Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Abstract

מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כרוך תא-תא אינטראקציות, מתווך בדרך כלל על ידי חלבונים המקיימים אינטראקציה בין תאים שכנים. עניין, רק כמה מבחני מסוגלים במיוחד חיטוט כזה אינטראקציות ישירות בתאים חיים. כאן, אנו מציגים assay כדי למדוד את הכריכה של חלבונים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הסמוכים, תא-תא באנשי קשר. Assay זו מורכבת משני שלבים: ערבוב של תאים המבטאים את החלבונים עניין התמזגו חלבונים שונה פלורסנט, ואחריו קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה מדידות-תא-תא אנשי קשר באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. נדגים את הכדאיות של זה וזמינותו בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי מודד את האינטראקציה של החלבון קודמן דמוי עמילואיד 1 (APLP1) על פני תאים תאים צמתי. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט על רכישת נתונים באמצעות טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה, קרוס-קורלציה למספר וניתוח בהירות) את הכיול כלי הנדרש. יתר על כן, נדון שלבים קריטיים ניתוח הנתונים וכיצד לזהות ולפתור וריאציות אות חיצוני, כדין, כגון אלה עקב photobleaching או תא תנועה.

באופן כללי, וזמינותו הציג ישימה לכל הומו - או אינטראקציית חלבון heterotypic תא-תא באנשי קשר, בין תאים סוגים זהים או שונים, יכול להיות מיושם על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. דרישה חשובה היא היציבות של המערכת, אשר צריך להיות מספיק לחקור דינמיקה דיפוזיה של החלבונים עניין במשך מספר דקות.

Introduction

תהליכים ביולוגיים רבים להתרחש בכל האתרים של תא-תא אינטראקציות, למשל, תא-תא אדהזיה1,2,3, תא-cell fusion4 וזיהוי הסלולר5. אירועים כאלה חשובים במיוחד במהלך הפיתוח של אורגניזמים רב תאיים, תקשורת, למשל, במהלך תגובות מערכת החיסון. תהליכים אלה הם בדרך כלל בתיווך חלבונים אשר מותאמים על פני השטח, קרי, ב קרום פלזמה (PM) של תאים שכנים ומבצעת אינטראקציות ספציפיות-הקשר תא-תא כי הם בדיוק הזמן והמרחב מוסדר. במקרים רבים, אינטראקציות אלה ישירה הומו - או אינטראקציות חלבון heterotypic טרנס , אך עשוי גם לכלול יונים או ליגנדים מתנהג כמו linkers חוץ-תאי1. למרות חשיבות היסוד, יש מחסור של מבחני הבדיקה אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפי אלה ישירות בסביבה הטבעית של תאים חיים. שיטות רבות דורשות גם לשבירת תאים (למשל, הביוכימי מבחני כגון co-immunoprecipitation6), קיבעון (למשל, כמה טכניקות במיקרוסקופ אופטי סופר רזולוציה ו מיקרוסקופ אלקטרונים של תא-תא קשר7), או שאינם ספציפיים, כגון: צבירת / מבחני אדהזיה8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, טכניקות קרינה פלואורסצנטית יושמו מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג)10 או קרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה11. עם זאת, כדי להשיג מספיק קטן המרחקים בין fluorophores, שיטות אלה דורשים תוויות פלורסנט בצד חוץ-תאי של חלבונים10, פוטנציאל מתנגש עם טרנס אינטראקציות.

כאן, אנו מציגים חלופי המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור אינטראקציות חלבון-חלבון תא-תא באנשי קשר. גישה זו משלבת גישות קרוס-המתאם קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה (sFCCS), מספר קרוס-המתאם ואת הבהירות (ccN & B)), ערבוב של תאים המבטאים בונה פיוז'ן של החלבון של . עניין, למשל, קולטן אדהזיה. קולטני ובדוקים בתאים שמעצבת שני מסומנות עם שני חלבונים פלורסנט spectrally מופרדים (FPs), מתאיים הצד (ראה איור 1 א').

השיטות מועסקים מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות המושרה על ידי התנועה דיפוזיה של פיוז'ן פלורסנט חלבונים דרך נפח מוקד של לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. יותר בפירוט, וזמינותו רגשים פעפוע שיתוף של החלבונים עניין במחזור שני שכנים תא-תא באנשי קשר. אם החלבונים עוברים אינטראקציות טרנס , אלה מתחמי טרנס ויישא חלבונים פלורוסנט פולטות בשני ערוצים ספקטרלי, גורם תנודות פלורסצנטיות מתואם של שנינו פולטים. מצד שני, אם הכריכה לא מתרחשת, מספר תנודות של חלבונים מול PMs תהיה עצמאית, גורם תנודות לא מתואם. הרכישה יכול להתבצע בשתי דרכים: 1) sFCCS מבוסס על סריקה בצורת קו לאורך הקשר תא-תא, רגשים ביעילות את האינטראקציות במקום הממוקמים באזור הקשר. דרך ניתוח הטמפורלי של תנודות פלורסצנטיות, sFCCS מספקת גם מידע dynamics, קרי, מקדמי דיפוזיה של מתחמי חלבון; 2) ccN & B מבוססת על ניתוח pixel-wise של רצף של תמונות רכשה את האזורים קשר תא-תא. יש יכולת בדיקה של אינטראקציות מפה לאורך כל קשר עם איזור (ב מישור מוקד אחד), אך אינו מספק מידע על דינמיקה. שתי השיטות יכול להיות משולב עם ניתוח של הבהירות מולקולרית, קרי, האות הממוצע פלורסצנטיות הנפלטת ביחידת זמן אחת מתחמי חלבון באמצעי ולספק, לפיכך, הערכות של סטויכיומטריה של מתחמי חלבון- תא-תא אנשי קשר.

במאמר זה, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכנת הדוגמא, כיול המכשיר, רכישת נתונים וניתוח לבצע את הבדיקה הציג על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. ניתן לבצע את הניסויים על כל כלי מצויד פוטון לספור או גלאי אנלוגי ולא אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה. אנו עוד יותר לדבר על שלבים קריטיים של הפרוטוקול, לספק ערכות תיקון עבור מספר תהליכי גורם תנודות אות artefactual, למשל, גלאי רעש, תנועה photobleaching או תא. פותח במקור כדי לחקור את האינטראקציות בין תאים חסיד, וזמינותו עשוי להיות שונה עבור השעיה תאים, או הותאם מודל ממברנה מערכות, למשל, unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) או פלזמה ענקית קרום שלפוחית (GPMVs), המאפשר כימות של אינטראקציות בסביבות השומנים שונה או בהיעדר שלד התא מאורגן12,13.

סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה גירסה שונה של קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה14 , תוכננה במיוחד כדי לחקור דינמיקה דיפוזיה איטית השומנים ממברנות15. הוא מבוסס על רכישה סריקה קו בניצב רה מ המכיל את החלבונים פלואורסצנט עניין. כדי לחקור אינטראקציות של שני המינים חלבון שונה שכותרתו, הרכישה מתבצעת בשני ערוצים ספקטרלי באמצעות שני קווי לייזר, שני חלונות איתור עבור fluorophores spectrally מופרדים. בשל הדינמיקה דיפוזיה איטית של חלבונים ברה מ (D≤ ~ 1 /s2מיקרומטר), מידה קרוס-לדבר נטול יכול להתבצע על ידי לסירוגין את ערכת עירור משורת בשורה15. הניתוח מתחיל עם: 1) תיקון אלגוריתם יישור לתנועה לרוחב התא מבוסס על block-wise בממוצע של ~ 1000 שורות, 2) קביעת המיקום עם פלורסצנטיות המרביכלומר הממשלה מיקום האות, בכל בלוק, 3) הסטה של כל הבלוקים על נפוצות מקור12,15, בנפרד בכל אחד מהערוצים. לאחר מכן, מבחר אוטומטית של פיקסלים רה מ מתבצע על-ידי בחירה באזור המרכז התאמה לפי עקומת גאוס הסיכום של כל הקווים מיושר (קרי, מרכז ± 2.5σ). שילוב של האותות בכל שורה התשואות ממברנה פלורסצנטיות סדרת הזמן F(t) בכל אחד מהערוצים (g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). שים לב כי גודל פיקסל חייב להיות קטן מספיק, למשל, < 200 ננומטר, לשחזר את צורת הנקודה להפיץ את הפונקציה ולמצוא את המרכז שלו, המתאים למיקום של ראש הממשלה. בנוכחות photobleaching משמעותית, סדרת הזמן פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים ייתכן המודל עם פונקציה מעריכית-כפול ויש לאחר מכן תוקן עם הנוסחה הבאה:16

Equation 1.    (1)

חשוב לציין כי נוסחה זו מתקנת ביעילות amplitudes והן דיפוזיה פעמים המתקבל ניתוח המתאם של F(t)c, לעומת הערכות פרמטר זה ניתן להשיג את שלא תוקנו F(t). ואז, הפונקציות אוטומטי - ואת הצלב-קורלציה (ACFs / CCFs) של קרינה פלואורסצנטית החישוב של אותות:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

איפה אלפאFאני = Fאני(t) - Image 1 Fאני(t)Image 2 , ואני = g, r.

מודל דו מימדי דיפוזיה מצויד ואז המתאם לכל הפונקציות (CFs):

Equation 4.   (4)

כאן, N מציין את מספר חלבונים פלורסנט אמצעי תצפית, τd הזמן דיפוזיה לכל ערוץ. מודל זה לוקח בחשבון כי בהגדרה ניסיוני המתואר, דיפוזיה של חלבונים ברה מ מתרחשת בתוך המטוס x-z, בניגוד נפוץ התצורה של המתאם פלורסצנטיות ספקטרוסקופיה (FCS) ניסויים ממברנות חיטוט דיפוזיה במישור x-y של נפח קונאפוקלית17. המותניים w0 והגורם מבנה S, המתארת את התארכות wz של אמצעי האחסון נקודתית ב- z, S = wz/w0, מתקבלים מ כיול נקודת FCS מדידה המבוצעת עם spectrally דומים צבעי והגדרות באותו האופטי באמצעות הערכים הזמינים כבר מקדם דיפוזיה Dצבע:

Equation 5, (5).

איפה τd, צבע זה הזמן נמדד פיזור ממוצע של מולקולות צבען, המתקבל מתאים למודל תלת מימדי דיפוזיה בנתונים, לוקח לתוך חשבון מעברים של השבר T של כל המולקולות N שלישיה המדינה עם קבוע הזמן ττ:

Equation 6.   (6)

לבסוף, דיפוזיה (D), ערכי הבהירות מולקולרית (חדוה) והקבוע יחסית קרוס-הקורלציה של נתונים sFCCS (rel.cc.) מחושבים כדלהלן:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

Gקרוס(0) איפה משרעת הפונקציה קרוס-קורלציה, Equation 14 הוא משרעת הפונקציה autocorrelation בערוץ אני-th.

הגדרה זו של יחסי קרוס-המתאם, קרי שימוש מרבי במקום כלומר המשוואה 9, לוקח בחשבון את המספר המרבי של קומפלקסים של חלבונים שני מינים נוכח בריכוזים שונים הוא מוגבל על ידי מינים נוכח מספר נמוך יותר.

בהירות ומספר צלב-המתאם מבוסס על ניתוח רגע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל פיקסל של אוסף תמונות רכשה במשך הזמן במיקום קבוע במדגם, המורכב בדרך כלל ~ 100-200 מסגרות, עם שני ספקטרלי ערוצי ( g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). מהממוצע טמפורלית Image 1 אניImage 2, ואני השונות Equation 16 , הבהירות מולקולרית חדוהi ואת מספר nאני מחושבים ב כל פיקסל וערוץ ספקטרלי (אני = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

חשוב לציין כי המשוואות נתון חלים במקרה האידיאלי של גלאי ספירת פוטון אמיתי. עבור מערכות זיהוי אנלוגי, המשוואות הבאות חלות19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

כאן, S הוא הגורם המרה בין פוטונים שזוהו הסעיפים דיגיטלי מוקלטות, Equation 24 הוא רעש readout ואת היסט מתייחס ההיסט בעוצמה גלאי. באופן כללי, כמויות אלה צריכים להיות מכויל, עבור כל סוג הגלאי, המבוססת על מדידת השונות גלאי כפונקציה של עוצמת תאורה קבועה19, למשל, משטח מתכת רעיוני או פתרון דיי יבשים. היסט יכול להיקבע על ידי מדידת שיעור ספירה עבור דגימה ללא עירור אור. על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית של השונות הקשורות גלאי Equation 25 לעומת העוצמה (אני) העלילה, S ו Equation 24 יכול להיות נחוש19:

Equation 14.   (14)

בסופו של דבר, הבהירות קרוס-המתאם מחושב בתוך כל פיקסל ולא מוגדר באופן כללי כמו21

Equation 15, (15).

איפה Equation 29 הוא קרוס-השונות Equation 30 .

על מנת לסנן תנודות חיים ארוכים, כל ccN & B החישובים מבוצעים בעקבות קרון מטען סינון, באופן עצמאי עבור כל פיקסל22. בקצרה, ni, חדוהאני (אני = g, r) ו- Bcc מחושבים בהזזה מקטעים של למשל, 8-15 מסגרות. הערכים שהושג ובכך להיות בממוצע אז כדי להשיג הפיקסל האחרון מספר וערכי בהירות.

ניתוח סטויכיומטריה
כדי לאמוד את סטויכיומטריה של חלבון מתחמי תא-תא באנשי קשר, הבהירות מולקולרית ניתן בנפרד לנתח בכל אחד מהערוצים ספקטרליות עבור sFCCS או ccN & B נתונים. ב- sFCCS, מתקבל ערך הבהירות אחד לכל מדידה בכל ערוץ. ב ccN & B, היסטוגרמה הבהירות של פיקסלים כל הקשר תא-תא מתקבל, הערך הממוצע (או החציוני) יכול לשמש נציג בהירות למדידה. על ידי ביצוע הניתוח אותו על הפניה monomeric, כל ערכי הבהירות יכול להיות מנורמל להשיג ישירות מדינת oligomeric הממוצע מתחמי חלבון שזוהו. בנקודה זו, חשוב לתקן לנוכחות של FPs שאינו-פלורסנט שעלולים לגרום underestimation המדינה oligomeric. זה מתבצע בדרך כלל על ידי מודדים את הבהירות הפניה ההומו-dimeric חלבון23,24 באמצעות sFCS צבע אחד או מספר והבהירות (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לדוגמה: תא-תא ערבוב Assay

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את תהליך ערבוב עבור תאים חסיד. זה עשוי להיות שונה עבור תאים תרבותי ההשעיה.

  1. זרע מספר מתאים של תאים על צלחת 6-ובכן, למשל, 800,000 HEK 293T תאים (החשבת נויבאואר ספירת קאמרית), יום לפני תרביות תאים. המספר שניתן לשנות בהתאם הזמן בין seeding, תרביות תאים ולעקוב להתאמה עבור סוגי תאים אחרים. כדי לבצע ניסוי בסיסי (קרי, חלבונים של עניין שליטה שלילי), להכין לפחות 4 בארות. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני בינוני נשר שונה (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום שור עוברית (10%) ו- L-גלוטמין (1%).
  2. Transfect תאים על פי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).
    1. כדי לבצע ניסוי בסיסי, transfect, בבארות נפרדים, פלסמידים של החלבון עניין התמזגו 'ירוק' (למשל, monomeric משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (mEGFP), או חלבון פלואורסצנטי צהוב (mEYFP)) או 'אדום' (למשל, mCherry, או mCardinal) חלבון פלואורסצנטי.
      הערה: ב פרוטוקול זה, אנו מתמקדים APLP1-mEYFP ו- APLP1-mCardinal12, בקרה שלילית המתאימים, למשל, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-דקל-mEYFP) ואת - mCardinal (myr-דקל-mCardinal)12. באופן כללי, 200 ng - 1 µg של פלסמיד DNA מספיקים. יעילות גבוהה תרביות תאים מגדילה את הסיכוי למצוא תאים 'אדום' ו- 'ירוק' במגע. לשנות את הכמות של ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים כדי למטב את יעילות תרביות תאים. קריטי: תא confluency צריך להיות סביב 70% כאשר transfecting את התאים. אם תאים confluent יתר, היעילות תרביות תאים יקטן. אם התאים אינם מספיק confluent, תרביות תאים ולערבב עלול לגרום מתח ולמנוע הרבה תאים משעמו נכונה לאחר ערבוב.
  3. בצע תא ערבוב ~4 ± 2 h לאחר תרביות תאים.
    1. להסיר את מדיום הגידול ולשטוף היטב בעדינות עם 1 מ"ל PBS בתוספת מ ג2 + ו- Ca2 +. לאחר מכן, הסר את PBS. (קריטי) ירידה PBS קצה היטב כדי למנוע ניתוק של תאים במהלך הכביסה.
    2. להוסיף ~ 50 µL טריפסין ethylenediaminetetraacetic (EDTA) תמיסה חומצית drop-wise בכל טוב כדי להקל על ניתוק של תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות לאחר מכן, לאט ללחוץ את הצלחת 6-ובכן רוחבית כדי לנתק את התאים.
      הערה: דגירה ממושכת פעמים עשוי להיות צורך כמה סוגי תאים.
    3. להוסיף µL 950 של מדיום הגידול מכל קידוח, resuspend תאים על-ידי pipetting כמה פעמים הלוך ושוב, ובכך ניתוק כל התאים מהחלק התחתון טוב. (קריטי) ודא כי התאים הם resuspended כראוי ולא מנותקים אחד מהשני על-ידי בדיקה חזותית של העדר של אגרגטים תא גדול לאחר resuspension. אחרת ניתן להשיג 'אדום'-'אדום' או 'ירוק'-'ירוק' אנשי קשר רבים לאחר ערבוב.
    4. להעביר את הפתרון הסלולרי של באר אחת (חלבון מעניינים או שליטה שלילי) המתאים, קרי, 'אדום' (למשל, APLP1-mCardinal transfected) 'ירוק' (למשל, APLP1-mEYFP transfected) תאים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting כמה פעמים למעלה ולמטה. לאחר מכן, הזרע התאים המעורבים על 35 מ מ זכוכית מנות התחתון (1 מ"ל של מעורבות לתאים פתרון לכל מנה), בתוספת 1 מ"ל של מדיום הגידול ועל התרבות נזרע תאים לעוד יום ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

Figure 1
איור 1 . זרימת עבודה ניסויית וייצוג סכמטי של סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה ו מספר קרוס-המתאם וניתוח בהירות באנשי קשר תא-תא. (א) ערכה של הכנת הדוגמא: שתי אוכלוסיות תאים transfected עם החלבון עניין (לדוגמה, APLP1) התמזגו שני חלבונים פלורסנט spectrally נפרדות (למשל, mEYFP ו- mCardinal) מעורבבים לאחר תרביות תאים. אנשי קשר שונה transfected תאים נבחרים בניסויים מיקרוסקופ. כדי למנוע הפרעה עם תחומים איגוד חוץ-תאית, החלבון הניאון צריך להיות דבוקה הסופית תאיים של החלבון עניין. (B) מדידות סריקה FCCS (sFCCS) הם בניצב שבוצעו לאיש הקשר תא-תא בשני ערוצים ספקטרלי (ערוץ 1, ירוק, ערוץ 2, אדום). שורות הסריקה (המיוצגת בתור kymographs) מיושרים, ממברנה פיקסלים לסכם. לאחר מכן, הערכה ACFs ו CCFs מחושבים מתוך העקבות בעוצמה Fאני(t). הערכה ACFs מיוצגים, אדום וירוק. CCF מיוצג בצבע כחול. (ג) צלב-המתאם N & B (ccN & B) רכישת תוצאות בערימה תלת ממדי התמונה (x-y-time). רועי נבחרה סביב הקשר תא-תא. אז ערוץ ובהירות קרוס-קורלציה (חדוה1, חדוה2ו- Bcc) ערכים מחושבים בכל פיקסל קשר תא-תא. התוצאות הם דמיינו ואז כמו היסטוגרמות, צירוף כל הפיקסלים שנבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

2. הכנת הדוגמא: לשלוט על הצלב-מתאם ניסויים ובבניית הומו-דיימר לניתוח בהירות

  1. זרע 600,000 תאים HEK 293T, החשבת תא ספירת קאמרית, על 35 מ מ זכוכית התחתון מנות יום אחד לפני תרביות תאים. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני DMEM מלאה (ראה שלב 1.1) ליום אחר.
  2. Transfect תאים עם ~ 250 ננוגרם של פלסמיד הדנ א על פי הוראות יצרן. עבור הפקד צלב-קורלציה חיובית, להשתמש פלסמיד קידוד המעוגנת ממברנה חלבון פלואורסצנטי הטרו-דיימר, למשל, myr-דקל-mCherry-mEGFP או myr-דקל-mCardinal-mEYFP12 המתאים FPs של החלבון עניין. לצורך כיול בהירות, להשתמש פלסמידים קידוד המעוגנת ממברנה FP מונומר והן הומו-דיימר המתאים FPs דבוקה החלבון של עניין, למשל, myr-דקל-mEYFP myr-דקל-mEYFP-mEYFP כדי לכייל את ניתוח הבהירות של APLP1-mEYFP12.
  3. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בינוני DMEM מלאה (ראה שלב 1.1) ליום אחר.

3. מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי: התקנה וכיול נפח מוקד

הערה: פרוטוקול הבאה נכתבה ניסויים המבוצעת עם mEGFP/mEYFP, mCherry/mCardinal על מיקרוסקופ קונפוקלי השתמשו במחקר זה סורק הלייזר. ניתן לשנות את ההגדרה אופטי, הגדרות תוכנה (קווי לייזר, מראות ודיקרואיק זוהר, מסננים), ומבחר של כיול צבעי עבור אחרים setups FPs, מיקרוסקופ.

  1. הפעל המיקרוסקופ ואת לייזרים לפחות שעה לפני הניסוי כדי להבטיח יציבות לייזר ו- equilibration של הטמפרטורה.
  2. להכין µL 100-200 של פתרונות המתאימים הפלורסנט מסיסים במים (ראה את הטבלה של חומרים לדוגמאות) במים או PBS לכיול אמצעי האחסון מוקד, עם ריכוזים בטווח 10-50 ננומטר.
  3. מקם את הפתרונות לצבוע בצלחת זכוכית נקי 35 מ מ התחתון #1.5, קרי, יש עובי של 0.16-0.19 מ מ.
    הערה: השתמש באופן אידיאלי, מנות עם ביצועים גבוהים כיסוי זכוכית בעל עמידות נמוכה עובי, למשל, 0.170 ± 0.005 mm, ומאפשר תיקון הטבעת צווארון אופטימלית (שלב 3.6). חשוב להשתמש מאותו סוג של מאכל משמש אחר כך על הניסויים הבאים.
  4. מקם את הכלי המכיל את הפתרון לצבוע ישירות על המטרה (רצוי, טבילה במי, עם NA 1.2) כדי להבטיח התמקדות בתוך תמיסת. לחלופין, למקם את המנה על בעל מדגם ועל מיקוד המדגם (למשל, 10-20 מיקרומטר מעל החלק התחתון של המנה).
    הערה: אנו לא ממליצים להשתמש שמן מטרות בשל האות עניים המתקבל כאשר מיקוד עמוק לתוך דגימות מימית.
  5. להגדיר את הנתיב עירור, פליטה, למשל, לבחור את 488 ננומטר לייזר, 488/561 nm מראה ודיקרואיק זוהר, זיהוי חלון 499-552 ננומטר, גודל נקב של 1 יחידה אוורירי (AU). ודא כי הגודל חריר הוא זהה זה ישמש במדידות קרוס-המתאם.
  6. להתאים חריר עמדה (חריר התאמה) ואת הטבעת צווארון אובייקטיבית כדי למקסם את ספירת קצב. מטרה זו להפוך צווארון הטבעת עד שיעור מהספירה המרבית מזוהה.
    הערה: התיקון טבעת צווארון חשבונות עבור עובי הזכוכית המכסה משמש ספציפיים. למקסם את קצב הספירה, כלומר., איסוף פוטונים רבים לכל מולקולה ככל האפשר, הוא חיוני כדי למקסם את יחס אות לרעש (SNR) את המידות.
  7. לבצע סדרה של FCS נקודת מידות (למשל, 6 מידות במקומות שונים, שכל אחד מהם מורכב של 15 חזרות של 10 s, כלומר 2.5 דקות סה כ זמן, שנדגמו עם 1 µs להתעכב זמן או פחות) בכל אותו הכוח לייזר המשמשים קרוס-מתאם מדידות (בדרך כלל ~ 1%, קרי, ~ 1-2 µW).
  8. מתאים מודל תלת מימדי דיפוזיה כולל תרומה שלישיה (משוואת 6) הנתונים.
    הערה: בדרך כלל, הזמנים דיפוזיה שהושג µs כ-30 הינם הגורם מבנה הוא סביב 4-8.
  9. לחשב את המותניים w0 מ פיזור ממוצע נמדד הזמן והערכים שפורסמו עבור ערך מקדם דיפוזיה לצבוע משומש-בטמפרטורת החדר25 על פי משוואת 5. ערכים אופייניים הם 200-250 ננומטר.
  10. חזור על התרגיל כיול (שלבים 3.4-3.9) עם צבע שונה פלורסנט עבור ערוץ איתור השני במידת הצורך (למשל, 561 nm עירור וזיהוי בין 570 nm ו 695 ננומטר). שמרו חריר מיקום וגודל זה הוגדר עבור הערוץ זיהוי הראשון.
  11. לחשב את הבהירות מולקולרית (משוואת 8) מ כיול המידות ואחסן את הערכים שהושג.
    הערה: ערכים אופייניים עבור הגדרת בשימוש הם ~8-10 קילו-הרץ/מולקולה (MOL) 1.8 µW 488 ננומטר עירור כוח. שנמוך מ ערכי הרגיל עשוי להצביע על עפר על המטרה, אי-התאמות של ההתקנה או פלט של לייזר מופחת. בדוק ולאחסן לייזר כוחות פלט בנקודת היעד באופן קבוע באמצעות מד הכוח. לשם השוואה של כיוונונים שונים, בהירות מולקולרית מנורמל מאת עוצמת הלייזר עירור היא הפרמטר המשמעותי ביותר כדי להעריך את ביצועי מיקרוסקופ.

4. סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה: רכישה

הערה: פרוטוקול הבאה נכתבה ניסויים שבוצעו עם mEGFP/mEYFP ("ירוק") ו- mCherry/mCardinal ("red") במיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר השתמשו במחקר זה. הגדרת אופטי ואת הגדרות תוכנה (קווי לייזר, מראות ודיקרואיק זוהר, מסננים) עשויות להיות שונות עבור אחרים setups FPs או מיקרוסקופ.

  1. להגדיר את הנתיב אופטי, למשל, 488 ננומטר, עירור nm 561 ואת מראה ודיקרואיק זוהר 488/561 ננומטר, נקב 1 AU עבור עירור 488 ננומטר. כדי להימנע ספקטרלי צולבות לדבר, בחר בשני מסלולים נפרדים לעורר ולגלות mEGFP/mEYFP (488 ננומטר עירור, הערוץ הירוק) ו- mCherry / mCardinal (561 עירור ננומטר, הערוץ האדום) ברצף ובחר מתג מסלולים בכל שורה. איתור, השתמש המסננים המתאימים עבור שני ערוצים, למשל, 499-552 nm, לערוץ הצבע הירוק, 570-695 nm, ערוץ הצבע האדום.
  2. אם עירור לסירוגין אינו אפשרי, השתמש בהגדרות הסינון המתאימה עבור הערוץ האדום כדי למזער ספקטרלי צולבות לדבר (כלומר לזהות קרינה פלואורסצנטית mCherry/mCardinal לא מתחת 600 ננומטר). זה עשוי להפחית את כמות הפוטונים זוהה ערוץ הצבע האדום, ובכך להפחית את SNR.
  3. מקם את המנה המכילות את התאים המעורבים את המחזיק לדוגמה. המתן לפחות 10 דקות כדי להבטיח equilibration טמפרטורה וכדי להפחית את המוקד להיסחף.
  4. מתמקדים התאים באמצעות שידור אור בתפריט אתר .
  5. חיפוש זוג 'אדום' תא 'ירוק' קשר איש עם רעהו. קרוס-מתאם חיובי או הומו-דיימר בקרת הבהירות (ראה סעיף 2), לחפש תא מבודד פולטות קרינה פלואורסצנטית הן ערוצי או האות הומו בהתאמה-דיימר-ראש הממשלה.
    הערה: (קריטי) מזער מדגם חשיפה תוך חיפוש עבור תאים להימנע מראש הלבנה, אשר עשוי להפחית את הצלב-המתאם26. לכן, סריקה מהירות הסריקה המהירה, כוחות לייזר נמוך. כדי להימנע גלאי הרוויה, תוך הדמיה חזק לבטא תאים, חפש במצב אינטגרציה. עם זאת, כדי למזער את החשיפה, סריקה ברזולוציה נמוכה יותר כוחות לייזר אפשרי במצב סופר פוטון .
  6. בחר סריקת הנתיב בניצב תא-תא קשר (או PM של תא בודד עבור הפקד בהירות חיובית, קרוס-מתאם או הומו-דימר) באמצעות לחצן חתוך , כפי שהיא מתוארת דמויות 1B ו- 2A.
    הערה: מיקרוסקופים ישנים מסוימים אינם מאפשרים סריקה שרירותי כיוונים. במקרה זה, תא-תא קשרים עם אוריינטציה בניצב לכיוון הסריקה צריך להיות ממוקם.
  7. זום כדי להשיג גודל פיקסל של 50-200 ננומטר, בחר קו במצב סריקה. הגדר גודל המסגרת 128 × 1 פיקסלים.
    הערה: גודל הפיקסל טיפוסי הוא 160 nm, המקביל אורך הסריקה של בערך 20 מיקרומטר.
  8. להגדיר מהירות הסריקה לערך המרבי המותר, למשל, 472.73 µs בכל שורה.
    הערה: עבור ערכת עירור חלופי, זה תואם את זמן הסריקה 954.45 µs, קרי ~ 1000 סריקות לשנייה לכיוונון המשמש. מהירות סריקה עשוי להיות מותאם בהתאם מקדם דיפוזיה של החלבון עניין. המעוגנת קרום חלבונים, דיפוזיה טיפוסי הזמנים הם סביב 10-20 גב בזמן הסריקה צריך להיות לפחות עשר פעמים קטנים יותר מבפעמים דיפוזיה. נמוכה הסריקה מהירויות עשוי לגרום photobleaching חזק יותר ודורשים כוחות תאורה נמוכה יותר. לחלופין, אחד יכול להטיל הפסקה, למשל, 5 מילי-שניות, בין כל סריקה עבור מתחמי לאט מאוד באמצעי באמצעות מרווח המשנה סדרות זמן .
  9. לבחור את הכוחות לייזר מתאים, למשל, ~ 1-2 µW עבור 488 ננומטר ו ~ 5-10 µW עבור 561 עירור ננומטר.
    הערה: הכוחות לייזר לשפר SNR, אך להגביר photobleaching. לכן, לייזר כוחות צריך להיבחר כך photobleaching הוא פחות מ 50% של קצב הספירה ההתחלתית.
  10. הגדר מחזורים 100,000-500, 000.
    הערה: המספר של סריקות, קרי, המשך של המדידה, עשוי להשתנות: פעמים מדידה עוד ישתפרו SNR, עשוי להיות מתאים יותר עבור אט לשדר מולקולות, עם זאת, תנועה של תאים photobleaching להגביל את המידה המקסימלית הגיע הזמן. הנתונים המובאים כאן נרכשו באופן שגרתי עבור ~ 3-6 דקות, קרי, קו 200,000-400,000 סורק.
  11. הגדר גלאי מצב הפוטון לספור . הקש להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה. חזור על שלבים 4.5-4.11 למדוד תא אחר.
    הערה: מומלץ למדוד 10-15 תאים עבור דגימה ברמות ביטוי שונה. (קריטי) הימנע גלאי רוויה ברמות ביטוי גבוהה. הקצב מהספירה המרבית לא יעלה ~ 1 מגה-הרץ.
  12. אם ניתוח בהירות מתבצעת כדי לקבוע oligomeric הברית, לבצע מדידות כיול בהירות הומו-דימר על פי פעולות ששונתה 4.1-4.11: למדוד כל חלבון פלואורסצנטי הומו-דיימר בנפרד (ב תאים מבודדים, המוכנים פרוטוקול בסעיף 2) ולבצע מדידות רק בערוץ אחד ספקטרלי.

5. ספקטרוסקופיה סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם: ניתוח נתונים

הערה: פרוטוקול הבאים בעקבות יישום של ההליך ניתוח תיאר בפירוט מאמרים קודמים12,15. קוד תוכנה זמין על פי בקשה ליוצרים.

  1. לייצא את קבצי הנתונים הגולמיים (למשל, CZI) לתמונה RGB TIFF בתבנית הנתונים הגולמיים. קובץ זה יכיל את kymograph עם הירוק, נתוני הערוץ האדום, בערוץ כינה G ו- R של התמונה, בהתאמה.
  2. ייבא את קובץ TIFF עם התוכנה המתאימה ניתוח והמשך לביצוע הניתוח.
    הערה: השלבים הבאים (שלבים 5.3-5.7) מוחלים בנפרד על כל אחד מערוצי:
  3. יישר את השורות על-ידי ביצוע ממוצע זמן segment-wise או לנוע עם בלוקים של קווי 500-1000. לקבוע את מיקום ממברנה, קרי, מיקום הפיקסלים עם הקצב מהספירה המרבית בכל בלוק. משמרת כל הבלוקים לאותו מיקום לרוחב. הליך זה מתקן עבור תזוזה לרוחב של הקשר תא-תא, למשל, עקב תנועת התא.
  4. לסכם כל הקווים מסודרים לאורך ציר הזמן, מתאים לפרופיל בעוצמה ממוצעת באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס. בנוכחות משמעותית רקע תאיים, השתמש Gaussian בתוספת פונקציה סיגמואיד. הגדר את הפיקסלים המייצגים הקרום כמו כל הפיקסלים בתוך ±2.5σ של הממברנה עמדה, סכום את האינטנסיביות של הפיקסלים האלה בכל שורה, קבלת ערך האות פלורסצנטיות יחיד עבור כל נקודת זמן (כלומר, עבור כל סריקה קו).
  5. אם יש צורך (למשל, רקע > 10% של האות קרום), להחיל תיקון רקע על-ידי הפחתת עוצמת הפיקסלים הממוצע בציטופלסמה מוכפל 2.5σ (ביחידות של פיקסלים) של קרינה פלואורסצנטית הממברנה, בבלוקים של 1000 שורות. הימנע שלפוחית תאיים בהירים בעת בחירת רקע פיקסלים.
  6. אם photobleaching הוא ציין, להחיל תיקון הלבנה. לכן, מתאים סדרת הזמן ממברנה זריחה עם פונקציה מעריכית-כפול, להחיל את התיקון המתאים הנוסחה, משוואה 116.
    הערה: לחלופין, ערכות תיקון ספקטרום מבוסס פורייה ייתכן יישומית27. (קריטי) אם photobleaching זה קיים אבל לא תוקן עבור, עשוי להיות מעוות קשות CFs, פרמטר הערכות עשויים להיות מוטים חריפה (למשל, ראה איור 5E).
  7. לחשב את הערכה ACFs CCFs לפי משוואות 2 ו- 3 באמצעות, למשל, אלגוריתם מרובות-טאו28. כדי לשפר את המהימנות של הניתוח להימנע חפצים, לבצע את החישובים עבור חלקי המדד הכולל שווה 10-20. לבחון את זריחה זמן סדרה ו CFs כל קטע ולהסיר מקטעי בבירור מעוותת (ראה דוגמאות ב איור 4A- 4 D). ממוצע כל מקטעי שאינה מעוותת.
    הערה: הליך זה יכול להיות אוטומטי כדי להימנע דעה קדומה הסובייקטיבית הנתונים29. עבור מדידות מאוד לא יציב יש קטעים קצרים רבים עשוי להיות שימושי. עם זאת, האורך של קטע עדיין צריך להיות לפחות שלושה סדרי גודל מעל הזמן דיפוזיה להימנע סטטיסטי undersampling שגיאות29,30,17.
  8. מתאים מודל דיפוזיה דו מימדי, משוואת 4 CFs שהושג. לכן, לתקן את הגורם מבנה הערך שהתקבל במדידה כיול (פרוטוקול בסעיף 3). ניתן לשפר את הדיוק של התאים על ידי ביצוע התאמה משוקלל באמצעות המשקולות סטטיסטי של כל נקודת נתונים המתקבלים האלגוריתם טאו מרובים.
  9. חשב את מקדם דיפוזיה באמצעות המותניים מכוילת על פי המשוואה 7.
  10. לחשב את הבהירות מולקולרית על-ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע בכל אחד מהערוצים לפי מספר חלקיקים, 8 משוואת המתאימים. לנרמל את ערך הבהירות נחושה בכל אחד מהערוצים על ידי בהירות ממוצעת של ההפניה monomeric המתאים כדי לקבל את המדינה oligomeric, לתוך חשבון שאינו-פלורסנט FPs23. כדי מטרה זו לקבוע ערכי הבהירות ההומו הממוצע-דיימר מניתוח צבע אחד כדי לחשב את השבר של הלא-פלורסנט FPs23.
  11. חישוב המתאם בין יחסי לפי משוואת 9.

6. קרוס-קורלציה למספר והבהירות: גלאי כיול

הערה: פרוטוקול הבאים מספק קו מנחה כללי לגבי איך לכייל את מערכת איתור. הליך זה חובה עבור מערכות זיהוי אנלוגי, אבל בהחלט נחוצה כאשר גלאי הספירה האמיתית פוטונים נמצאים בשימוש.

  1. נגב פתרונות צבע מסיס במים המתאימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמאות) על צלחת תחתית זכוכית 35 מ מ. להגדיר את נתיב אופטי בהתאם, קרי, 488 או 561 nm עירור וזיהוי 499-552 ננומטר או 570-695 nm, בהתאמה.
    הערה: לחלופין, משטח מתכת רפלקטיביים יכול לשמש במקום צבע יבשים פתרונות על-ידי הצבת את פיסת מתכת ישירות מעל המטרה.
  2. לבצע מדידות N & B צבע אחד באזורים עם ריכוזי צבעים שונים או כוחות לייזר שונים. לכן, להשתמש זום כדי להשיג גודל בפיקסלים של 300 ננומטר, מהירות הסריקה כדי להגדיר 25 µs פיקסלים שמתאימה להתעכב זמן, למשל, ולהגדיר מחזורים למסגרות 100-200.
  3. הגדר גלאי ספירת פוטון (או במצב אנלוגי אם מדידות מבוצעות באמצעות זיהוי אנלוגי) ולחץ להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה. ביצוע המדידה בעוצמה אפס עירור ' כדי לקבוע את ההיסט בעוצמה.
  4. מגרש פיקסל השונות כפונקציה של עוצמת פיקסל לכל הפיקסלים נמדד ולבצע התאמה לינארית של נתונים אלה. לקבוע S כמו המדרון של התאים ליניארי. לחשב את הרעש readout מהחיתוך-y, באמצעות S וההיסט בעוצמה נקבע על פי משוואת 14.

7. מספר קרוס-קורלציה, בהירות: רכישה

  1. בצע את שלבים 4.1-4.4 של פרוטוקול רכישת sFCCS.
  2. השתמש בחתוך כדי לבחור מסגרת של 512 × 128 פיקסלים מסביב קשר תא-תא (או מבודד PM עבור בקרת הבהירות הומו-דימר) זום כדי להשיג גודל פיקסל של 50-100 ננומטר.
  3. כדי להגדיר פיקסלים שמתאימה להתעכב זמן, למשל, 6.3 µs לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט מהירות הסריקה .
    הערה: N & B, הזמן להתעכב פיקסל צריכה להיות הרבה יותר קטן מאשר הזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אם ערכת עירור חלופי נבחר, למשל, החלפת רצועות בכל שורה, הזמן בין שתי הרצועות אמור להיות קטן יותר מהזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אחרת קרוס-המתאם לזיהוי מצטמצם.
  4. הגדר מחזורים 100-200 מסגרות.
    הערה: מספר מסגרת גבוה יותר תשפר את SNR, עם זאת, תנועת התא יכול להגביל את משך הזמן סך מדידה. זמן סריקה לכל מסגרת צריך להיות הרבה יותר גבוה מאשר הזמן דיפוזיה של החלבון עניין. אחרת בהירות נראית לעין מצטמצם, קרי, חלקיקים מופיעים להיות משותק. על מתחמי באמצעי לאט מאוד, להטיל על שתיקה, למשל, 2 s, בין מסגרות באמצעות מרווח המשנה סדרות זמן .
  5. להגדיר כוחות לייזר לערכים המתאימים (ערכים אופייניים הם ~ 1-2 µW עבור 488 ננומטר ו ~ 5-10 µW עבור עירור nm 561).
    הערה: לייזר הפיכחות, מה שמוביל בהירות גבוהה יותר ו SNR משופר, אלא גם photobleaching משופר. לייזר כוחות צריך להיות גבוה מספיק כדי להשיג בהירות שזוהו לפחות ~ 1 kHz/MOL אך השאירו מספיק נמוך כדי למנוע יותר מ 10-20% photobleaching. עבור photobleaching mEGFP/mEYFP או mCherry/mCardinal, פחות מ- 10% מתקבלים בדרך כלל.
  6. הגדר גלאי ספירת פוטון (או במצב אנלוגי אם מדידות מבוצעות באמצעות זיהוי אנלוגיות). הקש להתחיל ניסוי להתחיל הרכישה.
  7. להעריך את קצב הספירה פוטון. אם ספירת המחירים בפיקסלים קשר תא-תא חורגים 1 מגה-הרץ, להפחית את עוצמת הלייזר או בחר תאים עם רמות נמוכות יותר של ביטוי. חזור על השלבים 7.2-7.7. כדי למדוד את הזוג הבא של תאים. מומלץ למדוד 10-15 תאים לכל ניסוי ברמות ביטוי שונה.
  8. אם הבהירות ניתוח מבוצע לכמת oligomerization, לבצע מדידות כיול בהירות הומו-דימר על פי פעולות ששונתה 7.1-7.7: למדוד כל חלבון פלואורסצנטי הומו-דיימר בנפרד (ב תאים מבודדים, המוכנים פרוטוקול בסעיף 2) ולבצע מדידות רק בערוץ אחד ספקטרלי.

8. המספר קרוס-קורלציה, בהירות: ניתוח נתונים

הערה: להלן כללי התנהגות עוקב אחר12,הליך ניתוח שתואר לעיל31. קוד תוכנה זמין מן המחברים על פי בקשה.

  1. לייבא את הנתונים הגולמיים (למשל, CZI הקבצים ניתנים לייבוא באמצעות החבילה32 Bioformats). ממוצע של כל המסגרות, בחר אזור בעל עניין (ROI) סביב הקשר תא-תא.
  2. ביצוע של התמונה יישור אלגוריתם33, למשל, על-ידי הגדלת המתאם המרחבי בין ROIs במסגרות עוקבות עבור תרגומים לרוחב שרירותי, בממוצע בשני ערוצים. הליך זה יתקן לתנועה לרוחב של התאים.
  3. להחיל מסנן שהקרון22 כדי להפחית תנודות מאריכים חיצוניים, שמקורם, למשל, תנועת התא שיורית או רקע הלבנה. לחלופין, ניתן להחיל שיטה detrending לתיקון photobleaching34.
    הערה: אם אין ניתוח segment-wise או detrending חלה, הבהירות לכאורה עשויים להיות במידה רבה overestimated.
    1. להגדיר הזזה חלקי, למשל, 8 עד 15 מסגרות (למשל, מסגרות 1 עד 8, 2 עד 9 ו הלאה), לחשב את ערכי הבהירות וערוץ קרוס-המתאם על פי משוואות 10, 11 ו- 15 pixel-wise בכל קטע. אם גלאי אינם פוטון נכון לספור גלאי, לוקחים את הפרמטרים גלאי מכוילת בחשבון בעת חישוב הבהירות, קרי, השתמש משוואות 12 ו 13 במקום.
      הערה: חישוב את ערכי הבהירות בקטעים של 8 עד 15 מסגרות מוביל underestimation של 10-20% של הבהירות המוחלטת של 10-20% מופרזת של חלקיקים מספרים. למרות זאת, יחס בהירות (למשל, דימר כדי מונומר בהירות) אינם מושפעים, כמה זמן אורך קטע נשמרת קבועה לאורך כל הניתוח (נתונים לא מוצג). יכול להיות נקבע באמצעות סימולציות, מתוקנות ובכך על השגיאה הסטטיסטית עבור אורך קטע נתון.
    2. ממוצע את ערכי הבהירות שהושג pixel-wise מעל כל שכבות. בשלב זה, אחד עשוי להסיר את % 5 הגבוהים והנמוכים ביותר של ערכי הבהירות קטע מן הממוצע או לא לכלול קטעים שמראים עיוות ברור בעוצמה, עקב, למשל, של שלפוחית תאיים או צבירה transiently נוכח אלה פיקסלים.
  4. להתוות את ערכי הבהירות של הפיקסלים כפונקציה של עוצמת פיקסל ובחר את האוכלוסייה של פיקסלים המתאים לאיש הקשר תא-תא. ברקע יהיו ערכי העוצמה נמוך מאוד. בשלב זה, להעריך מחדש את קצב מהספירה המרבית. הכללת פיקסלים עם ספירת המחירים מעל 1 מגה-הרץ כדי למנוע בכביש מספר אפקטים.
  5. ליצור היסטוגרמות בהירות וערוץ קרוס-המתאם של התא-התא שנבחר פיקסלים קשר ולקבל את ערכי הבהירות בממוצע-ROI. לנרמל את ערך הבהירות ערוץ הממוצע על ידי בהירות ממוצעת של ההפניה monomeric המתאים כדי לקבל את המדינה oligomeric, לתוך חשבון שאינו-פלורסנט FPs23. לכן, לקבוע ערכי הבהירות ההומו הממוצע-דיימר מניתוח צבע אחד כדי לחשב את השבר של הלא-פלורסנט FPs23.
  6. להמחשה, מגרש מפות בהירות וערוץ קרוס-המתאם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבחן ראשון עבור אינטראקציית חלבון-חלבון וזמינותו, קרי, ערבוב של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט ברורים spectrally, ואחריו sFCCS/ccN & B מדידות (איור 1), צריכה להתבצע על חלבונים אשר אינם אמורים אינטראקציה-הקשר תא-תא (קרי, פקד שלילי). לכן, HEK 293T תאים myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-דקל-mEYFP) או - mCardinal היו מעורבים, sFCCS בוצעה על-פני הקשר תא-תא (איור 2א). במקרה האידיאלי, האות פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים אמור נעים סביב ממוצע יציבה, בשל תנועת המפזרת החלבונים של ראש הממשלה ולא את הווריאציות סטטיסטית של מספר חלבונים בגוף הגיאומטרי מוקד. חלבונים זה לא יוצרים קשר, התנודות בשני ערוצים אינם תלויים אחד מהשני והוא, לפיכך, קרוס-המתאם ספקטרלי צפוי נעים סביב אפס. אכן, קרוס-מתאם היחסית קרובה לאפס נצפתה במדידות טיפוסי (איור 2C). הערכה ACFs להראות פעמים בליה אופיינית של ~ 10-20 ms (המקביל, בממוצע, Dmyr-דקל = 1.3 ± 0.3 מיקרומטר2/s (מתכוון ± SD, n = 20 תאים)), כצפוי פעפוע של myr-דקל-mEYFP ו- mCardinal של ראש הממשלה, למשל, Dmyr-דקל = 0.88 ± 0.11 מיקרומטר2/s (זאת אומרת ± SEM) מבוסס על קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) ניסויים35. ראוי לציין, איטי הדינמיקות האלה מאפשר שימוש לסירוגין עירור לסכימת, קרי, מעבר בין רק עירור אדום ירוק ורק וזיהוי כל שורה, גרימת עיכוב ms ~0.5 בין אותות בשני ערוצים אבל דיכוי ספקטרלי צולבות לדבר. על ממוצע, נמוך מאוד ממוצע קרוס-מתאם של 0.08 ± 0.10 (זאת אומרת ± SD, n = 17 תאים) הושג עבור הפקד שלילי (איור 3E), כצפוי.

בשלב הבא, פקד קרוס-קורלציה חיובית שימש לכיול המרבי האפשרי קרוס-המתאם בכיוונון אופטי. לכן, קרום המעוגנת הטרו-דיימר myr-הדקל-mCardinal-mEYFP בא לידי ביטוי בתאים 293T HEK, sFCCS מדידות בוצעו על תאים בודדים (איור 2B). CCFs שהושג היה חיובי amplitudes והראה דעיכה דומה, פי ACFs, שוב ~ 10-20 ms (איור 2D). על ממוצע, קרוס-מתאם היחסי של 0.96 ± 0.18 (זאת אומרת ± SD, n = תאים 14) נמדד עבור הפקד חיובי (איור 3E).

Figure 2
איור 2 . סריקת קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה קרוס-מתאם בקרת מדידות. (א) להחליפן בתמונות של מעורבות HEK 293T תאים לביטוי myr-דקל-mEYFP /-mCardinal כפקד שלילי עבור אינטראקציות טרנס . החץ הצהוב מציין ש-sfccs לסרוק נתיב. סרגלי קנה מידה הם 5 מיקרומטר. (B) נציג תמונות של תאים HEK 293T לבטא myr-דקל-mCardinal-mEYFP הטרו-דיימר (השמאלי: ערוץ ירוק, נכון: הערוץ האדום) כפקד קרוס-קורלציה חיובית. החץ הצהוב מציין ש-sfccs לסרוק נתיב. סרגלי קנה מידה הם 5 מיקרומטר. (ג) נציג CFs (ירוק: ACF בערוץ ירוק (mEYFP), אדום: ACF בערוץ אדום (mCardinal), כחול: CCF) שהושג במדידות sFCCS עבור שליטה שלילי. קווים מלאים להראות מתאים של מודל דו מימדי דיפוזיה CFs. (ד) נציג CFs (ירוק: ACF בערוץ ירוק (mEYFP), אדום: ACF בערוץ אדום (mCardinal), כחול: CCF) בשנת sFCCS מדידה של הפקד חיובי. קווים מלאים להראות מתאים של מודל דו מימדי דיפוזיה CFs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ההתאמה של זה וזמינותו נחקר ואז בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי חיטוט את האינטראקציות הטרנס של עמילואיד קודמן כמו החלבון 1 (APLP1), סוג אני טראנסממברנלי זה הוצע לפעול כמו אדהזיה עצביים קולטן. מטרה זו APLP1 דבוקה mEYFP או mCardinal בא לידי HEK 293T תאים. כדי לא לכלול הפרעות עם תחומים איגוד חוץ-תאית, FPs היו התמזגו את קצה קרבוקסילי של APLP1, קרי, התחום תאיים (ראה איור 1א'). לאחר מכן, sFCCS מדידות בוצעו על התא-תא הקשר בין APLP1-mEYFP APLP1-mCardinal לבטא תאים (איור 3א), וכתוצאה מכך ACFs CCFs (איור 3C) המספקים מידע אודות APLP1 דיפוזיה ואינטראקציות. יחסית קרוס-מתאם חיובי של 0.45 ± 0.21 (זאת אומרת ± SD, n = 17 תאים) נצפתה, קרי, ערך גדול באופן משמעותי מזה של הפקד שלילי (איור 3E). . מעניין, ממוצע יחסי קרוס-המתאם היה נמוך מזה של הפקד חיובי (איור 3E), המציינת את האיגוד רק חלקית טרנס .

לבסוף, וזמינותו שימש כדי להראות כי אבץ יונים להקל APLP1 משופרת טרנס מחייב12,31. SFCCS CFs המתקבל מדידות ברחבי APLP1 אשכולות של אנשי קשר תא-תא (מאופיין של לוקליזציה שותף חזק של APLP1-mEYFP, APLP1-mCardinal, ויוצרים במהירות בנוכחות אבץ יונים, איור 3ב) הראה חריפה דינמיקה מופחתת, כפי שניתן לראות מן דעיכה גדולה פי תנודות ב לג גדול פעמים (איור 3ד'). ובכל זאת, ניתוח של amplitudes בשעות השהיה קצרה גילה עלייה משמעותית של המתאם בין יחסי כדי 0.8 ± 0.3 (זאת אומרת ± SD, n = 17 תאים), קרי, ~ 80% מהערך המרבי מכויל (איור 3E). . זה היה צפוי כי הדינמיקה איטי כזה לגרום עיוותים קשים של עקומות קורלציה (ראו איור 3ד') בשל מספר מוגבל של אירועים המפזרת שניתן לאתר בזמן המדידה סופיים, גרימת כביכול חלקיקים רעש30. על כימות מדויק, זמן ההשהיה המרבי צריך להיות לפחות 3 סדרי גודל מעל הזמן דיפוזיה (ראה הקודם דעת30,17 לפרטים נוספים).

הבהירות מולקולרית של sFCCS APLP1 הנתונים נותחו עוד יותר, באמצעות הפקד שלילי myr פאלם כהפניה monomeric בכל אחד מהערוצים, תיקון עבור כמות חלבונים שאינם-פלורסנט23. על תוספת יון אבץ, הבהירות מולקולרית משמעותית עלה מ oligomers קטן (~ הדימרים) כדי multimers גדול המורכב ~ 10-50 מונומרים על כל תא (איור 3F). לפיכך, בממוצע, עד APLP1 ~ 100 מונומרים נמצאים באשכול כל חלבון על פני הצומת תא-תא.

Figure 3
איור 3 . סריקת קרינה פלואורסצנטית מדידות קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה של אינטראקציות APLP1 תא-תא באנשי קשר. (A, B) להחליפן בתמונות של תאים HEK 293T לבטא APLP1-mEYFP (ירוק) / APLP1-mCardinal (אדום) לפני (A) ו- 30 דקות לאחר אבץ יון טיפול (B, תאים שונים). בחצים צהובים מציינים ש-sfccs סרוק נתיבים. גודל ברים הם 5 מיקרומטר. (C, D) נציג CFs (ירוק: ACFs בערוץ ירוק (mEYFP), אדום: ACFs בערוץ אדום (mCardinal), כחול: CCFs) שהושג במדידות sFCCS APLP1 (ג) לפני הטיפול יון אבץ ו (ד) לאחר טיפול יון אבץ. קווים מלאים להראות מתאים של מודל דו מימדי דיפוזיה החלקות CFs-(E) תיבת הצלב היחסי-המתאם המתקבל sFCCS ניתוח של שליטה שלילי ("שלילי"), APLP1 ב היעדרות ונוכחות של אבץ יונים, חיובי קרוס-מתאם שליטה ("חיובי"). הגרפים מראים ערכים ושפמו ועד מינימום הערכים המרבי. (F) תיבת חלקות של בהירות מולקולרית מנורמל בערוץ ירוק (mEYFP) המתקבל sFCCS ניתוח APLP1 תא-תא באנשי קשר היעדרות, נוכחות של אבץ יונים. ערכי הבהירות תוקנו עבור פלורסנט שאינן mEYFP על סמך מדידות sFCS של myr-דקל-mEYFP-mEYFP הומו-הדימרים הביע HEK 293T תאים, שנמדד תחת אותם תנאים23. הגרפים מראים ערכים ושפמו ועד מינימום הערכים המרבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כל המדידות המוצגות עד כה היו מתוקנות על תנודות נוספים, כדין המתרחשים בתאים זה, אם לא נלקחה בחשבון, יעשה את הניתוח sFCCS מאתגר. עבור הפקד שלילית, לדוגמה, אלו עשויים לגרום cross-מתאם חיובי-false, אם אין ערכות תיקון מוחלים. הם שני תהליכים עיקריים קשות יכולה לעוות את CFs: 1) instabilities ב ידי קרינה פלואורסצנטית מוקלט אות בשל שלפוחית תאיים transiently להזין את אמצעי האחסון מוקד או להאט את קרום dynamics, למשל, הסחף לכיוון-z ו- 2) photobleaching. כדי לזהות instabilities ארעי, מומלץ לחלק את המידות מלא בקטעים באופן שווה בגודל 10-20, לבחון באופן חזותי את עוצמת זמן סדרה ו CFs בכל קטע. הליך זה מודגם באיור 4, אשר נותן דוגמא של מקטעי בבירור מעוותת שהושג בניתוח של מדידה בקרה שלילית. Instabilities ארעי (איור 4א, עוצמת עקבות של מקטעים 1 ו- 2) עלול לגרום CCF בעל ערכים שליליים (איור 4B, קטע 1) או גבוהה חיובי-false קרוס-מתאם (איור 4B, קטע 2). בדרך כלל, כזה instabilities גלויים בסדרה אינטנסיביות כמו האות איטי וריאציות (איור 4א). CFs התואם בדרך כלל תסטה בחריפות CFs-רובם של מקטעים, הצגת, למשל, גבוהות משרעת ושעות דעיכה הרבה יותר איטית על ~ השני קנה מידה (ראה איור 4B-4 D). מומלץ להסיר כאלה קטעים מן הניתוח, כדי לחשב CFs סופית על ידי ממוצע של כל מקטעי שאינה מעוותת, קרי, מקטעי מאופיין CFs לא לסטות הרוב המכריע של CFs. בדרך כלל, זה מתבצעת בגרפי ממשק בבדיקת iteratively 1) המקטעים, 2) הסרת עיוות בבירור מקטעי הממוצע ו- 3) בוחן את CFs שנותרו מגזרים ביחס CFs הממוצע מעודכן של קטעים שלא הוסרו. על-ידי החלת נוהל זה, מדידות זמן מעוותת באופן חלקי (איור 5א), מציג לאט מרקיבים (פגום) CFs (איור 5B) בהצלחה תוקנו והיו מיתאם משמעותי עקומות התאושש (איור 5C). בדרך כלל, הליך תיקון זה יכול להיות automatized29, הימנעות בדיקה חזותית על-ידי המשתמש, אשר עשוי להיות נוטה הטיה סובייקטיבית. לעומת העוצמה מבוסס סינון שיטות36, שבה יוערכו פחים קטנים המדידה בהתבסס על עצמתם לעומת ממוצע עוצמת המדידה מלא והוסרו, אם תעלה על סף פרמטר, המתואר הליך שאינה נשענת על פרמטרים חיצוני, והוא רגיש גם instabilities משנית.

כדי לפצות על photobleaching, התיקון מתמטית המתואר, משוואה 1, הוחל. בדרך כלל, photobleaching יכול להיות מזוהה על ידי דעיכה מעריכית של האותות קרינה פלואורסצנטית (איור 5D), שולטת על CFs, אשר לאחר מכן להראות חיובי-false של קרוס-קורלציה, ריקבון פעמים על ~ מין סולם (ראה את צורת העקומה טיפוסי איור 5E). הליך התיקון לשחזר את CFs שאינם מעוותת (איור 5F). כמו עוצמת כאמור לעיל, דומה וריאציות בטווח המידות יחיד עלול גם להיגרם על ידי התנועה PM, למשל, z-להיסחף או מבני נעים באיטיות גדולים. עם זאת, אם נרקב אקספוננציאלית דומה מופיע כל המדידות, photobleaching יהיה המקור הסביר ביותר. באופן כללי, ניתן לשלב ערכות תיקון, למשל, העוצמה סינון, סינון CF מבוסס ושיטות נוספות כגון טרנספורם פורייה מבוסס סינון של האות איטי וריאציות תדירות שטח27.

Figure 4
איור 4 . ניתוח segment-wise של סריקת קרינה פלואורסצנטית מדידות קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה של שליטה קרוס-מתאם שלילי. (א) עוצמת קרינה פלואורסצנטית (F1) וירוק הערוץ האדום (F2) בין שני מקטעי זמן שונות (כל אחת מהמידות נותחו בקטעים 20 ~ 20 s כל), שהושג מ sFCCS מידה של שליטה שלילי. CCFs (B) של כל המקטעים 20. CCFs עבור מקטעים 1 ו- 2 מסומנים בצבעי אדום וכתום, בהתאמה. (C, D) הערכה ACFs של כל פלח ירוק (C) ו אדום ערוץ (D). ACFs עבור מקטעים 1 ו- 2 מסומנים בצבעי אדום וכתום, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . לפליטת סריקה קרינה פלואורסצנטית מדידות קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה תא-תא באנשי קשר, ביטוי לשליטה קרוס-קורלציה שלילית. (א) זריחה מלא סדרות זמן למדידה המיתר (F1) וירוק הערוץ האדום (F2). הקווים האדומים מוצק מייצגים התאמה זוגית-מעריכית של סדרת הזמן בכל אחד מהערוצים. (B, C) CFs (ירוק: הערכה ACFs בערוץ ירוק, אדום: הערכה ACFs בערוץ אדום, כחול: CCFs) של קרינה פלואורסצנטית סדרת הזמן המוצגים באותיות A, המחושב על-ידי (B) מתאם את כל מדידה או (ג) מתאם 20 מקטעים בנפרד, ממוצע של פחות מעוותת CFs ~ 80% (ערוץ ירוק), ~ 50% (ערוץ אדום) המקטעים. קווים מלאים מייצגים התאמה של מודל דיפוזיה דו-ממדית על הנתונים. (ד) זריחה מלא זמן סדרת ובכושר כפול-מעריכית (קווים אדומים מוצק) מדידה מאופיין הלבנת משמעותי (F1) וירוק הערוץ האדום (F2). (E, F) CFs (ירוק: הערכה ACFs בערוץ ירוק, אדום: הערכה ACFs בערוץ אדום, כחול: CCFs) של קרינה פלואורסצנטית סדרת הזמן המוצגים ב D, המחושב על-ידי (E) מתאם את כל מדידה או (F) החלת התיקון הלבנה, משוואה 1, מתאם 20 מקטעים בנפרד, בממוצע של CFs לפחות מעוותת של ~ 90% (שני ערוצים) המקטעים. קווים מלאים מייצגים התאמה של מודל דיפוזיה דו-ממדית על הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כמו הגישה המשלימה של sFCCS, ccN & B (איור 1C) יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון לאחר ערבוב התא. בניגוד sFCCS, ccN & B מספק מידע על חלבון dynamics, אבל מאפשר מדידת טרנס אינטראקציות לאורך הקשר התא-התא כולו במישור מוקד אחד. מדידות על דגימות APLP1 בוצעו לפני ואחרי טיפול עם 50 מיקרומטר ZnCl2, כמו גם על הפקד myr שלילי-דקל. מדידות אלה רגישים תנועות התא, במיוחד עבור דגימות יון מטופלים אבץ, הדורשות רכישת ממושך פעמים להביא בחשבון הדינמיקה איטי של אשכולות APLP1. לכן, אלגוריתם יישור התמונה בוצע כדי לתקן לתנועה לרוחב של תאים33. בנוסף, קרון מטען לסנן22 (8 מסגרות בתיבה גודל, ~ 5 s) הוחל להסיר את תנודות בתדר נמוך של האותות נמדד. הליך זה דומה מאוד אחרים המסננים בהם נעשה שימוש בניתוח N & B מעורבים המקומית ממוצע של37 או detrending18,34, אך שומר את הנתונים המקוריים מזויפת, קרי, פיקסלים מטופלים באופן עצמאי ולא ממוצע של חיבור או חיסור של אותות מתבצע. הליך זה ביעילות העלמת תנודות מאריכים על פרקי זמן ארוכים יותר מאשר גודל תיבת22. בעקבות ניתוח נתונים כאלה, ערכי הבהירות קרוס-המתאם עבור כל הדגימות הושוו על ידי איגוד כל הפיקסלים קשר תא-תא בהיסטוגרמה קרוס-המתאם בהירות. עבור APLP1, בהעדר אבץ יונים (איור 6A וד' 6), ממוצע חיובי Bcc של 0.068 ± 0.004 (זאת אומרת ± SEM, n = 18 תאים) נצפתה. לאחר תוספת יון אבץ (איור 6B ו- 6E), הערךcc B עלה ל 0.266 ± 0.006 (זאת אומרת ± SEM, n = תאים 19). עבור הפקד שלילי (איור 6C ו- 6F), זוהה בהירות נמוכה יותר חוצות-המתאם הממוצע (Bcc = ± 0.022 0.002, זאת אומרת ± SEM, n = תאים 26). כדי להעריך את סטויכיומטריה של מתחמי APLP1 תא-תא באנשי קשר, הבהירות של APLP1-mEYFP היה מנורמל באמצעות הערך הממוצע שהתקבל על סך myr-דקל-mEYFP (כלומר., הפקד שלילי) והיא תוקנה עבור כמות בלתי-פלורסנט חלבונים23. מסכים עם נתונים sFCCS, התפלגות בהירות היה מרוכז סביב ערך התואם הדימרים (איור 6G), בהיעדר אבץ יונים, רומז ממוצע סטויכיומטריה 2:2. לאחר הטיפול יון אבץ, הבהירות מנורמל חריפה העביר ערכים גדולים יותר, החל מ 10 ~ ל ~ 60 (איור 6H), קרי, stoichiometries של-10:10 לפחות או גדול יותר, שוב בהסכם טוב עם נתונים sFCCS.

Figure 6
איור 6 . קרוס-המתאם והבהירות של מספר מדידות של אינטראקציות APLP1 תא-תא באנשי קשר. (א-ג) נציג ccN & B תמונה מסגרות של תא-תא קשרים בין APLP1-mEYFP APLP1-mCardinal לביטוי HEK 293T תאים ללא (A), עם אבץ יונים (B) או myr-דקל-mEYFP ו- myr-דקל-mCardinal לבטא תאים שליליות כמו קרוס-מתאם שליטה (C). גודל ברים הם 5 מיקרומטר. (D-F) צלב-המתאם היסטוגרמות בהירות (Bcc) של פיקסלים בחן כל ותאים המתקבל ccN & B ניתוח תומש תא-תא APLP1 דגימות (D), אבץ שטופלו APLP1 דגימות ( E) ודוגמאות המכילה myr-דקל-mEYFP ו myr-דקל-mCardinal (F). (G, H) מנורמל בהירות היסטוגרמות דוגמאות APLP1 (G: ללא אבץ יונים, H: עם אבץ יונים) עבור הערוץ הירוק (mEYFP) המתקבל בהירות ניתוח של תאים באותו ROIs המשמשים לחישוב של Bcc. שיבוץ בסול מראה הגדלה של טווח הבהירות מנורמל-2 עד 10. ערכי הבהירות תוקנו עבור פלורסנט שאינן mEYFP על סמך מדידות N & B של myr-דקל-mEYFP-mEYFP הומו-הדימרים הביע HEK 293T תאים, שנמדד תחת אותם תנאים23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

על מנת לבצע את ccN & B ניתוח, כיול זהיר גלאים יש לבצעו. עבור הגדרת הניסוי השתמשו במחקר זה, הצורך כגון כיול של הגף כאשר הבהירות מולקולרי נותחה בדגימות קבוע (קרי, בהיעדרו של תנודות מספר). במקרה זה, הבהירות מולקולרית צפוי להיות אפס על פי משוואת 10, מאז הסטיה צריכה לנבוע רק גלאי רעש. עם זאת, רועי המכיל רק רקע (משותק) פיקסלים היה שנותחה (איור 7א ו 7 ב), נקבע הבהירות חיובי של ~0.1 cts./(MOL x dwell time). ערך דומה הושג N ביצוע & B מדידות של תאים 293T HEK לבטא glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, איור 7C) עם משתנה בלייזר הבהירות מולקולרית נמדד על הכוחות והשערות עוצמת הלייזר אפס. כדי לתקן בשביל האפקט הזה, נוכל לבצע כיול שיטתית של הגלאי, כפי שדווחה בעבר (ראה משוואת 12)19,20. אנחנו ולכן מדדו את השונות כפונקציה של גלאי ספירת קצב על מדגם המורכב פתרון הפלורסנט מיובשים וקבעה את פרמטרי S, Equation 24 , ההיסט קצב הספירה כהה. האחרון היה המתקבלים מדידת עוצמת בעוצמה אפס לייזר, היה, במקרה שלנו, זניח. מתוך התאמה לינארית של השונות לעומת העוצמה מגרש, קבענו, לפי משוואת 14, מדרון של S = 1.1 ולאחר רעש readout זניח. הערכים נחוש (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) ואז שימשו כדי לחשב נכונה בהירות מולקולרית של מספר לפי משוואות 12 ו- 13-19. לחלופין, ניתן להחיל ערכת תיקון אמפירי יותר מבוססת על העובדה כי רעש גלאי superpoissonian, קרי, ~ 10% רעש גדול יותר מאשר Poissonian ירה רעש, גם יסביר את ההתבוננות בהירות המולקולרי חיובית ב פיקסלים ללא מספר תנודות. באמצעות הנחה זו, בהירות נחוש ~0.1 cts./(MOL x dwell time) בפיקסלים כזה יכול להיחשב בהירות קבועה לקזז, וכך צריך להיות מופחתים של כל ערכי הבהירות מחושב עם המשוואה 10. והכי חשוב, שניהם תיארו גישות להוביל אותן תוצאות בעת חישוב יחס בהירות, ארוך כמו Equation 24 , היסט זניחים. ראוי לציין כי בין מיקרוסקופים שונים מאותו סוג (הספק זהה, אותו מודל, גלאי חאספ במצב הספירה פוטון) ערכים שונים S נצפו, המדגיש את הצורך כיול גלאי זהיר על כל כיוונון בודדים.

פרמטר חשוב נוסף להשפיע על ביצועי גלאי במדידות בהירות זה גלאי הזמן מת. כמו בעבר הוכח, הפעם מת גלאי יכול להפחית באופן משמעותי הבהירות מולקולרית שאותרו, אפילו במחירים ספירת בינונית (מעל2-10 103 kHz)38. כדי למנוע את החפץ, מדידות גם לבצע במחירים ספירה נמוכה יותר, או הזמן מת צריך להיות מכויל המבוסס על ביצוע N & B או FCS בסדרה דילול של, למשל, EGFP ב בופר. לאחר מכן, מונה נמדד המחירים ניתן לתקן באמצעות זמן מת מכוילת של38. עבור ההתקנה השתמשו במחקר זה, כגון כיול באמצעות N & B על פתרונות צבע מדולל חשף ערכי הבהירות מולקולרית יציבה עד ספירת שערי ~0.5 מגה-הרץ וזמן מת המקביל של ~ 6 ns (איור 7E). הירידה במחירים ספירה גבוהה יותר ניתן לתקן ובכך באמצעות של תיקון שפורסמו בעבר נוסחה38, והתוצאה היא ערך הבהירות מתמדת של ~ 8 kHz/מול.

Figure 7
איור 7 . גלאי כיול עבור ניתוח מספר והבהירות. (א) תמונת הנציגה של המדידות N & B תאים HEK 293T לבטא GPI-mCherry. רועי (מלבן מקווקו כחול) נבחר ברקע. (B) פיקסלים בהירות היסטוגרמה של פיקסלים כל רועי המוצגים ב A. הבהירות הפיקסלים הממוצע, המתקבל מתאים ההיסטוגרמה בהירות פיקסל עם פונקציה לפי עקומת גאוס, הוא ~0.1 cts./(MOL x dwell time). הנתונים היו רכשה 25 µs פיקסלים להתעכב זמן. בהירות מולקולרית (C) המתקבל ניתוח N & B של GPI-mCherry מבוטא בתאי HEK 293T, הנמדד על שלושת הכוחות לייזר שונים (6 תאים, 561 עירור ננומטר, 25 µs פיקסלים להתעכב זמן). הנתונים מוצגים מתכוון ± SD. רגרסיה ליניארית (הקו האדום) מספק ערך היסט של 0.11 cts./(MOL x dwell time) ± 0.02. (D) העלילה של פיקסל השונות כפונקציה של עוצמת פיקסל מן המידות N & B של פתרון יבשים של צבע פלורסנט (מתרגשת-561 nm), במאגר של כל הפיקסלים של מדידות מרובות אזורים שונים של המדגם. הקו האדום מוצק מראה התאמה לינארית של הנתונים, וכתוצאה מכך מדרון של 1.1, מתן הגורם S של הכיול גלאי. בהירות מולקולרית (E) כפונקציה של גלאי ספירת קצב, המתקבל המדידות N & B של פתרונות fluorophore מדולל (מתרגשת-488 ננומטר). ערכת תיקון שפורסמו בעבר38 הוחל שימוש ערכים אפשריים שונים עבור הזמן מת גלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההליך ניסיוני המתוארים כאן מאפשר החקירה של חלבון טרנס אינטראקציות תא-תא באנשי קשר, העסקת פלורסצנטיות תנודות ספקטרוסקופיה טכניקות, כלומר sFCCS, ccN & B. שיטות אלה כוללות ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות הנפלטים על ידי שני FPs spectrally מופרדים דבוקה protein(s) עניין אצל איש קשר של שני תאים סמוכים, אחד אחד או את חלבון כימרי אחרים. הנוכחות של טרנס מתחמי לכמת על-ידי בודק את מידת שיתוף דיפוזיה של חלבונים ב- PMs שכנות. בנוסף פרוטוקולים מפורט על הכנת הדוגמא, רכישת נתונים וניתוח, מאמר זה מספק ראיות של יישום מוצלח וזמינותו על חלבון אדהזיה עצביים APLP1. אנו מראים כי APLP1 עובר ספציפי, אינטראקציות טרנס homotypic תא-תא באנשי קשר. יתר על כן, אבץ יונים לקדם היווצרות של APLP1 אשכולות של הקשר תא-תא מספקים פלטפורמה multivalent עבור טרנס אינטראקציות ו, לכן, זירוז משופרת טרנס מחייב.

בניגוד מבחני הקודם כדי לזהות כזה אינטראקציות המבוסס על שיטות ביוכימיות משובש6, הגישה שהוצגו יכול להתבצע ישירות על תאים חיים, ללא צורך קיבוע או בידוד של מתחמי חלבון. בנוסף, היא מספקת מולקולרית ירידה לפרטים ומידע על ידי זיהוי של חלבונים פלורסנט גנטית דבוקה החלבון של עניין, בניגוד מבחני איכותי הקודם8,9. אחרת לבין גישות אחרות פלורסצנטיות מבוסס כמו סריג10 וקרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה11, יש ללא דרישה עבור התוויות פלורסנט להיות מתורגמות בצד חוץ-תאית (העלול להפריע אינטראקציות חלבון-חלבון). עם זאת, יש לציין כי C-מסוף FPs יכול עדיין לשנות האיגוד רכיבים תאיים, למשל, חלבונים מתאם לתווך אינטראקציות עם שלד התא. ראוי לציין, וזמינותו ישימה גם הומו - וגם אינטראקציות heterotypic.

כמה דרישות עבור יישום מוצלח של וזמינותו שהוצגו הם ראוי להזכיר. השיטות תנודות פלורסצנטיות שבוצעו מבוססים על מדידות זמני הדורשים בהיר photostable FPs monomeric, אשר הוא אילוץ העיקריים עבור רבים FPs אדום23. אף-על-פי שיטת סריקה הציג הוא מתאים במיוחד החקירה של הדינמיקות איטי של חלבונים transmembrane, אשר בדרך כלל מעורבים באינטראקציות תא-תא, photobleaching שיורית עדיין עלולה להתרחש. לכן, אנו מציגים תיאור מפורט של ערכות תיקון, קרי, תיקון הלבנת עבור מסנן sFCCS, שהקרון עבור ccN & B, אשר למזער לפליטת כזה. עוד, לדבר על אלגוריתמי יישור מספריים ולתיקון ביעילות אחר לפליטת שיטתית, כגון תנועה לרוחב של תאים, ואנו מספקים הנחיות להסרת instabilities ארעית. המקור העיקרי של instabilities כזה הוא התחבורה vesicular, קרי, תאיים שלפוחית נושא החלבון עניין transiently מזין את אמצעי האחסון מוקד. למרות משתנה ממקרה למקרה, תופעה זו יכולה באופן כללי קשות להפריע רכישת נתונים וניתוח. עם זאת, היישום של אלגוריתמים תיקון משפר את היציבות של רכישת, המאפשר מדידה מורחבים פעמים שהם צריכים בדיקה הדינמיקות דיפוזיה איטית במיוחד. בהקשר זה, זה חייב להיות בקו תחתון כי הנוכחות של דינמיקה דיפוזיה היא תנאי הכרחי עבור פעולת השירות לעבודה. הדוגמה של יון אבץ מתווכת מראה קיבוץ באשכולות APLP1 דוגמה דרסטית של מתחמי חלבון גדולה, איטית מאוד (D ≈ מיקרומטר 0.0012/s) לדחוף את הטכניקה לגבולותיה ומניעת של כימות מדויק של הדינמיקה הבסיסית, בשל רעש גדול המושרה על ידי רכישה מוגבלת זמן30,17.

בהקשר זה, ההתקדמות על סירוק sFCS ו סופר רזולוציה גישות, למשל, סריקה פליטה מאולצת דלדול FCS (STED-FCS), עשוי להיות מועיל על ידי מתן של מוקד נפח קטן יותר ובכך קטן דיפוזיה יעילה פי39 ,40. . זה גם יכול לעזור לפתור חלבון אשכולות במקרה הסבת inhomogeneous של החלבון עניין על המגעים תא-תא, כפי שנצפו APLP1 בנוכחות אבץ למרבה הצער, יישום קרוס-המתאם של סריקה STED-FCS, קרי, STED-FCCS, יכול ישירות להחיל כאן, לא בהצלחה הוכח עדיין בשל הקושי הכרוך באיתור צבעים תואמים עבור שני צבעים STED-FCS. במקרה של דינמיקה מספיק מהיר (D ≥ ~0.05 מיקרומטר2/s), ניתוח sFCCS מאפשרת לכמת פעפוע של חלבונים תא-תא באנשי קשר או באזורים אחרים של PM12.

יתר על כן, ניתן לבצע ניתוח בהירות עבור כל הנתונים (sFCCS, ccN & B), מתן הערכה של סטויכיומטריה של טרנס מתחמי חלבון. יצוין, כי הדיוק של כימות סטויכיומטריה מגביר עם כמות חלבונים שקושרים טרנסג'נדרים (קרי, אם ישנם רק כמה cis קומפלקסים אשר יכול להשפיע גם על הקביעה בהירות). בהירות ניתוח אינו מאפשר פתרון תערובות של מצבים oligomeric שונים, e.g.,cis מונומרים ו טרנסג'נדרים tetramers. יותר באופן כללי, יצוין N & B אין אפשרות לפענח את תערובות של מינים שונים oligomeric homogeneously מופץ במדגם. אם מספר מינים נמצאים בתוך הפיקסל, יהיה ערך בודד אחד של בהירות נמדד (קרי, ממוצע משוקלל של הבהירות של כל מין oligomeric). התפלגות סטטיסטית ערכי הבהירות הנצפה (למשל, בפיקסלים שונים) לא מחובר ישירות כמויות יחסיות של מינים oligomeric. כדי לפתור את תערובות כזה, יש להשתמש בשיטות אחרות (למשל, העוצמה המרחבי הפצה ניתוח (SpIDA)41, פוטון ספירת היסטוגרמה (PCH)42). באופן דומה, כימות של המתאם בין ספקטרלי ב- sFCCS מספק של כימות מדויק של השבר של חלבונים המאוגדים והלא מאוגדים רק עבור פשוטה, הידוע stoichiometries, למשל, 1:1. עבור סטויכיומטריה מורכבים יותר, עוד יותר הנחות חייב להיעשות43. בסך הכל, בהירות ניתוח נשאר כלי ניסיוני רב עוצמה, אם מערכת גלאי לבין השבר של הלא-פלורסנט FPs מכוילת23 כפי שמתואר הפרוטוקולים.

למרות שהיישום המובאת כאן מתמקדת אינטראקציות חלבון בתאים חסיד, ניתן להחיל וזמינותו לטווח רחב יותר של דגימות, למשל, ההשעיה תאים. עבור מערכות כאלה, תיקון לתנועה לרוחב התא עשוי להיות קריטי במיוחד. בנוסף, ניתן בקלות להחיל אותה למערכות ממברנה מודל כמו האנשים שנגדם או GPMVs, המאפשר כימות של אינטראקציות מולקולרית בתנאים מבוקרים היטב, למשל, יצירות שונות השומנים או ממברנות חסר המאורגנת שלד התא. בעת ביצוע sFCCS על שלפוחית כזה, תנועה אנכית עלול לגרום לתנודות איתותים נוספים, אך ניתן למזער בעת התמקדות שלפוחית גדול. בהקשר זה, צירופים מרובים הם מבטיחים, בוס - למשל, / GPMV-תא ערבוב12. כפי שמוצג בפרסום האחרונות, היווצרות של המערכת החיסונית הסינפסות להיות המודל בהצלחה על ידי מערכות כאלה44. לפיכך, וזמינותו הציג בהחלט יהיה שימושי עבור החקירה של מגוון רחב של אינטראקציות תא-תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן בחלקו על ידי דויטשה פתוח (DFG) להעניק 254850309. המחברים מודים Luckner מכירה את מאדלן על קריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Tags

ביוכימיה בעיה 142 חלבון אינטראקציות אינטראקציות תא-תא תא-תא אדהזיה קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה מספר בהירות N & B
Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunsing, V., Chiantia, S. A… More

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter