Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras de DNA de alimentos e ambiental microbiomes para detecção concertada e subtipos de salmonelas através do sequenciamento de quasimetagenomic. O uso combinado de enriquecimento da cultura, separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA) permite a concentração eficaz de salmonelas de DNA genômico de amostras ambientais e alimentos.
Abstract
Sequenciamento de quasi-metagenomics refere-se à análise baseada no sequenciamento de microbiomes modificada de alimentos e amostras ambientais. Neste protocolo, modificação de microbiome é projetada para concentrar o DNA genômico de um contaminante de patógeno de origem alimentar alvo para facilitar a detecção e subtipos do patógeno em um único fluxo de trabalho. Aqui, vamos explicar e demonstrar as etapas de preparação de amostra para análise de Salmonella typhi quasi-metagenômica de representante alimentos e amostras ambientais, incluindo os rebentos de alfafa, pimenta preta moída, carne à terra, peito de frango e amostras ambientais. Amostras são submetidas primeiro para o enriquecimento da cultura de Salmonella para uma duração encurtada e ajustável (4 – 24 h). Células de Salmonella são então seletivamente capturadas da cultura enriquecimento por Fima separação (IMS). Finalmente, vários deslocamento amplificação (MDA) é executada para amplificar o DNA das células IMS-capturado. A saída de DNA do presente protocolo pode ser sequenciada por plataformas de sequenciamento de alto rendimento. Uma análise PCR quantitativa opcional pode ser realizada para substituir o sequenciamento para a deteção de Salmonella ou avaliar a concentração de salmonela DNA antes de sequenciamento.
Introduction
Metagenômica sequenciamento teoricamente permite a deteção concertada e subtipos de agentes patogénicos de origem alimentar. No entanto, amostras de alimentos apresentam desafios para a análise de patógeno por sequenciamento direto de microbiome a comida. Primeiro, agentes patogénicos de origem alimentar estão frequentemente presentes em níveis baixos em amostras de alimentos. A maioria dos métodos de detecção rápida disponível comercialmente ainda exige 8 – 48 h cultivo para enriquecer as células do patógeno a um nível detectável1. Em segundo lugar, muitos alimentos contêm células microflora abundante e/ou comida DNA, fazendo o DNA de patógeno de origem alimentar uma pequena fração de metagenome de comida e um alvo evasivo para deteção e subtipos directo por sequenciamento de metagenomic.
Modificação de microbiomes de alimentos tem sido relatada para permitir uma concentração substancial de patógeno de origem alimentar DNA para facilitar a detecção baseada em sequenciamento de Shiga toxina-produzindo Escherichia coli2,3 e Salmonella typhi4. Porque os alimentos modificados microbiomes ainda são misturas de diferentes espécies microbianas, seu sequenciamento é denominado como análise de quasi-metagenomic4. Microbiome modificação pode ser executada por cultura enriquecimento sozinho2,3 , ou em combinação com separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA)4,5. IMS seletivamente pode capturar células do patógeno de cultura de enriquecimento através de grânulos magnéticos revestido de anticorpo. MDA pode gerar quantidades suficientes de DNA genômico para sequenciamento através de de DNA polimerase o altamente eficiente ɸ296. IMS-MDA permitiu a deteção do agente patogénico independente de cultura de amostras clínicas7e encurtamento do enriquecimento da cultura para a deteção de quasi-metagenomic e subtipos de salmonelas em alimentos amostras4.
O objetivo geral deste método é preparar DNA quasi-metagenomic de amostras de alimentos para permitir a concentração alvo de DNA genômico de Salmonella e detecção subsequente e subtipos do contaminante Salmonella por sequenciamento. Em comparação com métodos padrão para a deteção de Salmonella 8,9 e10de subtipos, a abordagem quasimetagenomic substancialmente pode encurtar o tempo de retorno de alimentos contaminados e amostras ambientais para subtipos moleculares do patógeno Unificando os dois normalmente separaram análises em um único fluxo de trabalho. Este método é particularmente útil para aplicações como reação a epidemias transmitidas por alimentos e outras investigações de volta de rastreamento onde patógeno robusto subtipos é necessário além de deteção de patógenos e rápida reversão analítica é importante.
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Protocol
1. preparação da amostra
Nota: Amostras de alimentos preparadas para pré-enriquecimento de acordo com o guia de laboratório de microbiologia (MLG) do Estados Unidos Departamento de agricultura da segurança alimentar e Inspection Service (USDA-FSIS)11 e bacteriológica manual analítico (BAM) do alimento de Estados Unidos e Drug Administration (FDA)12.
- Assepticamente, coloque uma porção de 25 g de amostra de alimentos como pimenta preta, peito de frango, carne moída e brotos de alfafa ou um cotonete ambiental em um saco de liquidificador de laboratório estéril com um filtro incorporado. Prepare um cotonete ambiental assepticamente umedecendo uma esponja com caldo de enriquecimento (Rappaport-Vassiliadis, RV). Em seguida, arraste o swab sobre toda a superfície ou área pré-determinada e colocá-lo em um saco de liquidificador de laboratório.
Figura 1: representante alimentos e amostras ambientais para detecção de quasi-metagenômica e subtipos de salmonelas. As amostras são colocadas em sacos de filtro estéril stomacher juntamente com caldo de RV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Misturar cuidadosamente cada 25 g amostra com 225 mL de enriquecimento RV caldo usando uma massagem de liquidificador ou mão de laboratório por 30 s.
Nota: Variantes de caldo de RV, tal como recomendado pelo MLG e BAM podem ser utilizadas dependendo tipos de amostra. - Incube a mistura amostra-enriquecimento caldo em uma incubadora de laboratório a 42 ° C para 4 – 24 h.
- Após a incubação, colete uma subamostra de 50 mL de caldo de enriquecimento do lado filtrado do saco em um tubo de centrífuga de 50ml separado.
- Centrifugar o tubo a 100 x g durante 10 minutos remover os resíduos sólidos no homogeneizado.
- Recupere o sobrenadante cuidadosamente para um novo 50ml centrifugar o tubo e centrifugar os tubos em 3.000-6.000 x g durante 10 minutos recuperar centrifugado.
- (Opcional) Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento por re-suspensão em 5 mL de água peptona tamponada (BPW) e centrifugar os tubos a 3.000-6.000 × g por 10 min.
Nota: BPW pode preparado pela dissolução de 10 g de peptona, 5 g de cloreto de sódio, 3,5 g de dissódico fosfato, e 1,5 g de Fosfato monopotássico em 1 L de água destilada. O pH final deve ser ajustado para 7,2 ± 0,2 a 25 ° C. Autoclave a 121 ° c durante 15 min. BPW comercialmente disponível também pode ser usado. - Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de água peptonada tamponada.
2. Fima separação (IMS) e vários deslocamento Amplification (MDA)
Nota: Para evitar a contaminação cruzada entre amostras, trabalhar em uma armário de biossegurança, mudar pontas de pipeta para cada tubo, evite tocar o tubo com a pipeta e não coloque os tubos juntos em suporte magnético durante a etapa de lavagem.
- Descongele os buffers de amostra e a reação do kit de MDA no gelo ou a 4 ° C com antecedência.
- Misturar 1 mL de célula re-suspensa em BPW de pelotas com 20 μL de anti -Salmonella grânulos em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque-o sobre o misturador rotativo durante 30 min à temperatura ambiente.
Nota: Flora competitiva, partículas de gordura e proteínas em ressuspenso podem interferir com a IMS. Diluição de centrifugado re-suspenso em água peptonada tamponada é útil para reduzir a perda dos grânulo -Salmonella complexos do suporte magnético durante as etapas de lavagem. - Inserir os tubos magnético stand e permitir que 3 min para a correcta recuperação dos grânulos do rack várias vezes por inversão para concentrar as contas em uma bolinha no lado do tubo.
- Manter os tubos sobre o suporte magnético. Aspirar e desprezar o sobrenadante de cada tubo, bem como o líquido restante na tampa de cada tubo.
Nota: Tenha cuidado para não perturbar a pelota de grânulos IMS na parede lateral do tubo contra o ímã. - Retire o suporte de tubo do suporte magnético e adicionar 1 mL de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% (v/v) polissorbato 20) e inverter várias vezes para remover bactérias de ligação não específica do complexo.
- Repita as etapas de 2.3-2.5 duas vezes.
- Após a lavagem 3rd , realizar a separação magnética final de contas, repetindo as etapas 2.3 – 2.4. Retire os tubos do magnética cremalheira e colocá-los em uma microcentrífuga para 1 s para spin para baixo de grânulos. Em seguida, coloque os tubos no suporte magnético para 3 min antes de remover qualquer tampão de lavagem residual.
- Ressuspender os grânulo - complexos deSalmonella em 9 μL de tampão de amostra e incubar a 95 ° C por 3 min para desnaturação.
- Após refrigerar a 4 ° C, no gelo, combinar com 9 μL de tampão de reação mais 1 μL de enzima misturar e manter no gelo.
- Em um termociclador, incube os tubos a 30 ° C, durante 2 h para amplificação, seguida de aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos para inativar a enzima e legal a 4 ° C no gelo.
- Avalie a quantidade e a qualidade dos produtos MDA medindo-se a concentração de DNA e pureza (260/280 relação > 1.8) em um instrumento de fluorospectrometer.
Nota: Por causa da ligação não-específica dos grânulos IMS, DNA genômico de organismos que não a Salmonella é susceptível de estar presente nos produtos da MDA, mas não afeta a jusante análise. - Armazene os produtos finais (20 μL) a-20 ° C até o uso de PCR em tempo real e/ou elaboração de biblioteca para o sequenciamento de quasimetagenomics.
3. real-time PCR
Nota: Este passo é opcional para a detecção de Salmonella sem subtipos, 1) e 2) avaliar a qualidade da amostra antes da sequenciação de quasimetagenomics.
- Preparar 18 μL de mistura PCR por amostra, contendo Universal PCR Master Mix (10 μL), em frente a primeira demão (2 μL, 900 nM), reverter a primeira demão (2 μL, 900 nM), sonda (2 μL, 250 nM) e água da classe molecular (2 μL).
Nota: Salmonella-primeiras demão do oligonucleotide específica (para a frente: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, reverso: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) e sonda foram concebidos para amplificar uma sequência dentro do gene ttr (GenBank adesão n 94. AF 282268)13. - Misture o produto MDA da etapa 2.12 pipetando delicadamente acima e abaixo do grânulo -Salmonella complexos junto com líquido para criar uma suspensão. Adicione 2 µ l da suspensão em 18 μL de mistura PCR.
- Executar o PCR em tempo real, usando um protocolo otimizado de PCR em tempo real, especificar dois períodos de exploração, uma a 50 ° C por 2 min e outra a 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 60 s.
- Calcule o ciclo de limiar (Ct), que é o número de ciclos necessários para a fluorescência de DNA amplificado para cruzar a linha de limite.
Nota: A linha de limite é definida na fase linear entre a linha de base e planalto dos lotes de amplificação das amostras. Resultados negativos correspondem aos valores de Ct por 40 ou amostras com valores de Ct maiores do que a do controlo negativo.
4. Biblioteca preparação para o sequenciamento de Quasimetagenomic
Nota: Os produtos MDA podem ser sequenciados por ambos curto ler e ler muito tempo (nanopore) plataformas de sequenciamento. Use a versão mais recente dos kits de preparação de biblioteca DNA fornecidas pelos fabricantes das plataformas de sequenciamento. Execute a preparação de biblioteca de DNA de acordo com as instruções dos fabricantes. Use o protocolo de DNA genômico baixa-entrada 2D para preparação de biblioteca para o sequenciamento de leitura longa plataforma5. Para a preparação de biblioteca para a plataforma de sequenciamento de curto-leitura, pequenas modificações ao protocolo do fabricante são fornecidas abaixo.
- Segui métodos de preparação de biblioteca padrão, adicionando soluções tampão e reagentes para produtos MDA. Transferir 40 μL dos produtos MDA sequenciamento preparado para um novo prato e adicionar 20 μL de grânulos de purificação de PCR para cada poço.
- Incube a placa na temperatura de quarto por 10 min sem tremer.
- Lave os grânulos com 80% de etanol e secar as contas por 12 min.
- Re-suspender grânulos secos em 53 μL de tampão de ressuspensão e incubar por 2 min sem tremer.
- Diluir e bibliotecas, seguindo as instruções do fabricante da piscina.
Nota: Uma 22:00 em pool e desnaturada biblioteca está agora pronta a ser sequenciado.
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Representative Results
Antes de sequenciamento de quasimetagenomic, a quantidade e a pureza dos produtos IMS-MDA geral podem ser avaliadas por fluorospectrometer (tabela 1).
| Tempo de enriquecimento (h) | Valor de CT | Concentração (ng/ul) | Pureza (260/280) | |
| Marca A | 4 | 24,71 | 812.91 | 1.89 |
| 8 | 25,80 | 900.36 | 1,87 | |
| 12 | 15,41 | 753.88 | 1.84 | |
| Marca B | 4 | 20.63 | 872.61 | 1,87 |
| 8 | 22.61 | 993.41 | 1,87 | |
| 12 | 19.08 | 954.44 | 1,87 |
Tabela 1: avaliação de qualidade e quantidade de DNA de amostras para sequenciamento de quasi-metagenomic. Foram inoculadas células de Salmonella em 25 g de peito de frango cru das duas marcas no 1 CFU/g. Inoculated amostras foram enriquecidas em RV para 4, 8 e 12 h antes IMS-MDA.
Avaliação de quantidade específica de salmonelas DNA pode ser realizada por PCR em tempo real (tabela 1 e Figura 2), que também serve como uma alternativa para a deteção de Salmonella se subtipos não é necessária.
Figura 2: PCR em tempo real para avaliação de detecção ou amostra de salmonelas para sequenciamento de quasi-metagenomics. São mostradas as curvas de amplificação da PCR em tempo real de Salmonella DNA em produtos IMS-MDA após 4, 8 e 12 h de tempo de enriquecimento. Uma amostra após apenas enriquecimento de 2h também está incluída. Células de Salmonella (0,27 CFU/g) foram inoculado 25 g de peito de frango cru de duas marcas A e B. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Leituras de Fluorospectrometer permitem a avaliação inicial da preparação da amostra. Concentração de produtos IMS-MDA preparados a partir de Salmonella amostras de peito de frango contaminadas variaram de 701.54 a 945.86 ng / µ l, sugerindo que a amostra DNA tem sido amplificado. De acordo com a orientação do fabricante, a concentração mínima de amostra de DNA para o short, ler e ler muito tempo sequenciamento é 0,2 ng / µ l e 1 µ g, respectivamente. O rácio de 260/280 variou entre 1,85 e 1,88 (tabela 1), mostrando alta pureza das amostras de DNA com baixos níveis de contaminação de proteína.
Valores mais baixos de Ct indicam concentrações mais elevadas de DNA genômico de salmonelas na amostra. Como mostrado na tabela 1 e Figura 2, valores de Ct de produtos IMS-MDA diminuem como enriquecimento tempo aumenta. Em nosso anterior estudo4, quando valores de Ct foram inferiores a 25, a maioria (> 50%) da SE genoma era susceptível de ser sequenciado e previsão de serótipo do sequenciamento bruto lê foi bem sucedida.
Enriquecimento de cultura vencida ou IMS pode resultar em um relativamente altos valores de Ct, indicando baixa concentração de DNA genômico de salmonelas na amostra final, como mostrado na Figura 2. Isso pode acontecer apesar de uma alta concentração de DNA e a pureza dos produtos IMS-MDA como sugerido pelas leituras de fluorospectrometer.
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Discussion
Por causa da abundância, muitas vezes de baixa e homogênea em presença de salmonelas em alimentos e amostras ambientais, enriquecimento de cultura antes de IMS-MDA é ainda necessário para a detecção de Salmonella e subtipos; é, portanto, uma etapa crítica do protocolo. Para identificar as condições ideais para aumentar a abundância de Salmonella em relação à flora de fundo de amostra, mídia de enriquecimento diferentes pode ser avaliadas para amostras específicas. De acordo com MLG e BAM, ambos meio seletivo como caldo de RV e meio não-seletivo como caldo de água e lactose peptona tamponada podem ser usados para enriquecimento de Salmonella de amostras de alimentos. O uso de RV a 42 ° C foi avaliado em nosso estudo anterior4 para enriquecimento de Salmonella de carne de frango cru, alface e pimenta preta para apoiar a análise quasimetagenomic do patógeno. De acordo com o FDA BAM e AOAC precollaborative8,9e estudos colaborativos14,15, RV é recomendado para a análise de alimentos de alta carga microbiana microbiana e baixa.
A duração ideal do enriquecimento da cultura depende de vários fatores, como tipo de amostra, o nível de contaminação de Salmonella e o estado fisiológico do contaminante Salmonella . Por exemplo, em níveis baixos de Salmonella (por exemplo, < 1 UFC/g) células estão presentes em uma amostra de carne e sob estresse de refrigeração, mais tempo de enriquecimento (por exemplo, > 12 h) pode ser necessários para reanimar e enriquecer as células de Salmonella . Abundância suficiente de Salmonella na microbiome modificado leva a cobertura adequada de sequenciamento do genoma de contaminante de salmonela , que pode permitir que o polimorfismo de nucleotídeo único nível de tensão (SNP) digitando4. Enriquecimento de cultura mais curto (por exemplo, menos do que 12 h) é possível para detecção rápida5 ou serotipagem de Salmonella4.
Níveis mais elevados de contaminação de Salmonella e/ou maior enriquecimento da cultura de amostras de alimentos contaminados pode resultar em concentrações mais elevadas de DNA genômico de salmonelas em alimentos modificados microbiomes, que levam a valores de Ct de inferiores a análise PCR em tempo real. Valores de CT exibir uma correlação negativa com cobertura de sequenciamento do genoma contaminante Salmonella 4e, portanto, podem ser usados para otimização e alteração do fluxo de trabalho. De acordo com nossa experiência, o enriquecimento da cultura, especialmente o comprimento, é muitas vezes o foco dos esforços de solução de problemas. Por exemplo, o valor de Ct do produto de uma amostra de peito de frango cru IMS-MDA foi relativamente alto no 35.94 (Figura 1). Esta amostra foi inoculada com 2,5 CFU/g de células SE e incubada em BPW a 37 ° C por 2 h. sequenciamento desta amostra não forneceu suficiente cobertura do genoma SE para permitir a predição do sorotipo. Em comparação, todas as outras amostras com 4 h ou mais enriquecimento foram com êxito serotipificadas de quasimetagenomic dados de sequenciamento (dados não mostrados).
Após o sequenciamento, recomendamos usando Kraken16 para identificar Salmonella lê para novas análises de Bioinformática. CFSAN SNP gasoduto17 e SeqSero18 podem ser usados para SNP digitando e serotipagem previsão do sequenciamento bruto lê, respectivamente.
Esta técnica de quasimetagenomic tem várias limitações. Primeiro, concentração de DNA e a pureza dos produtos IMS-MDA, medido por um fluorospectrometer devem ser usados apenas como um indicador preliminar de preparação adequada da amostra. Devido a alta eficiência do MDA, vestígios de ADN de entrada podem ser amplificados para ser suficiente de sequenciamento do genoma inteiro19. Portanto, alta qualidade e quantidade de amostras de DNA ainda podem ser geradas, mesmo se enriquecimento de cultura ou IMS falha efetivamente concentrar células de Salmonella . A análise PCR em tempo real opcional fornece uma avaliação mais segmentada e informativa de fluxo de trabalho de preparação a amostra inteira. Em segundo lugar, difícil-para-cultura Salmonella células, tais como viável mas nonculturable (VBNC) bactéria20, não pode crescer durante o enriquecimento da cultura. Portanto, estas células podem não ser detectadas pelo nosso método.
Em resumo, em comparação com métodos tradicionais, nosso método de preparação de amostra e abordagem de sequenciamento de quasi-metogenomic podem permitir substancial redução da reviravolta analítica de Salmonella-contaminados alimentos e amostras ambientais para robusto subtipos de contaminantes, Salmonella . Além de salmonela, esta técnica tem o potencial de ser aplicado à rápida e concertada de deteção e subtipos outros patógenos de origem alimentar.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Mark Harrison e Gwen Hirsch da Universidade da Geórgia para fornecer gentilmente a estirpe bacteriana e outro apoio para este estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4 °C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80 °C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80 °C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80 °C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4 °C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
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