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Behavior

Nichtinvasiver In-Pen-Ansatztest für Imlabor-Schweine

Published: June 5, 2019 doi: 10.3791/58597
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 3, 4, 5,6, 4,5
1Animal Sciences and Industry, Kansas State University, 2DynaSim Technical Services, INC, 3Center for Injury Biomechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Applied Research Associates, Inc., 5Lucent Research, LLC, 6Department of Neurological Surgery, University of Washington

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Verhaltenstest – den menschlichen Ansatztest im Hausgehege der Schweine –, um funktionelle Defizite bei Laborschweinen nach subkonkussiven traumatischen Hirnverletzungen zu erkennen.

Abstract

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) haben sowohl in zivilen als auch in militärischen Bevölkerungsgruppen zugenommen, und viele Forscher nehmen ein Schweinemodell für TBI an. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen für TBI gibt es nur wenige Verhaltenstests, die standardisiert wurden. Ein größeres Tier erfordert eine invasivere Handhabung in Testgebieten als Nagetiere, was den Reaktionen der Tiere möglicherweise Stress und Variation verleiht. Hier wird der Human Approach Test (HAT) beschrieben, der entwickelt wurde, um vor dem Hausstall von Laborschweinen durchgeführt zu werden. Es ist nicht invasiv, aber flexibel genug, dass es Unterschiede in der Wohnungseinrichtung ermöglicht.

Während des HAT wurden drei Verhaltens-Ethogramme entwickelt und dann eine Formel angewendet, um einen Ansatzindex (Ki) zu erstellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der HAT und sein Index, AI, empfindlich genug sind, um leichte und vorübergehende Veränderungen im Verhalten von Schweinen nach einem milden TBI (mTBI) zu erkennen. Darüber hinaus reduziert die Verwendung einer KI, obwohl spezifische Verhaltensergebnisse wohnungsabhängig sind, Variationen und ermöglicht konsistente Messungen im Labor. Dieser Test ist zuverlässig und gültig; HAT kann in vielen Laboratorien und für verschiedene Arten von Schweinemodellen von Verletzungen, Krankheiten und Leiden verwendet werden. Dieser Test wurde für eine optimierte manuelle Zeitstempelmethode entwickelt, so dass der Beobachter konsequent nicht mehr als 9 min für jede Probe aufgibt.

Introduction

Human esTBI wird oft durch funktionelle Defizite definiert, trotz des Fehlens globaler struktureller Veränderungen oder signifikanter Ödeme im Gehirn1,2,3. Tatsächlich ist bei einigen mTBI-Patienten das charakteristische Merkmal dieser Verletzung eine Veränderung ihres psychologischen Zustands in Ermangelung neuroanatomischer Veränderungen4,5. Wir verwendeten ein Schweinemodell von mTBI 6, weil das Gehirn von Schweinen sowohl anatomisch als auch physiologisch näher am Menschen ist als Nagetiere7, und entsprechende Messungen könnten einen relevanten Satz gemeinsamer Datenelemente mit Menschen liefern.

In den letzten Jahren hat das Schweinemodell das Interesse von Neurotrauma-Wissenschaftlern und mTBI-Stakeholdern für präklinische Untersuchungen geweckt; Im Gegensatz zu Nagetiermodellen von TBI gibt es jedoch nur wenige standardisierte Verhaltenstests, die die Beurteilung des affektiven Zustands des Laborschweins (d. h. des psychischen Zustands)7,8,9, 10. Ein langfristiges Ziel für unser Labor ist die Entwicklung mehrerer, komplementärer Verhaltens-Toolsets, die empfindlich genug sind, um zu messen, wann die Schweine unterklinische Krankheit leiden oder wenn sich Tiere in einem präpathologischen Stresszustand befinden.

Wiederholte Verhaltenstests, die die Veränderung des affektiven Zustands bei einem Laborschwein messen, können gute Kandidaten für die Unterscheidung eines Tieres mit einem präpathologischen Zustand von gesunden Tieren sein. Zum Beispiel wurden IN-Pen-HATs für die kommerzielle Schweineproduktion verwendet, um Landwirten zu helfen, gesunde Schweine mit gutem Temperament auszuwählen oder Management- und Wohnstrategien zu ändern, die Not, Verletzungen und Krankheiten verursachten11,12. Diese Tests wurden verwendet, um die Motivation und den gesamtaffinen Zustand eines Schweins oder einer Gruppe von Schweinen zu quantifizieren13.

Unser Labor und andere Forscher haben die Motivation bei Schweinen gemessen, indem sie drei Verhaltenskategorien quantifiziert haben: 1) Explorativzustände, die durch nicht nutitives orales Verhalten (NNOB) ausgedrückt werden, bei dem das Schwein seinen Mund, seine Schlaufe oder sein Gesicht zum Schnüffeln, Lecken, Kauen, und Wurzel ein Substrat, oder sie ersticken ohne Substrat14,15; 2) räumliche Beziehungen des Schweins zu einem Objekt odersein 16; 3) Nasenrichtung, die anstelle von Augenkontakt verwendet wird, weil Schweine monokulare17haben, aber kurzsichtiges Sehen, und sie priorisieren ihren Geruchssinn gegenüber Vision18. Wenn ein gesundes Schwein den Menschen mit lohnenden Reizen verbindet, drücken sie eine hohe Frequenz von NNOB aus, richten ihre Nase auf den Menschen und versuchen, näher an der Nähe des Menschen zu gewinnen11,16. Jedoch, nach Krankheit, Verletzung, oder eine beunruhigende Erfahrung, Motivation, auch angenehme Reize zu suchen reduziert wird, und damit, diese messbaren Verhaltensweisen sind wahrscheinlich reduziert19. Schweineverhaltensforscher stellten fest, dass Anhedonia, der Mangel an Motivation, angenehme Reize zu erleben, bei Schweinen in ihrer häuslichen Umgebung erkennbar und messbar ist20. So können wiederholte HATs (vor und nach der Behandlung) als empfindliche Maßnahme dienen, um Laborschweine, die mit subkonkussivem mTBI behandelt wurden, von scheinbehandelten (nur Anästhesie) Probanden zu unterscheiden. Anhedonia ist ein affektiver Zustand, in dem TBI-Patienten21erleben können. Der hier verwendete HAT hat das Potenzial, die Übersetzung von Verhaltensbefunden aus einem Tiermodell in die klinische Arbeit zu rationalisieren. HATs können im Laufe eines Experiments täglich verabreicht werden, was auch dazu beitragen kann, die Versorgung von Laborschweinen zur Optimierung des Tierschutzes und der Tierhaltung zu standardisieren22.

Hier bei Verwendung des HAT werden die Verhaltensunterschiede untersucht, die sich aus mTBI bei Minischweinen ergeben. Die Minimierung der Verhaltensvariabilität wurde durch die Verwendung nichtinvasiver Maßnahmen des HAT erreicht und ermöglichte es den Schweinen, sich an ihre Hauspenspen, routinemanagement und eine tägliche Behandlung zu akklimatisieren. Traditionell wird eine Testarena verwendet, um Verhaltensweisen zu messen (z. B. Open-Field-Test). Ein In-Pen-Test kann in Labors mit begrenztem Platzbedarf hilfreich sein. Das Bewegen und Behandeln von Schweinen in einer Testarena kann eine Stressreaktion (Distress oder Eustress) verursachen und möglicherweise die Variation der Reaktionen auf den Test verstärken. Ein In-Pen-Test entfernt diese Handhabungskomponente und reduziert daher wahrscheinlich Variationen von Handhabungsspannung17. Aus diesen oben genannten Gründen haben wir für dieses mTBI-Modell einen täglichen IN-Pen-HAT entwickelt.

Standardisierte und quantifizierte Maßnahmen, die den affektiven Zustand des Tieres angemessen definieren, sind wichtige Aspekte bei der Entwicklung eines neuen Verhaltenstests. Darüber hinaus sollten Tests in mehreren Laboratorien wiederholbar sein. Hier wurde der HAT für die Entwicklung dieses Protokolls in den verschiedenen Gehäusesystemen von drei Laboratorien getestet. Drei Subethogramme wurden erstellt, um bestimmte Verhaltensweisen aus Beispielvideos zeitstempelspezifisch zu erstellen. Als nächstes wurde eine gewichtete Formel erstellt, um die drei Thogramme zu integrieren und die Verwendung von HATs in mehreren Laboratorien zu ermöglichen. Obwohl dieser Test speziell für Minischweine entwickelt und verwendet wurde, die mit subkonkussivem mTBI behandelt wurden, werden die hier entwickelten Methoden und Protokolle Anwendungen zur Unterscheidung des Unterschieds zwischen einem subklinisch verletzten/kranken oder beunruhigten Schwein und einem gesundes Schwein.

Die Verhaltensergebnisse können durch Einzel- und Gruppengehäuse, Freiraumzulage, die Art des verwendeten Bodens, die Art des verwendeten Zauns, die Lage der Fütterung und des Wassers, den Defäkationsbereich und die Umweltanreicherungsstelle beeinflusst werden. Daher wurden drei Wohnungstypenuntersucht (Abbildung 1): Der Wohnungstyp A befand sich an der Kansas State University (Manhattan, KS); Gehäuse typ B und C waren an der Virginia Tech University (Arlington, VA). Der individuelle Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an jedem Standort genehmigte die Nutzung der Einrichtungen und Verfahren.

Zur Entwicklung des Ethogramms des Gehäusetyps A (Abbildung 1A), Minnesota-Cross Mini-Schweine (Schweine = 7, vergoldet = 1; National Swine Research Resource Center, Columbia, MO; Alter = 25,6 bis 3,66 Wochen [Mittelwert bei Standardabweichung (SD)] wurden in Einzelstiften mit tierfreundlichem Bodenbelag (IACUC #3881) untergebracht. Die Schweine, die für dieses Protokoll verwendet wurden, waren bei guter Gesundheit, da keine Behandlungen angewendet wurden. Für die Entwicklung des Protokolls für die Unterbringung vom Typ B wurden Yucatan-Minischweine (Alter = 25,3 x 2,80 Wochen [Mittelwert SD] in Virginia Tech-Einrichtungen (IACUC #15-060) einzeln untergebracht (Abbildung1B). Tierbehandlungen werden an anderer Stelle beschrieben29 und beinhaltet die Induktion von subkonkussiven mTBI mit Strahlwellenüberdruck oder Scheinkontrollen (nur Anästhesie). Für die Entwicklung des Wohnprotokolls Typ C wurden fünf göttliche Minischweine (Alter = 23,7 bis 1,18 Wochen) bei Virginia Tech in einem großen Stift gepaart (Abbildung1C; IACUC #15-060). Die ersten beiden Gehäuse sind typische Laborunterkünfte oder enthalten Einhausschweine. Gehäuse typ C ist eine atypische Wohnumgebung, die zwei oder mehr Schweine beherbergen kann und eher als eine angereicherte Umgebung als standardlaboriertes Gehäuse angesehen werden kann. Dieses Protokoll kann für gehäusetypen verwendet werden, wenn die folgenden Methoden befolgt werden.

Protocol

Die einzelnen IACUC an jedem Standort (Kansas State University und Virginia Tech University) genehmigten die Nutzung von Einrichtungen und Verfahren.

1. Einrichtung der Kameras und Stifte und Einrichtung einer Routine

  1. Bevor Sie die Tiere in ihre Stifte legen, fixieren Sie Kameras in einem 90°-Winkel über jedem Stift (siehe Materialtabelle für ein vorgeschlagenes Kamerasystem).
  2. Zeichnen Sie Tiere kontinuierlich bei 30 Frames/s (fps) auf, entweder für die Dauer der Studie oder nur während der Testsitzungen.
  3. Fix Schalen, Wasserer, Matten und Spielzeug mit Schrauben und Ketten.
  4. Platzieren Sie Sound-Maschinen, diekontinuierlich weißes oder rosa rauschendes Rauschen (z. B. das Geräusch von Wasserfällen) in der Schweineanlage abspielen.
    HINWEIS: Externe plötzliche Geräusche (z.B. Öffnen und Schließen von Türen) können während der Sitzungen23,24einen Erfahrreflex verursachen.
  5. Randomisieren oder schichten Sie Behandlungen per Stift in der gesamten Einrichtung.
  6. Richten Sie eine etablierte Tierhaltungsroutine ein. Dies wird den Schweinen helfen zu wissen, wann sie erwarten, dass Menschen die Stifte reinigen, füttern und behandeln und den Test durchführen.
    1. Verwenden Sie eine vertraute Leckerei, damit die Schweine Menschen mit einer Belohnung assoziieren können.
    2. Verwenden Sie einen Klicker während der Belohnung, damit die Schweine den Klickton mit einer Belohnung verknüpfen können. Verwenden Sie keine Vokalisationen und visuellen Signale, um die Schweine mit der Belohnung vertraut zu machen (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Führen Sie die Sitzungen vor dem Morgenmahl oder vor der Platzierung eines neuen Futters für ad libitum gefüttertschweine.

2. Identifizierung der Schweine

  1. Machen Sie Themen im Videofeed identifizierbar, auch wenn sie einzeln untergebracht sind.
  2. Stellen Sie sicher, dass Beobachter blind für Behandlungen bleiben und während der Zeitstempelung mit einem Markierungssystem, das nichts mit Behandlungen zu tun hat, unvoreingenommen bleiben. Verwenden Sie ein medizinisches Klebeband (siehe Materialtabelle), das an einem Streifen von Klebeband mit einer bestimmten Farbe, runden Form und einem Muster haftet.
  3. Verwenden Sie einen runden Patch, um die Oberseite des Schweins zu markieren, und einen auf jeder Seite (siehe Abbildung 1, grüne und blaue Markierungen).
  4. Schmieren Sie Tag Zement (weniger als 0,35 g) auf den Bandecken, um die Lebensdauer der Haftung zu erhöhen.
    HINWEIS: Zu viel Tag Zement wird nicht sehr schnell trocknen, wodurch das Band vorzeitig abfällt.
  5. Beheben Sie die Markierungsstrategie während der Akklimatisierungsphase und passen Sie sie so an, dass offizielle Tests effizient und ohne zusätzliche Belastung für die Schweine durchgeführt werden.
  6. Verwenden Sie Datenerfassungsblätter, um die Markierungen und die Betreffidentifikation nachzuverfolgen (siehe Ergänzende Datei 1 für ein Beispieldatenblatt).
    HINWEIS: Um Band zu entfernen, reißen Sie das Band nicht ab, weil es Schmerzen verursacht, wenn ein Haar herausgezogen wird. Es kann entweder von selbst abschleppen, ein Gleitmittel auf Wasserbasis kann helfen, es zu vertreiben, oder es kann mit Clippern abrasiert werden. Wenn das Band zu unerwünschten Zeiten abfällt, bereiten Sie zusätzliches Markierungsband vor und tragen Sie es erneut auf, während das Schwein eine Mahlzeit isst, anstatt das Schwein zu bremsen.

3. HAT-Sitzungen

  1. Lassen Sie die Test-Menschen den gleichen Hut, Deckalls, Stiefel, Gerüche, etc. jedes Mal tragen, wenn die Sitzung durchgeführt wird.
  2. Führen Sie täglich, mindestens 3x, vor der Behandlung und danach täglich.
  3. Das Schwein kann sich in jedem Bereich in seinem Gehege befinden, bevor es mit der Sitzung beginnt. Um die Sitzung zu starten, bitten Sie den Test-Menschen, den Leckerbissen in der Schüssel oder vor dem Stift fallen zu lassen und klicken Sie auf den Klicker 3x.
  4. Der Testmensch muss seine Hände aus dem Anblick des Schweins legen und während der Prüfung stehen bleiben. Lassen Sie einen anderen Forscher den Beginn der Sitzung auf dem Datenblatt markieren und einen Timer starten. Nach 120 s signalisiert der Forscher dem Testmensch stillschweigend, zum nächsten Probanden zu wechseln und den Test neu zu starten.

4. Einrichtung von HAT-Ethogrammen für Software

  1. Konstruieren Sie Thogramme (siehe Abbildungen 1 und 2 und Ergänzendes Video 1) unter einem Projekt mit spezieller Software.
    HINWEIS: Räumliche Verhaltensweisen sind die Position des Tieres relativ zum Menschen. In den Ethogrammen müssen die räumlichen Beziehungen an den Stift des Tieres angepasst und jedes Mal veröffentlicht werden, wenn ein neuartiges Stift-Setup verwendet wird (Abbildung 1). Innerhalb dieser Kategorie gelten Verhaltensweisen als sich gegenseitig ausschließend. Der Raum ist in vier Bereiche mit unterschiedlichen Annäherungsstufen unterteilt (Abbildung 1). Die Bereiche sind über Gehäusetypen hinweg standardisiert. Am nächsten, oder Klettern (Cl) bedeutet, dass Schweine auf den Zaun klettern können, um Zugang zum Menschen zu erhalten; Daher wird Klettern als räumliches Verhalten betrachtet, das darauf hinweist, dass das Schwein am aktivsten nach menschlichem Kontakt sucht. Close (Co) bezeichnet den Bereich innerhalb von 61 cm des Menschen. Mid (M) ist der Bereich innerhalb von 61-122 cm vom Menschen. Weit (F) ist die Fläche von 123 cm oder mehr vom Menschen entfernt.
  2. Strukturelle Verhaltensweisen konzentrieren sich auf die Ausrichtung des ganzen Körpers oder Körperteile (Abbildung 2). Erstellen Sie zwei strukturelle Kategorien: 1) die Schweinenaseposition und 2) den aktiven Zustand des Schweins. Verwenden Sie Abbildung 2A, um die Richtung zu identifizieren (Richtung 1 bezeichnet, dass das Schwein seine Nase zum Menschen richtet; Richtung 2 bedeutet, dass das Schwein seine Nase vom Menschen weglenkt).
  3. Teilen Sie das Aktivitätsverhalten (Abbildung 2B) in drei sich gegenseitig ausschließende Ansatzzustände auf: NNOB, stand oder gehen ohne NNOB und Ruhen ohne NNOB (siehe Die Farbcodierung in den Ethogrammen im Video).
    HINWEIS: NNOB wird verwendet, um zu beschreiben, wenn ein Schwein seinen Mund, seine Schnarbe oder sein Gesicht benutzt, um ein nicht-nitrtives Objekt zu lecken, zu schnüffeln, zu kauen, zu beißen, zu reiben oder zu wurzeln, um entweder Vertrautheit oder neue Möglichkeiten zu suchen. Wenn es sich also in diesem aktiven Zustand befindet, interessiert es sich für den Menschen und für einen Annäherungszustand. Wenn Overhead-Kameras in 90°-Winkeln verwendet werden, sind die Nasenposition des Schweins und die Kopfbewegung Indikatoren von NNOB. Gelegentlich werden Schweine ersticken oder scheinkauen; die Nase kann gesehen werden, aber der Kopf bewegt sich auf und ab. Stand oder Walk ohne NNOB wird verwendet, um zu beschreiben, wenn das Schwein in der aufrechten Position ist, der Kopf still ist und die Nase kein Substrat berührt oder erstickt, was bedeutet, dass es sich in einem weniger anfahrtsberuhigten Zustand befindet. Ruhen ohne NNOB wird verwendet, wenn das Schwein durch Liegen oder Sitzen ruht, was der geringste Annäherungszustand unter dieser Kategorie von Verhaltensweisen ist.

5. Zeitstempelung der Videos für Effizienz und Zuverlässigkeit

  1. Bearbeiten Sie das Filmmaterial basierend auf den vom Datensammler aufgezeichneten Startzeiten in exakte 3 min Sitzungen. Die Methode für die Zeitstempelung dauert 9 min pro Sitzung.
  2. Verwenden Sie nur bis zu zwei geschulte Beobachter, um die Videos zeitstempeln zu können.
    ANMERKUNG:Wenn zwei Beobachter verwendet werden, sollte die Intra-Beobachter-Variation quantifiziert, ausgewertet, angepasst und dann als Pearson-Korrelationskoeffizient gemeldet werden, nachdem die Beobachter das gleiche Beispielvideo mit einem Zeitstempel versehen haben (für Methoden siehe Martin und Bateson25).
  3. Stellen Sie die Wiedergabegeschwindigkeit auf 1x reguläre Geschwindigkeit (d. h. 30 fps) ein. Pausieren, zurückspulen oder Zeitstempel frame nicht frame für Frame.
  4. Zeitstempel jeder Kategorie sich gegenseitig ausschließender Verhaltensweisen separat.
    1. Zeitstempel räumliche Verhaltensweisen. Starten Sie das Video neu.
    2. Zeitstempel-Strukturverhalten. Starten Sie das Video neu.
    3. Zeitstempel für Struktur-Nasen-Positionsverhalten .
  5. Verwenden Sie die Dauer der einzelnen Verhaltensergebnisse (siehe Ergänzende Videos 2 und 3), um Daten zusammenzufassen. Die Dauermessungen müssen in einen Prozentsatz der Zeit pro Kategorie konvertiert werden.

6. Approach Index

  1. Wenden Sie die Formel (Abbildung 3) an, damit jedes strukturelle und das räumliche Verhalten kombiniert wird, um eine KI zu erstellen (Abbildung 3, Abbildung 4). Die KI wird zusätzlich zu Denkverhalten und Kategorien separat als Abbildungen (Abbildung 5) oder in tabellarischer Form verwendet.
    HINWEIS: Softwaredetails finden Sie in der Tabelle der Materialien. Innerhalb jeder Kategorie werden die Verhaltensdauern zuerst in Prozente konvertiert (die Dauer der Verhaltensweisen dividiert durch die Gesamtdauer der Testsitzung). Jedes Verhalten wird basierend auf der Annäherungsebene gewichtet (Abbildung 3). Vermeidungsverhalten (der Prozentsatz der Zeit im fernen Bereich, ruhend, mit der Nase weggedreht) werden mit 0 multipliziert. Moderates Verhalten (der Prozentsatz der Zeit im mittleren Bereich, in Richtung des Menschen gedreht, und stehend mit dem Kopf still) werden mit 1 multipliziert. Die größten Annäherungsverhalten (der Prozentsatz der Zeit im nahen und nächsten Bereich und die Anzeige von NNOB) werden mit 2 multipliziert. Anschließend wird jede Kategorie weiter mit 3, 2 und 1 für Raum, Nasenausrichtung und Aktivität gewichtet. Eine Konstante (0,10) wird angewendet, um eine prozentuale Skala zu erstellen. Wenn sich das Schwein beispielsweise dem Menschen gegenübersieht, sich im nächstgelegenen/nächsten Bereich befindet und NNOB während der gesamten Testsitzung durchführt, beachten Sie, dass die KI 100 % beträgt (das rote Schwein in Abbildung 3). Im Gegensatz dazu, wenn das Schwein im fernen Bereich ist, nicht dem Menschen gegenübersteht und während der gesamten Testsitzung in der Ruheposition bleibt, beträgt die KI 0% (das schwarze Schwein in Abbildung 3). Schweine in der Nahzone können die gleiche KI haben wie ein Schwein, das NNOB im mittleren Bereich ausführt, wenn sie vom Menschen abgewandt werden und mit dem Kopf still stehen (die orangen schweinen in Abbildung 3).

Representative Results

Drei Gehäusetypen (A, B und C; siehe Abbildung 1) wurden in drei verschiedenen Laboratorien für HATs verwendet. Strukturelle Verhaltenskategorien sowie Kopf- und Körperorientierung wurden in HATs in allen Laboratorien und Experimenten verwendet, wie in Abbildung 2dargestellt. Tabelle 1 stellt die Daten dar, die aus allen drei Gehäusetypen und den beschreibenden Statistiken erhoben wurden, die anhand der Daten von vorbehandelten gesunden Schweinen während des HAT durchgeführt wurden. Als nächstes wurde eine Formel entwickelt, um eine KI aus den daten zu berechnen, die während der HATs gewonnen wurden (siehe Abbildung 3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung einer KI-verringerten Variation (Tabelle 1) in den gesammelten Daten. Dies ist ein wichtiger Befund, da weniger variable Daten die Verwendung von weniger Versuchstieren ermöglichen, um kleinere Unterschiede zu erkennen.

Für Tabelle 1wurden beschreibende Statistiken mit dem PROC UNIVARIATE-Verfahren erstellt (siehe Materialtabelle für spezifische Softwareinformationen). Um das Ergebnis des Gehäusetypverhaltens jedes Labors zu vergleichen, wurde das MIXED-Verfahren mit einem Modell für wiederholte Measures verwendet. Das Schwein wurde als Zufallsvariable behandelt. Der autoregressive Typ erster Ordnung wurde als Kovarianzstruktur ausgewählt. Mit der Tukey-Kramer-Anpassungsmethode wurden die kleinsten quadratischen Mittel getrennt. Die Signifikanz wurde definiert als P -0,05.

Als nächstes wurde festgestellt, ob dieselbe Person oder ein anderer menschlicher Experimentator für jede Testsitzung des HAT verwendet werden sollte. Um die ungewohnten Verhaltensreaktionen mit den bekannten Antworten zu vergleichen, wurde die MIXED-Prozedur mit einem Modell für wiederholte Measures verwendet. Das Schwein wurde als Zufallsvariable behandelt. Der autoregressive Typ erster Ordnung wurde als Kovarianzstruktur ausgewählt. Mit der Tukey-Kramer-Anpassungsmethode wurden die kleinsten quadratischen Mittel getrennt. Die Signifikanz wurde definiert als P -0,05. Wir stellten fest, dass es keinen Unterschied in der KI gab, wenn ein vertrauter Mensch verwendet wurde, im Vergleich zu dem Zeitpunkt, an dem während der Tests ein unbekannter Mensch verwendet wurde (siehe Daten in Tabelle 2). Wenn die Schweine nie irgendwelche negativen Wechselwirkungen mit Menschen hatten, verallgemeinerten sie in der Regel und assoziierten alle Menschen positiv mit Nahrung26.

Die Eingewöhnungszeit für das HAT-Protokoll wurde anhand der Anflugindizes der Schweine aus dem Stalltyp A (336 Testsitzungen) ermittelt. Die HAT begann am 8. Tag nach der Ankunft und wurde zweimal von dem vertrauten Menschen (der die Letzte Woche damit verbrachte, die Schweine zu behandeln) und von einem unbekannten Menschen (der zuvor keinen Kontakt mit den Schweinen hatte) durchgeführt. Um die Auswirkungen der Zeit auf die Ergebnisse des HAT zu bestimmen, wurde das MIXED-Verfahren mit einem Modell für wiederholte Messgrößen verwendet. Das Schwein wurde als Zufallsvariable behandelt. Der autoregressive Typ erster Ordnung wurde als Kovarianzstruktur ausgewählt. Mit der Tukey-Kramer-Anpassungsmethode wurden die kleinsten quadratischen Mittel getrennt. Die Signifikanz wurde definiert als P -0,05. Wie bereits erwähnt, haben die Daten keinen Unterschied zwischen den Antworten von vertrauter oder unbekannter menschlicher Exposition festgestellt (Tabelle 2). Die Akklimatisierungszeit wurde jedoch auf der Grundlage der Tage 9, 11 und 13 mit AIs bestimmt, die deutlich niedriger waren als alle anderen Tage. Die Basislinie sollte mindestens drei Messungen nach der Akklimatisierung enthalten, aber wir empfehlen sechs Sitzungen, um einen KI-Mittelwert als Kovariate in den Modellen zu berechnen.

Um festzustellen, ob HAT-Methoden mTBI-behandelte Schweine von scheinbehandelten Schweinen unterscheiden können, sind DIE HAT-Daten von 12 Schweinen 1 Tag vor (-1) und 3 Tage nach der Behandlung mit anästhesie29 nur (Schein) oder Anästhesie und Explosionsexposition mit einer Stoßwelle Rohr29 bis zu einem Spitzen-PSI von 47,4 x 13,6 SD für eine Länge von 4,7 x 0,9 ms SD (Blast). Die Daten wurden durch eingeschränkte Wahrscheinlichkeit ANOVA mit dem gemischten ModellVerfahren in einem statistischen Softwareprogramm analysiert. Diese Analyse ermittelte Unterschiede zwischen Behandlung, Zeit und ihren Wechselwirkungen. Das maximale SEM aus dem Modell wird gemeldet, und P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die KI umfasst alle Verhaltensweisen (Abbildung 3). An den Tagen 1 und 2 nach der Behandlung unterscheidet die AI-Maßnahme mTBI-Schweine von Scheinschweinen (P < 0,05; Abbildung 4). Verhaltensweisen können in ihren sich gegenseitig ausschließenden Kategorien analysiert und dargestellt werden (Abbildung 5). Die nahrädige Räumliche Verhaltensmessung unterscheidet Sprengschweine von Scheinschweinen an den Tagen 1 und 2 nach der Behandlung (P < 0.05; Abbildung 5A). Ebenso unterschieden Nasenrichtungs-, Ruhezeit- und NNOB-Messungen Scheinschweine an den Tagen 1 und 2 nach der Behandlung von Sprengschweinen (Abbildung 5B und 5C).

Figure 1
Abbildung 1: Räumliche Verhaltenskategorie von drei verschiedenen Laborgehäusetypen. Das Ethogramm wird in Bezug auf den menschlichen (Fußabdrücke) und in Bezug auf die Schweinegröße auf die Menge des freien Raumes eingerichtet. Die größte Annäherung für diese Kategorie von Verhaltensweisen ist, wenn das Schwein versucht, auf das Panel zu klettern, das dem Menschen am nächsten ist (Cl; am nächsten oder klettern). Ein ausgebildeter Beobachter stempelt "nah" (Co; 0-61 cm vom Menschen), "mitte" (M; 61-122 cm vom Menschen) und "weit" (F; 123+ cm vom Menschen), wenn sich die Ohren des Schweins oder mehr in diesen räumlichen Bereichen befinden. Jeder Laborpen wurde mit einer oder zwei Schalen für zweimal täglich fütterung, Wasserer (W) und ein Spielzeug eingerichtet. (A) Jedes 50 kg schwere Wildschwein war in 190 cm x 114 cm Stiften mit geriebenem Boden untergebracht. (B) Jedes 50 kg schwere Wildschwein war auf einer schwarzen Matte mit geriebenem Bodenbelag und einem Abfluss in der Rückseite des Stiftes untergebracht. (C) Wildschweine von ca. 10 kg wurden in 274 x 366 cm Stiften mit Betonböden, einer Matte, einem Abfluss und festen Schalen und Spielzeug enden. Die Farbstreifen (z.B. Grün und Blau) stellen die Markierungsstrategie dar. Alle Schweine im Diagramm sind als Beispiele für das Markieren und Identifizieren von Schweinen auf Videos mit grünen oder blauen Flecken gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Strukturbezogene Verhaltenskategorien, die in allen drei Laboratorien und Experimenten eingesetzt werden. (A) Für die Kopforientierungskategorie war das Schwein entweder dem menschlichen oder dem beweglichen Objekt zugewandt oder weg. (B) Für die Kategorie der Körperorientierung war der Kopf des Schweins entweder unten und führte nichtnitive soralische Verhaltensweisen (NNOB) durch; in aufrechter Position, stehend oder gehend, aber der Kopf bewegt sich nicht oder nach unten; in einem Ruhezustand, zu dem auch das Sitzen oder Liegen gehört. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ansatzindexformel und Diagramm. Der Ansatzindex wurde entwickelt, um alle Verhaltenskombinationen auf einer Skala von 0 bis 100 zu platzieren, wobei 0 das Schwein im geringsten Annäherungszustand (im fernen Abschnitt, Nase weggedreht, mit dem Kopf still liegend) und 100 im engen Abschnitt , Nase zeigt auf den Menschen, Durchführung NNOB. Ein Softwareprogramm (weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien) wurde verwendet, um die Verhaltensweisen so zu messen, dass sie linear ausgerichtet sind. Jede Schweinestruktur stellt einen Datenpunkt dar, der linear aus jeder Kategorie ausgerichtet wird. Innerhalb jeder Kategorie werden die Verhaltensdauern zuerst in Prozente konvertiert (die Dauer der Verhaltensweisen dividiert durch die Gesamtdauer der Testsitzung). Anschließend wird jedes Verhalten basierend auf der Ebene des Ansatzes gewichtet. Vermeidungsverhalten (der Prozentsatz der Zeit im fernen Bereich, ruhend, mit der Nase weggedreht) werden mit 0 multipliziert. Mäßige Ansatzverhalten (der Prozentsatz der Zeit im mittleren Bereich, in Richtung des Menschen gedreht, und stehend mit dem Kopf still) werden mit 1 multipliziert. Die größte Ebene des Ansatzverhaltens (der Prozentsatz der Zeit in den nahen und nächsten Bereichen, NNOB durchführen) wird mit 2 multipliziert. Anschließend wird jede Kategorie weiter mit 3, 2 und 1 für Raum, Nasenausrichtung und Aktivität gewichtet. Eine Konstante (0,10) wird angewendet, um die Daten über den gesamten Bereich von 0 bis 100 Prozent zu skalieren. Ein hitzekartenähnliches Farbschema wird verwendet, um das Schwein im am meisten anfahrenden Zustand im Vergleich zum Schwein im geringsten Annäherungszustand (schwarz) darzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Ansatzindex der Schweine, die mit Explosionswellenexposition behandelt werden. Diese Abbildung zeigt den Ansatzindex der Schweine 1 Tag vor (-1) und 3 Tage nach der Behandlung entweder nur mit Anästhesie (Schein, n = 6) oder Anästhesie und Explosionswellenexposition bei einer Spitzen-PSI von 47,4 x 13,6 SD für eine Länge von 4,7 x 0,9 ms SD. Die Fehlerbalken stellen SEM dar. Die P-Werte für die Behandlung = 0,032, für die Zeit = 0,033 und für die Behandlung x Zeit = 0,012. Die Daten wurden durch eingeschränkte Wahrscheinlichkeit ANOVA mit dem gemischten ModellVerfahren in einem statistischen Softwareprogramm analysiert. Diese Analyse ermittelte Unterschiede zwischen Behandlung, Zeit und ihren Wechselwirkungen. Das maximale SEM aus dem Modell wird gemeldet, und *P < 0,05 wird als signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Gestapelte Balkenmethode zum Anzeigen von Verhaltensweisen. Diese Panels zeigen eine Stack-Bar-Methode zur Darstellung von Verhaltensweisen für (A) das räumliche Verhalten, (B) die Nasenrichtung und (C) die Aktivität von Schweinen 1 Tag vor (-1) und 3 Tage, nachdem sie entweder mit Anästhesie behandelt wurden (Schein, n = 6) oder Anästhesie plus Explosionswellen-Exposition bei einem Spitzen-PSI von 47,4 x 13,6 SD für eine Länge von 4,7 x 0,9 ms SD. Für dieses Experiment wurde Gehäuse Typ B verwendet. Alle sich gegenseitig ausschließenden Verhaltensweisen können in jedem gestapelten Balkendiagramm dargestellt werden. (A) Die Behandlung x Zeit P-Werte für räumliche Verhaltensweisen sind weit = 0,060, Mitte = 0,110, *close = 0,014, am nächsten = 0,557; (B) die Behandlung x Zeit P-Werte für die Nasenrichtung sind < 0,001*; (C) die Behandlung x Zeit P-Werte für die Aktivität sind > 0,10; die Behandlung P-Werte waren Rest = *0,046, Stand = 0,584 und *NNOB = 0,042. Die gepoolten SEMs waren (A) 7,5 %, (B) 9,6 % und (C) 9,7 %. Jedes Verhaltensergebnis wurde durch eingeschränkte Wahrscheinlichkeit aNOVA mit dem gemischten Modellverfahren in einem statistischen Softwareprogramm analysiert (siehe Tabelle der Materialien für das spezifische Programm) und wurden dann in einem Diagramm kombiniert. Die Analysen ermittelten die Unterschiede zwischen Behandlung, Zeit und ihren Wechselwirkungen. Das maximale SEM aus dem Modell wird gemeldet, und *P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ANOVA-Statistiken für alle Gehäusetypen Beschreibende Statistiken für alle gesunden Schweinedaten Nein. experimentelle Einheiten
Wohnungstyp P- Nein. Quantile, % um die % von der Steuerung1 zu erkennen
pro B c Sem Werte Obs. Μ Sd LEBENSLAUF% Sem min 25 50 75 Max 25 50 75 100 200
Approach-Index, % 75,4 69,2 76,6 5,5 0,318 288 74 17 23 1 0 70 80 84 99 18 4 3 3 3
Laufzeit des Stiftstandorts, %
weit 8,5a 5.3a 23,0b 4.8 0,008 288 10 20 200,1 1.2 0 0 0 10 100 -- 336 149 84 21
Mitte 18,9 46 13.75 Uhr 16,2 0,066 288 23 29 125 1.7 0 2 10 32 100 526 131 58 33 8
schließen 72,4a 43,9b 62,4a 12,8 0,032 288 23 29 123,9 1.7 0 47 78 93 100 509 127 57 32 8
Nächstgelegene (Klettern) 0 8,9 0 3.1 0,001 288 67 32 47,8 1.9 0 46 80 95 100 74 19 8 5 3
Schließen + Nächstgelegene 72,5 53 62,3 14,9 0,311 288 68 32 46,6 1.9 0 46 78 93 100 74 19 8 5 3
Aktivitätsdauer, %
Lie/Sit mit Kopf still 5.6a 0,0b 17,0c 1.8 0,001 288 1.3 5 393,7 0,3 0 1 3 7 59 -- -- 579 326 82
Stand/Walk mit Kopf still 48,3a 63,6a,b 83,5b 10 0,006 288 52 43 82,1 2,5 1 7 47 100 100 226 57 25 14 4
NNOB 81,5 57,7 71,1 13,3 0,109 288 77 28 36,4 1.7 0 66 91 98 100 44 11 5 3 3
Kopfrichtung, Dauer, %
weg 24,7a 17,4a 50,7b 4,5 0,001 288 26 21 79,3 1.2 0 10 22 39 92 212 53 24 13 3
zu 75,3 a 82,6 a 49,3 b 4,5 0,001 288 74 21 27,8 1.2 8 62 79 90 100 26 6 3 3 3

Tabelle 1: Für alle Gehäusetypen wurden GRUNDLEGENDE HAT-Messungen untersucht, um diesen Datensatz zu erstellen. Die Verhaltensergebnisse wurden durch aNOVA mit eingeschränkter Wahrscheinlichkeit mit dem MIXED-Verfahren einer statistischen Analysesoftware analysiert. Diese Analysen ermittelten die Unterschiede zwischen der Verhaltensdauer und dem Ansatzindex der einzelnen Laborgehäusetypen. Das maximale SEM aus dem Modell wird gemeldet, und P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Darüber hinaus wurde das UNIVARIATE-Verfahren der Software für die statistische Analyse für beschreibende Statistiken verwendet. Der Konfidenzwert (CV) % wurde dann in einen experimentellen Einheitenrechner27 eingegeben und die Bedingungen für die erwarteten Unterschiede zwischen zwei Behandlungen untersucht.

behandlung P-Werte
vertraut ungewohnt Sem Trt zeit TRT*Zeit
Approach-Index, % 84,8 84,4 3,06 0,766 0,002 0,661
Laufzeit des Stiftstandorts, %
weit 10,7 10,1 3,49 0,844 0,008 0,522
Mitte 18,7 17,6 3,38 0,717 0,014 0,918
schließen 70,4 72,3 5.25 0,617 <0,001 0,895
Aktivitätsdauer, %
Lie or sit, Kein NNOB 5,8 5,8 0,8 0,995 <0,001 0,901
Stehen oder gehen, kein NNOB 5,5 5,5 1.4 0,995 <0,001 0,524
NNOB 82,1 83,3 4.12 0,722 0,0029 0,617
Kopfrichtung, Dauer, %
weg 23,9 23 2,81 0,725 <0,001 0,329
zu 76,1 77 2,8 0,725 <0,001 0,329

Tabelle 2: An sieben Schweinen aus der Unterkunft Typ A wurde ein Experiment durchgeführt. Jeden Tag wurden zwei Sitzungen durchgeführt. Für jede Sitzung wurde ein vertrauter (weiblicher) oder einer von sieben (drei Männchen und vier Weibchen) unbekannten Menschen in HATs verwendet. Die gleiche vertraute Person ging zuerst, und sieben unbekannte Personen wurden benutzt. Ein ANOVA-Modell für statistische Analysesoftware wurde auf Behandlung (vertraut oder unbekannt), Zeit (Tag) und deren Wechselwirkungen untersucht.

Ergänzendes Video 1: Observer-Software-Setup mit Untertiteln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Datenexport mit Untertiteln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 3: Datenanalyse mit Untertiteln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Beispieldatenerfassungsblatt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Leichte Verletzungen des Gehirns, die nicht zu übertüben anatomischen und strukturellen Veränderungen führen, die mit modernster Bildgebung nachweisbar sind, können schwierig zu identifizieren und zu behandeln sein28. Patienten mit mTBI sind jedoch besonders anfällig für zusätzliche Beleidigungen, die erhebliche Schäden am Gehirn verursachen können, und daher ist es wichtig, dass diese Population identifiziert wird. Verhaltenstests, die in einem Mini-Schweinemodell von mTBI entwickelt wurden, sind besonders für menschliche mTBI-Patienten relevant, da Schweine eine ähnliche Physiologie wie Menschen haben und ähnliche affektive Zustände wie Anhedonia8,9,10 ,20. Hier haben wir einen nichtinvasiven In-Pen-Verhaltenstest (den HAT) entwickelt und gezeigt, dass er empfindlich genug ist, um mTBI-Schweine von Scheinschweinen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurde ein gewichteter Index (die KI) für Während des HAT beobachtete Verhaltensweisen entwickelt, die in allen Gehäuse- und Schweinetypen allgegenwärtig sind.

Änderungen und Fehlerbehebung:

Die Methoden für den HAT wurden auf der Grundlage der ethologischen Leitlinien25 und mehrerer Trial-and-Error-Strategien zur Verbesserung der Zuverlässigkeit, Wiederholbarkeit und Gültigkeit des Tests6festgelegt. Zuverlässigkeitsmaßnahmen halfen dabei, die Stärken und Grenzen des Tests zu identifizieren. Zuverlässigkeit definiert das Ausmaß, in dem die Messung wiederholbar und konsistent und frei von zufälligen Fehlern ist28,29. Wir haben bereits über die Intra- und Interobserver-Zuverlässigkeit des HAT berichtet, und mit den zusätzlichen strukturellen Thogrammen sind die Verbindlichkeiten für Dauer6ähnlich hoch (Pearsons R2 > 0,90). Frequenz- und Latenzmaßnahmen erfordern geschulte Beobachter, während Die Dauermaßnahmen weniger beobachterabhängig und daher in den Laboratorien zuverlässiger sind30.

Die Zuverlässigkeit innerhalb eines Labors und die Wiederholbarkeit in Laboratorien hängen von Methoden ab. In unserem Labor, das Videosystem kontinuierlich aufgezeichnet, die Dateien wurden zunächst als 5-Minuten-Dateien gespeichert, und einige HAT-Sitzungen traten über zwei Dateien. Weniger Fehler wurden gemacht, wenn die genaue Zeit aus dem Datenblatt verwendet wurde, um die Videos zu beschneiden und zu kombinieren. Vor der Entwicklung des Ethogramms durften Beobachter das Videomaterial anhalten, anhalten und zurückspulen, um alle Verhaltensweisen im gesamten Ethogramm zeitgemäß zu machen. Diese Methode verursachte nicht nur Variationen in der Zeitstempelung jeder Probe, die von 3 min bis 20 min reichte, sondern die Zuverlässigkeit zwischen und innerhalb des Beobachters war auch für die meisten Verhaltensweisen schlecht. Daher haben wir die Wiedergabegeschwindigkeit eingestellt und beobachter hatten Zeitstempel jeder Kategorie zu einem Zeitpunkt. Wenn die Zuverlässigkeit in nur einer Kategorie gering war, haben Beobachter daher unabhängig voneinander nur die Kategorie und nicht das gesamte Ethogramm neu eingeprägt, nachdem sie die Definitionen und das Filmmaterial zusammen konsultiert hatten. Die Set-Wiedergabe- und Kategoriemethoden ermöglichten eine konsistente Vorhersage, wie viel Zeit benötigt wurde, um die einzelnen Stichproben zeitstempeln zu können. Bei Projekten, die länger als einen Monat dauern, ist die routinemäßige Überprüfung der codierten Videos und die Zuverlässigkeit innerhalb des Beobachters wichtig zu messen.

Ein weiterer Faktor, der die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit reduziert, ist die Videoeinrichtung. Zunächst wurden eine Handkamera und ein Stativ verwendet, die von Stift zu Stift verschoben wurden. Bei der Verwendung dieser Methode mussten die Schweine vor dem HAT in das Stativ und die Kamera eingeführt werden; Andernfalls schienen die Schweine mehr auf das Stativ und die Bewegung als auf den Testmenschen zu reagieren. Darüber hinaus beschränkten Nicht-Overhead-Kamerawinkel die Sicht des Betrachters während der Zeitstempelung und die Tiefenwahrnehmung des Raumes erhöhte die Innerhalb- und Zwischen-Beobachter-Variation in den räumlichen Verhaltensmaßnahmen; Deshalb haben wir das Protokoll mit festen Kameras entwickelt. Wenn diese Methode verwendet wird, ist zusätzliche Sorgfalt erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kamera vor jedem Test korrekt platziert wird, und es wird mehr Zeit für die Einrichtung zwischen den einzelnen Schweinesitzungen benötigt. Wir erfuhren jedoch, dass das kontinuierliche Video-Overhead-System seine Erstaufnahme um Mitternacht mindestens 24 H vor dem ersten HAT starten musste. Die Zeitstempelanzeige für viele Videosysteme ist nicht genau und wird bis zum Frame synchronisiert. Daher verlassen wir uns nicht mehr auf die Anzeigezeiten. Die Mitternachtsstarts sind für die exakte Frame-Capturing und Videobearbeitung zulässig, und die Zeitstempelanzeige wurde nicht verwendet.

Darüber hinaus war die Akklimatisierung der Schweine und das Einrichten einer Routine bei der Fehlerbehebung dieses Tests wichtig. In Aufnahmen von Schweinen, die nicht gut an ihre Umgebung akklimatisiert waren, wurde während des HAT Tempo beobachtet. Dies ist ein Indikator dafür, dass sich das Schwein in einem aufgeregten Zustand31 und nicht in einem Sondierungszustandbefindet 32. Akklimatisierungszeiträume von drei oder mehr Wochen können die Anzahl der Schweine, die in einem Experiment Tempo. Wenn jedoch das Tempo während aller Probenahmeperioden anhält, muss dieses Ethogramm möglicherweise angepasst werden, um Spaziergänge und Stillstand einzuschließen.

Gültigkeit ist der Umfang, in dem eine Messung den beabsichtigten Umfang der gestellten Frage darstellt25. Bei der ersten Entwicklung des HAT haben wir nur ein räumliches Ethogramm verwendet. Definitionen des räumlichen Ethogrammverhaltens beschreiben genau und spezifisch die Nähe zu den menschlichen Subjekten und sie sagen dem Betrachter direkt, wie viel Raum das Schwein zwischen sich und einem Menschen hinterlässt. Sobald diese Methoden jedoch auf eine neue Laboreinrichtung angewendet werden müssen, erkannten wir, dass räumliche Ethogramme laborspezifisch sind. Stiftbemaßungen und die Platzierung anderer Objekte beeinflussen das Ergebnis des räumlichen Ethogramms; Daher muss ein Diagramm mit Messungen und Besonderheiten des Stifts veröffentlicht werden, wenn die Stifteinrichtung nicht zuvor gemeldet wurde. Zusätzlich zur Berichterstattung über die Stiftumgebung wurden die strukturellen Verhaltensweisen dem Ethogramm hinzugefügt. Im Gegensatz zu räumlichen Verhaltensweisen können strukturelle Verhaltensweisen in Laboratorien leichter ausgewertet werden; Diese Verhaltensweisen haben Gültigkeit, weil sie speziell den aktiven Zustand des Schweins beschreiben. Wenn ein Schwein ruht, ist es wahrscheinlich nicht motiviert, sich zu nähern und ist nicht in der Lage, Positionen zu ändern, um so schnell wie ein stehendes Schwein zu nähern. In ähnlicher Weise befindet sich ein Schwein mit NNOB in einem explorativen Zustand, aber ein Schwein mit dem Kopf noch im Stehen ist wahrscheinlicher in einem katatonischen Zustand. Die Nasenausrichtung hilft mit Gültigkeit, weil die Nase, Ohren, und dann Augen sind, was das Schwein verwendet, um Informationen über den Menschen zu sammeln.

Einschränkungen der Technik:

Ein potenzielles Problem bei dieser Technik ist die Variabilität der Reaktionen der Schweine auf den Testmenschen. Darüber hinaus werden Schweine auf die Hände des Testmenschen schauen, was zu unbeabsichtigten Hinweisen durch diese Person führen kann. Daher wurden diese Einschränkungen durch die experimentelleN Prüfung von 1) den Reaktionen der Schweine auf einen vertrauten Menschen und unbekannten Menschen ausgedrückt, und 2) standardisiert, dass, nachdem das Pellet fallen gelassen wurde, der Testmensch stillsteht und seine Hände aus dem Schweinssicht. Die Daten zeigten, dass es während des HAT (Tabelle 2) keine Behandlung oder Behandlung x Zeitunterschiede gab, was darauf hindeutet, dass der HAT entweder von vertrauten oder unbekannten Menschen verabreicht werden könnte. Andere Forscher deuten darauf hin, dass Schweine dazu neigen, über den Menschen basierend auf früheren Wechselwirkungen zu verallgemeinern11,12,13; Daher müssen die bisherigen Erfahrungen eines Schweins mit Menschen positiv sein. Diese Herausforderung kann auch mit einem wachsamen experimentellen Design behoben werden; für jeden Block ist eine ausreichende Anzahl von Versuchseinheiten erforderlich, die für jede Behandlung von Interesse vertreten sind.

In dieser Studie gab es zwar nur zwei erfahrene Beobachter, die alle Videos für alle drei Gehäusetypen zeitstempelten, es gab jedoch Unterschiede zwischen den Gehäusetypen für spezifische Verhaltensergebnisse (Tabelle 1). So gelangten beispielsweise Schweine im Wohntyp B häufiger in den nächstgelegenen Bereich als Schweine der Wohntypen A und C. Dies ist wahrscheinlich auf einen Unterschied im Stiftmaterial zurückzuführen; im Gehäuse Typ B war die Vorderseite des Stiftes ein kettengebundenes Tor mit horizontalen Balken, das es dem Schwein ermöglichte, das Tor während des HAT zu erklimmen. Die Wohntypen A und C hingegen hatten vertikale Balken und weniger horizontale Flächen, auf die die Schweine klettern mussten. Diese Variabilität kann behoben werden, indem die Dauer der Ausgaben in den nahen und nächsten Bereichen addiert wird, bevor sie zwischen den Wohnungstypen verglichen werden (Tabelle1; P > 0,10). Schweine im Wohnungsbautyp C verbrachten jedoch mehr Zeit in der Ferne als schweinearten A und B (Tabelle1; P < 0.05), was wahrscheinlich auf die Platzierung von Wasserern in der Rückseite des Stifts und nicht an der Vorderseite des Stifts zurückzuführen war. Dies ist eine Einschränkung, die behoben werden kann, wenn Laboratorien sich entscheiden, die Platzierung von Wasserlern, Schalen und Spielzeug zu standardisieren und sicherzustellen, dass sie fixiert sind, damit das Schwein das Objekt nicht in einen anderen Bereich bewegt.

Dieser Test bietet eine hervorragende Zugänglichkeit für Laboratorien aller Art, aber, wie bereits erwähnt, werden das manuell gestempelte räumliche Ethogramm und die Messungen von Labor zu Laboratorien mehr variieren. Dennoch sind die körper- und kopfstrukturellen Ethogramme allgegenwärtig. Laboratorien, die Zugang zu validierten, automatisierten Tracking für Schweine haben, können davon profitieren, dass das räumliche Ethogramm automatisch und nicht manuell nachverfolgt wird, da die zurückgelegte Entfernung und die Bewegungsgeschwindigkeit zusätzliche Ergebnisse von Verhaltensmaßnahmen von die HAT. Die Einschränkungen durch die Einrichtung von In-Pen- und traditionellen Technologien anstelle von Testbereichen und automatischen Tracking-Technologien können durch die Anpassung der KI-Formel behoben werden. Die KI bietet standardisierte Messungen und Terminologie, wie einzelne Schweine ihren Gehegeraum nutzen und Interesse an einem Menschen zum Ausdruck bringen. Diese Berechnung, abgeleitet aus allgemeinen Verhaltensmessungen, ist empfindlich gegenüber Schweinemodellen von subkonkussivem mTBI und möglicherweise anderen Zuständen subklinischer Verletzungen oder Krankheiten. Darüber hinaus reduziert die KI zufällige Variationen während der Experimente und kann leichter in Experimenten und Laboratorien verglichen werden als Methoden, die auf experimentierfreudigere Messungen angewiesen sind. Die strukturellen Verhaltensweisen lieferten die Grundlage für diese Formel, da es sich bei diesen Verhaltensweisen um Standardmessungen zwischen Behandlungen handelt, während das räumliche Verhalten von der Stifteinrichtung, der Anzahl der Schweine in einem Stift und dem Tracking-System abhängt. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass, wenn zwei gesunde Schweine in einem Stift getestet werden, sie ähnliche räumliche Verhaltensweisen ausführen, indem sie sich zusammen nähern, aber das Schwein, das dem ersten folgt, kann seine Nase mehr an seinem Federpaar als an seinem menschlichen orientieren und mehr NNOB ausdrücken. , weil das Schwein, das führt, als Wächter dient. Nichtsdestotrotz hilft die KI, diese Variation auch von gepaarten Verhaltensweisen zu reduzieren.

Obwohl die KI ein ausgezeichnetes Toolset für die Standardisierung des Tests in Laboratorien ist, möchten Forscher möglicherweise dennoch testspezifische Verhaltensergebnisse innerhalb eines Labors oder Experiments untersuchen, insbesondere wenn sie über genügend Leistung verfügen (d. h. experimentelle Einheiten und wiederholte Tests) in einem einzigen Experiment. Daher wurde hier Tabelle 1mit allen Verhaltensergebnissen, der Varianz, der Verteilung und einem berechneten Test für die Anzahl der Tiere für jedes spezifische Verhalten enthalten. Wenn Forscher beispielsweise Stiftumgebungen haben, die es Schweinen ermöglichen, während des HAT konsequent zu klettern, und sie wissen, dass ihre Behandlung über einen Unterschied von 75 % im Kletterverhalten verursacht, dann können sie Tierzahlen basierend auf der gemessenen Varianz rechtfertigen. Wenn dem Ethogramm neue Verhaltensweisen hinzugefügt werden, müssen Wissenschaftler begründen, welche Verhaltensweisen auf Ansatz oder Rückzug hindeuten, bevor sie in den Index aufgenommen werden. Wenn z. B. die meisten Tiere innerhalb eines Versuchstempos entlang der Wände des Pens (d. h. thigmotaxis)32, könnte die Dauer dieses Verhaltens in die körperstrukturelle Ethogrammkategorie integriert werden. Das Verhalten kann im detaillierten gestapelten Balkendiagramm (d. h. Abbildung 5) oder in der Tabellarische Form dargestellt werden, und dann kann es mit Stand-Still zusammengefasst werden, bevor die Indexberechnung angewendet wird. Die KI kann daher Verhaltensweisen darstellen, die in Laboratorien allgegenwärtig sind, aber zusätzliche einzigartige Verhaltensweisen können weiterhin separat dargestellt werden.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

Die bestehenden Methoden für den HAT wurden für Schweine in kommerziellen Betrieben zur Bewertung des Tierschutzes eingeführt. Hier wurde ein Protokoll für Laborschweine erstellt, das Forschern helfen kann, den Tierschutz zu bewerten und mTBI-Schweine von scheinbehandelten Schweinen zu unterscheiden. Ein alternativer traditioneller Test könnte die Verwendung eines Open-Field-Tests sein. Dieser Test wurde zuvor verwendet, um Schweineemotionalität und Wohlbefinden zu bewerten33. Freifeldtests wurden ursprünglich entwickelt, um die affektiven Zustände von Nagetieren zu testen, indem sie ihre natürliche Abneigung gegen freiwerdenden Raum und Licht messen. Im Gegensatz dazu können gesunde Schweine die gleichen Reize wie appetitive10sehen, und nach einer Krankheit, Verletzung oder Stressbehandlung drücken sie wahrscheinlich Angst aus. Dieser Test erfordert mehr Laborfläche und erfordert, dass sich Schweine akklimatisieren, um behandelt und in eine Offene-Feld-Arena gebracht zu werden. Wenn Laboratorien über Platz verfügen und Protokolle für den Umgang mit den Schweinen vorhanden sind, können wiederholte HAT-Sitzungen zusätzlich zu einem Großfeldtest dazu beitragen, behandelte Tiere weiter von scheinbehandelten Tieren zu unterscheiden.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:

Die ersten drei Schritte im Protokoll sind die wichtigsten für erfolgreiche HAT-Maßnahmen. Die Sitzungen pro Schwein dauern nur 3 min; Eine angemessene Vorbereitung wird jedoch dazu beitragen, diesen Test zuverlässig zu machen. Wie oben erwähnt, ist der Kamerastandort und die Aufnahmeeinrichtung entscheidend für Klarheit und Replikation. Unsachgemäße Kamerawinkel können die Sicht des Betrachters einschränken, wodurch fehlerbehaftete Messungen auftreten. Ein weiterer oft übersehener Schritt ist das Fixieren der Objekte im Stift. Das Schwein bewegt unfixierte Objekte, und dies kann seine Motivation beeinflussen, sich dem Menschen zu nähern. Das Einrichtungs- und Verwaltungssystem ist wichtig, da Schweine an ihre Umgebung angekklimatisiert werden müssen, bevor sie den Test konsistent durchführen können. Schweine, die nicht gut an ihre Hausstifte oder Routinen gebunden sind oder Stress haben, werden sich in anderen Bereichen und nicht auf der Rückseite des Stifts34vermehren. Der Defäkationsbereich kann sich auf ihre Motivation auswirken, sich anzunähern. Aus der Kamerasicht sollte der Beobachter in der Lage sein, einzelne Schweine zu identifizieren; es ist jedoch wichtig, dass das Kennzeichnungssystem keine Informationen über die Behandlung des Tieres liefert, da dies den Beobachter25verzerrt.

Die Identifizierung von Schweinen ist sehr wichtig, um die richtigen Verhaltensdaten für das richtige Schwein zu erhalten, auch wenn sie eingeschossig sind. Schweine werden oft für ihre Behandlungen bewegt, und eine Markierung versichert dem Betrachter, dass sie das gleiche Schwein beobachten, nachdem es entfernt und wieder in seinen Stift gelegt wurde. Schweine können paarweise untergebracht werden, wie in Derenkleben Typ C, und daher wird es sehr wichtig, die Schweine zu identifizieren. Viehmarkierungfarben und Markierungen erfordern tägliche Anwendung; Daher erfordert dieses Protokoll die Verwendung eines medizinischen Klebebandes und eines Abstrichs von TagZement. Das Band klebt am besten an Schweinen mit längeren Haaren. Schweine mit kurzen Haaren und trockener Haut werden das Band häufiger abschleppen als Schweine mit längeren Haaren.

Zukünftige Anwendungen:

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene nichtinvasive IN-Pen-HAT-Test empfindlich genug ist, um leichte und zeitlich abhängige Veränderungen bei Schweinen nach mTBI zu erkennen. Darüber hinaus haben wir einen gewichteten Index namens KI entwickelt, um Veränderungen bei Schweinen, die in verschiedenen Stalltypen sowie in verschiedenen Schweinearten untergebracht sind, zu bewerten. Obwohl der HAT verwendet wurde, um Veränderungen bei Schweinen zu erkennen, die mTBI ausgesetzt sind, kann dieser Verhaltenstest nützlich sein, um messbare Verhaltensänderungen bei Tieren mit Stress oder präpathologischen Bedingungen zu erkennen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Finanzierung durch das Office of Naval Research (Grant #12166253) würdigen. Darüber hinaus danken die Autoren den Tierpflegern, Tierärzten und Studenten der Kansas State University und Virginia Tech für ihre Unterstützung bei der Tierarbeit. Die Autoren danken auch nadége Krebs für ihre technische Unterstützung und den Schülerinnen Shelby Stair, Sarah Greenway und Mikayla Goering für ihre technische Hilfe und zusätzliche Tierpflege.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dome 3.0 Megapixel Cameras with 2.8-12 mm lens set between 2.8-3.2 mm Points North Surveillance, Auburn, ME CDL7233S Lower mm lenses are needed for low-profile pens
Manfrotto 244 friction arm kit B&H Photo B&H # MA244; MFR # 244 To mount and secure cameras at a 90° angle
Video Recording System Points North Surveillance, Auburn, ME NVR-RACK64 NVR is customized
Colored and patterned duct tape attached to a double-sided medical grade tape  MBK Tape Solutions, Chatsworth, CA 3M 1522H Sustainable marking of pigs
Approach Index Formula generator Dinasym, Manhattan, KS Approach Formula Company will customize macros for specific lab needs
Geovision Software Points North Surveillance, Auburn, ME Geovision Software to edit video time into 180 s clips
Clicker Petco Good2Go Dog Training Clicker
Reward treat (feed pellet, carob chip, raisin, marshmallow) Variable N/A Depending on previous exposure, adult pigs are very  neophobic when new food is introduced. Limit-fed pigs can be fed a few pellets of feed. 
Statistical Analysis System (SAS) SAS Institute, Cary, North Carolina SAS 9.0 Our laboratories preference for analyzing mixed models and repeated measures
Observer 11.5 software Noldus Information Technology, Leesburg, VA Observer 11.5 Software to manually timestamp video clips

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