². Comme indiqué dans une publication récente, la formation des synapses immunitaires peut être modélisée avec succès de tels systèmes⁴⁴. Ainsi, l’analyse présentée sera certainement utile pour l’étude d’une grande variété d’interactions cellule-cellule.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110