Summary
في هذه المقالة، نظهر كيف يتم تنفيذ هذا الأسلوب ميكروبيوبسي ماصة، وكيف يمكن استخدام العينة لاستخراج الحمض النووي الريبي لأخذ عينات بسيطة والمتزامن للجلد والدم بطريقة كسبها.
Abstract
خزعة الجلد التقليدية تحد من البحوث السريرية التي تشمل المناطق الحساسة تجميلي أو تطبيقات طب الأطفال نظراً لما اختزاع. هنا، نحن تصف البروتوكول المتعلق باستخدام ماصة الجهاز القائم على ميكرونيدلي، ميكروبيوبسي ماصة، لكسبها لأخذ العينات من الخليط الجلد والدم. هدفنا هو المساعدة في تيسير إحراز تقدم سريع في البحوث السريرية، وإنشاء للمؤشرات الحيوية لأمراض الجلد والحد من الخطر للمشاركين في البحوث السريرية. وعلى النقيض من التقنيات خزعة الجلد التقليدية، ميكروبيوبسي ماصة يمكن تنفيذها في غضون ثوان ولا تتطلب تدريبا مكثفا نظراً لتصميمها بسيط. في هذا التقرير، يصف لنا استخدام ماصة ميكروبيوبسي، بما في ذلك تحميل وتطبيقها، وعلى متطوع. بعد ذلك، نعرض كيفية عزل الحمض النووي الريبي من العينة استيعابها. وأخيراً، نحن شرح استخدام النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) لقياس مستويات التعبير مرناً للدم (CD3E و CD19) والجلد (KRT14 و صور). الاستفادة من الأساليب التي يمكننا وصف قبالة الجرف مجموعات المواد والمواد الكاشفة. ويوفر هذا البروتوكول نهجاً كسبها لأخذ العينات متزامنة من الجلد والدم داخل المصفوفة ميكروبيوبسي ماصة نفس. وقد وجدنا لجان الأخلاقيات البشرية والأطباء والمتطوعين تكون داعمة لهذا النهج في بحوث الأمراض الجلدية.
Introduction
خزعة الجلد هو أحد الأساليب الأكثر أهمية في الأمراض الجلدية لأخذ عينات الجلد وتشخيص الأمراض الجلدية من خلال تقييم نسيجية لاحقة. الأسلوب خزعة الذي ينطوي على استخدام خزعة بليد أو لكمه لإزالة الآفة المشبوهة على جلد المريض لفحص1مهنية طبية. على الرغم من التقنية فعالة، هو الغاية الغازية ويحد البحوث السريرية ونقطة النهاية ينطوي عادة على تقنيات البيولوجيا الجزيئية2،3. التحليل الجزيئي للأمراض الجلدية لديها القدرة على توفير معلومات بيولوجية محددة للغاية أن يتعذر تحليل نسيجية، مما ييسر المخدرات الاكتشاف والمرض التشخيص4،5. إلى جانب ذلك، نموذج الطلب في التقنيات الجزيئية الأكثر صغير نسبيا وقد تؤدي إلى الحد من استخدام الحيوانات والسماح بعدد أكبر من replicates. ولذلك، هناك واضحة تحتاج لأسلوب بديلة التي تمكن التحليل الجزيئي في البحوث السريرية ويقلل من المخاطر للمشاركين.
لمعالجة هذه حاجة في هذا المجال، وضعت مجموعتنا رواية منصة التشخيص القائم على ميكرونيدلي، ميكروبيوبسي ماصة، التي تمكن من جمع كمية صغيرة من الجلد مختلطة مع الدم ب طريقة بسيطة وكسبها6. والغرض من هذا المنشور وصف ميكروبيوبسي ماصة كأداة لأخذ عينات لتسهيل التحليل الجزيئي عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي في البحوث السريرية.
سابقا، لقد قمنا بوصف النسخة الأولى من ميكروبيوبسي، ميكروبيوبسي الجلد، الذي يتكون من ميكرونيدلي من تصميم ثلاثة طبقة ألواح الصلب لاستخراج قطعة صغيرة من أنسجة الجلد7. ويأتي حداثة هذا الجهاز من نقاط اتصال متعددة من ميكرونيدلي تسمح الأنسجة كفاءة استخراج3. وفي المقابل، خزعة جلد دائرية لكمه يوفر نقطة اتصال واحدة فقط ودموع الجلد ببساطة دون التقاط أي نموذج في بعض الحالات. استناداً إلى ميكروبيوبسي الجلد، وضعنا مؤخرا ميكروبيوبسي ماصة الدم والجلد أخذ عينات من قدرات. ثبت الجهاز يكون قابلاً للاستخدام في المناطق الفقيرة بالموارد في دراسة وبائية الأخيرة6.
نظراً لتصميمها بسيط، ميكروبيوبسي ماصة يمكن تنفيذها في غضون ثوان قليلة، ولا تتطلب تدريبا مكثفا. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك حاجة إلى مخدر موضعي، وموقع التطبيق لا يسبب تندب. ويتيح هذا البروتوكول الباحثين أو أصحاب المهن الطبية دون أخذ العينات ذات الصلة التدريب للحصول على البيانات الجلد المستهدف للتحليل الجزيئي. أننا نتوقع من الأجهزة ميكروسامبلينج تصبح روتينية في بحوث الجلد في المستقبل.
على الرغم من ميكروبيوبسي أبلغ في دراسات أخرى أمراض الجلد التي تنطوي على تقنيات التشخيص الجزيئي6،،من89،10، مثل فيروس الورم الحليمي البشري اكتشاف الحمض النووي، هذا البروتوكول هو الأول لإظهار تفاصيل تقنيات استخراج وتجهيز العينة ميكروبيوبسي ماصة. علاوة على ذلك، وهذا هو أول تقرير يصف التنميط التعبير الجيني النسبي للجلد وخلايا الدم في عينات ميكروبيوبسي.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة "مترو جنوب لجنة أخلاقيات البحوث البشرية" وجامعة كوينزلاند البشرية بحوث أخلاقيات اللجنة (حريك-13-كباح-551 و UQ2013001551) ولجنة الأخلاقيات البشرية جامعة جنوب أستراليا (200607).
1. تصنيع ميكروبيوبسي ماصة
- ليزر قص الأجزاء ميكرونيدلي من 50 ميكرومتر الطبية-الصف الفولاذ المقاوم للصدأ ورقة وطبقة ماصة (ورق الترشيح)، على التوالي (الشكل 1).
ملاحظة: هي ملفقة الأجزاء الأخرى، بما في ذلك المكبس والحالة، الجهاز مع تقنيات النماذج الأولية السريعة، مثل 3D الطباعة. - نقع جميع الأجزاء، باستثناء طبقة ماصة، في 70% إيثانول (EtOH) لمدة 5 دقائق والهواء الجاف لهم لمدة 30 دقيقة بعد ذلك.
- قم بتجميع microneedle ثلاثة طبقة، مع طبقة ماصة في الوسط (الشكل 1a).
- إدراج microneedle المجتمعون في شق المكبس.
- وضعت في فصل الربيع، وإدراج المكبس في القضية (الشكل 1 ج). تجنب ميكرونيدلي لمس أي شيء في إجراء تجميع لضمان نوعية الإبرة.
- ختم ميكروبيوبسي ماصة مجمعة في حزمة للتعقيم γ-الإشعاع قبل استخدام.
2-أخذ العينات مع ميكروبيوبسي ماصة
- ارتداء القفازات المتاح، والرش يد وأدوات، مثل الملقط، مع 70% EtOH.
- تطهير الموقع التطبيق مع مسح الكحول.
- إزالة ميكروبيوبسي من الحزمة معقمة γ-الإشعاع دون لمس ميكرونيدلي في العملية.
- تحميل الجهاز بسحب المكبس لضغط الربيع حتى يكون هناك 'انقر' سليمة وإقفال المكبس في المكان.
- وتهدف الجهاز على الجلد لأخذ عينات، ضمان أن منطقة أخذ العينات في موقع ثابت.
- التأكد من أن الجهاز عمودي تقريبا على الجلد، ثم تطبيق إيه وان كجم من القوة للجهاز على البشرة.
ملاحظة: تطبيق القوة نزولا إلى الجلد مطلوب لضمان تغلغل كافية ميكرونيدلي. - اضغط على الزناد بالجهاز في مكان للحد ني 10 ق لعينات الدم التي سيتم استيعابها.
ملاحظة: إذا كان الجهاز هو صدر قبل 10 s، هناك أقل من عينة أسر.
3. استخراج الحمض النووي الريبي
ملاحظة: تم تعديل إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي من البروتوكول المصنعين لعزل الحمض النووي الريبي الأمثل من عينة ميكروبيوبسيد. يتم تضمين كافة الكواشف والأعمدة المستخدمة في استخراج الحمض النووي الريبي في عدة ما لم يشر إلى خلاف ذلك.
- سحب المكبس و microneedle ماصة من القضية باليدين بلطف. ضمان أن لا تأتي غيض ميكرونيدلي اتصال مع أي شيء أثناء الإزالة.
- إزالة microneedle ماصة من المكبس. التمسك باثنين من الثقوب في ميكرونيدلي مع زوج من الملقط العقيمة وتخلعها.
- وضع microneedle سليمة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل (ليس من عدة عزل الحمض النووي الريبي؛ انظر الجدول للمواد) المعبأة مع 50 ميليلتر من "المخزن المؤقت الاستخراج"، مع الجانب إبرة أسفل نحو الأسفل. لتقليل الخسائر في عينة، ترك الأنبوب في الثلج الجاف لمدة 5 دقائق قبل معالجة العينة.
- الدوامة بإيجاز (3-5 ق) لإزالة بعض المواد التي شملتها العينة من الحافة.
- احتضان microneedle في الأنبوب في الروك لمدة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية.
ملاحظة: الحل المخزن المؤقت الذي سيتم استيعابها في طبقة ماصة فورا. - ضع الجزء العلوي من مستوى ميكرونيدلي (الجانب المعاكس من الإبرة) مع الحافة العلوية لمل 2 [ميكروفوج] أنابيب استخدام الملقط العقيمة.
- أغلق غطاء الأنبوب بأعلى ميكرونيدلي يقام في مكان بين كاب وأنبوب.
- تدور الأنبوب في 16,000 س ز أو بأقصى سرعة ممكنة لمدة 30 ثانية لإزالة المواد عينات من طبقة ماصة للجهاز.
- إزالة ميكرونيدلي عناية مع الملقط دون غمس العودة إلى الحل المخزن المؤقت. الاحتفاظ بالانبوب وتجاهل في ميكرونيدلي.
- الطرد المركزي هذه العينات في 3,000 س ز 2 دقيقة ماصة المادة طافية المحتوية على الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بعناية في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- إضافة 250 ميليلتر من "المخزن المؤقت لتكييف" على الغشاء تصفية العمود تنقية واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي في العمود في أنبوب جمع في 16,000 س ز أو بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 50 ميليلتر من 70% EtOH في العينة التي تم جمعها من 3.9 خطوة. مزيج جيد من قبل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- نقل الخليط (~ 100 ميليلتر) في العمود تنقية اشترطت.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 غ س فورا، متبوعاً الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 30 ثانية لإزالة في التدفق من خلال.
- إضافة 100 ميليلتر ليغسل المخزن المؤقت 1 (W1) في عمود تنقية والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8,000 س ز.
- إعداد حل الدناز بإضافة 5 ميليلتر من الدناز أنا "حل الأسهم" إلى 35 ميليلتر من RDD المخزن المؤقت في ميكروسينتريفوجي منفصلة أنبوب لكل عينة. مزيج من عكس بلطف.
ملاحظة: يتم معاملة الدناز المراد تنفيذها في العمود "تنقية"، بدلاً من لوحة بكر فيما بعد، بسبب كمية العينة. - إضافة 40 ميليلتر من الدناز حضانة المزيج مباشرة إلى الغشاء العمود تنقية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 40 ميليلتر من W1 في الغشاء العمود تنقية. أجهزة الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 15 ثانية.
- "الماصة؛" 100 ميليلتر من غسل العازلة 2 (W2) في العمود تنقية بعد العلاج الدناز والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8,000 س ز.
- إضافة آخر ميليلتر 100 من W2 في العمود تنقية والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في س 16,000 غ. الاختيار العمود تنقية أي غسيل المتبقية من المخزن المؤقت. إعادة الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 1 دقيقة إذا بقيت أي المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- نقل العمود تنقية لأنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل جديدة المنصوص عليها في هذه المجموعة.
- "الماصة؛" ميليلتر 11 خالية رناسي المياه (لم ترد في الطقم عزل الحمض النووي الريبي)، بدلاً من المخزن المؤقت شطف (EB)، مباشرة على الغشاء لتنقية العمود. بلطف تلمس طرف الماصة إلى سطح الغشاء أثناء الاستغناء عن المياه خالية من رناسي لضمان أقصى امتصاص المياه خالية من رناسي في الغشاء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- الطرد المركزي في عمود 1 دقيقة في 1,000 س ز لتوزيع المياه خالية من رناسي في العمود، ثم الطرد المركزي ل 16,000 ز س في 1 دقيقة الوت الجيش الملكي النيبالي.
ملاحظة: لا ينصح الكمي الجيش الملكي النيبالي بسبب كمية صغيرة من العينة. - إيقاف نقطة #1: تخزين عينات الحمض النووي الريبي مجموع في-80 درجة مئوية إذا كان لا يتم توليف كدنا فورا.
ملاحظة: تجنب التجميد إذا لم يكن ذلك ضروريا نظراً لتركيز منخفض من عينات الحمض النووي الريبي.
4-كدنا التوليف
- إذابة العينة المجمدة على الجليد (من 3.25 الخطوة).
- توليف كدنا من مجموع الجيش الملكي النيبالي مع كدنا توليف عدة وفقا للإجراء أدناه.
- إعداد مزيج رد فعل: ميليلتر 11 من مجموع الجيش الملكي النيبالي، ميليلتر 4 من 5 × ترانسامب المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية، 4 ميليلتر من الماء خالية من الدناز/رناسي. المزيج بلطف بيبيتينج.
- تشغيل النسخ العكسي على جهاز cycler حرارية: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها خطوة نهائية عكس المنتسخة المنظمة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إيقاف نقطة #2: تخزين العينة يدون عكس في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5-قبكر رد فعل و "تحليل البيانات"
ملاحظة: صممت الإشعال لردود الفعل qPCR تمتد إلى حدود إنترون لتجنب تضخيم الحمض النووي باستخدام "نكبي التمهيدي الانفجار" (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). مرجع الجينات المستخدمة في هذه الدراسة هو RPLP0 (انظر القسم المناقشة للحصول على مزيد من المعلومات).
- إذابة العينة المجمدة على الجليد (من الخطوة 4، 5).
- أداء قبكر مع عدة qPCR ميكس الرئيسية وفقا للإجراء أدناه.
- إعداد مزيج الرئيسي الذي يحتوي على ما يلي كل رد فعل: 5 ميليلتر من مزيج رد فعل x qPCR 2، ميليلتر 0.4 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام، ميليلتر 0.4 من 10 ميكرون عكس التمهيدي، 2.2 ميليلتر من الماء خالية من الدناز. المزيج بلطف بيبيتينج. إعداد العينات في تريبليكاتيس.
- "الماصة؛" 8 ميليلتر من مزيج الرئيسي في كل بئر 384-جيدا PCR اللوحة الأولى والثانية ثم ميليلتر من كدنا من كل عينة (أي ما مجموعة 10 ميليلتر كل بئر).
ملاحظة: لا تحكم قالب (المجلس الوطني الانتقالي) ولا تحكم المنتسخة العكسية (-RT) مدرجة بوصفها عناصر سلبية. - ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، والطرد المركزي بإيجاز.
- تشغيل رد فعل التضخيم في cycler حرارية في الوقت الحقيقي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (تنشيط بوليميراز)، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية 5 s (تمسخ)، 60 درجة مئوية لمدة 10 s (الصلب) و 72 درجة مئوية لمدة 10 ق (ملحق).
- حساب تركيز عينات الحمض النووي الريبي بالتحريف من منحنى قياسي وأعد من قوالب مع تركيزات معروفة.
- إنشاء إجراء التجربة الجديدة في البرنامج.
- انقر فوق تعريف وتعيين إعداد معايير لإعداد تمييع المسلسل للوحات.
- تحديد وترتيب الآبار عينات والمعايير. انقر فوق تطبيق.
- انقر فوق تحليل في علامة التبويب نتيجة لتقييم المنحنى القياسي. تأكيد المنحدر، وقيمة2 R، وكفاءة التضخيم وخطأ تفي بالمعايير التجريبية.
- التحقق من كميات العينات غير معروف بصريا على المنحنى القياسي استناداً إلى قيمها Ct.
ملاحظة: يتم إنشاء المنحنى المعياري، بما في ذلك اختيار عامل إضعاف، وفقا للبروتوكولات المنشورة11،،من1213.
- القيام بتحليل التعبير الجيني مرناً باستخدام أسلوب ΔCt (Ct هو تطبيع لجين ريفينسي).
- طرح قيمة الأشعة المقطعية للجين المستهدف من قيمة الأشعة المقطعية للجينات مرجع الحصول على قيمة ΔCt.
- متوسط القيم ΔCt التقنية وإنشاء نسخ متماثلة.
- الأرض وتحليل التعبير الجيني مع إحصاءات البرنامج11،14 (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يتم تنفيذ تحليل التعبير الجيني وفقا للبروتوكولات المنشورة13.
Representative Results
أبلغنا قبل أن ميكرونيدلي ميكروبيوبسي الجلد تخترق الجلد حوالي 500 ميكرومتر البالغ7. تصميم ميكرونيدلي ميكروبيوبسي الجلد يشبه جداً واحد على ميكروبيوبسي ماصة (الشكل 2a). بينما ميكروبيوبسي ماصة تتألف من طبقة ماصة في الوسط لامتصاص الدم، ميكروبيوبسي الجلد الوارد قناة لالتقاط الميكانيكية لانسجة الجلد. كما أدى استخدام طبقة ماصة لاختلاف طفيف في البعد ميكرونيدلي (ماصة: 1.50 × 0.50 × 0.21 مم مقابل الجلد: 1.50 × 0.50 × 0.15 مم).
يظهر الشكل 2b مواقع التطبيق 5 دقائق بعد ماصة، وطبقت ميكروبيوبسيس الجلد في الذراع الأيسر فولار من المتطوعين الذكور. نظراً للتشابه بين تصميمين microneedle، قابلة للمقارنة، مع الحمامي البسيطة المواقع التطبيق من كلا الجهازين. كلا الموقعين التطبيق لم تكن ملحوظة بعد 48 ساعة مع لا ندوب اليسار خلف. وهذا يؤيد الفرضية القائلة بأن هذا الجهاز مينيملي لديها الإمكانيات للمساعدة في شاشة مواقع متعددة من تطبيق أو تتم على أساس منتظم.
الشكل 2 (ج) يظهر صورة تمثيلية طبقة ماصة من ميكروبيوبسي ماصة بعد المطبق في الذراع فولر من الذكور المتطوعين. كما هو موضح في الشكل، تم القبض على بضع قطع صغيرة من الجلد قرب غيض من ميكرونيدلي، وقد تم استيعاب بعض الدم في ورق الترشيح. وهذا يشير إلى أن الجهاز اخترق الجلد والقبض على كل من الجلد والدم في وقت واحد داخل المصفوفة ميكروبيوبسي ماصة نفس. يظهر الشكل 2d أخذ العينات بعد الجلد ميكروبيوبسي، الجيل السابق من ميكروبيوبسي، للمقارنة. قناة ميكروبيوبسي الجلد القبض على قطعة صغيرة من الجلد، ولكن مقدار الدم على ميكرونيدلي كانت صغيرة بالنسبة إلى ميكروبيوبسي ماصة. كلا الموقعين التطبيق لم تكن ملحوظة في غضون 48 ساعة. في هذه التجربة، تم تطبيق ميكروبيوبسي ماصة مع وقت عقد 10-s بعد التطبيق، بينما الجلد ميكروبيوبسي كان الإفراج عنه فورا بعد تطبيق بسبب الاختلاف في التصميم.
كما هو موضح في الشكل 3 ألف، مجموعتين من ميكروبيوبسي ماص متورطون في هذه التجربة التي تستند إلى بروتوكول التطبيق: 'إطلاق سراح' وعقد 10-s '. لمجموعة 'الإفراج الفوري'، طبق الجهاز باستخدام بروتوكول ميكروبيوبسي الجلد الأصلي نفسه، مع الجهاز يتم إزالتها من موقع التطبيق مباشرة بعد التطبيق. عقد 10-s ' المجموعة، عقد الجهاز في مكان بعد تطبيق النسبة 10 s لتحسين جمع العينات. أقيمت مجموعتي ميكروبيوبسي ماصة لإظهار كيفية تطبيق النهج الذي يمكن أن تؤثر على كمية العينة. اختير وقت عقد 10-s كفترة زمنية معقولة سريرياً لإثبات أن وقت تطبيق يؤثر على مقدار عينة قابلة للاسترداد.
استرداد كمية الحمض النووي الريبي من المجموعتين ميكروبيوبسي ماصة كانت 0.33 ± 0.39 نغ 'إطلاق سراح' و 1.43 ± 0.88 نغ لعقد 10-s ' (الشكل 3 ألف، n = 20)، مما يوحي بزيادة النوبات مع الوقت إجراء إضافي. وهذا يشير إلى أن تطبيق الجهاز ماصة مع الوقت عقد 10-s أسفرت عن مزيد من الحمض النووي الريبي المستخرج. قد يكون الفرق بسبب وجود عينة الدم زيادة في طبقة ماصة (الشكل 3 ج). في الواقع، فشل الفريق 'الإفراج الفوري' (الشكل 3b) لجمع مبلغ مماثل للدم مع طبقة ماصة بالمقارنة بعقد 10-s ' مجموعة (الشكل 3 ج). كما تجدر الإشارة إلى أن أطلق سراحهم فورا ميكروبيوبسيس كانت قريبة من المحور س، مما يشير إلى أنها كانت أحداث سلبية أو عرض كمية قليلة جداً من الحمض النووي الريبي. ولذلك، النتيجة التحقق من صحة فرضية أن وقت عقد سيكون له أثر على أداء الجهاز كما قد يستغرق وقتاً للدم لاستيعابها من قبل طبقة ماصة.
حيث تم تصميم الجهاز للدم وأخذ عينات الجلد، كان يستخدم qPCR للكشف عن التعبير عن المؤشرات الحيوية الجلد والدم لكلا الجهازين للمقارنة. كنا التيروزينات، صور، كالعلامات البيولوجية للخلايا الصباغية و KRT14 كالعلامات البيولوجية للخلايا الكيراتينيه في البشرة قابلة للحياة. شملت عينات ميكروبيوبسي الجلد في التجربة بالنسبة للمقارنة. كما هو مبين في الشكل 4، على الرغم من أن الجلد وميكروبيوبسيس ماصة طبقت بطريقة مختلفة بسبب الاختلاف في التصميم، التعبير المستويات سواء الجلد المؤشرات الحيوية طير و KRT14 وكانت مماثلة لكل من الأجهزة كما هو مبين البيانات. خلايا الدم البيضاء المؤشرات الحيوية (CD3E، CD19، خلايا ب وخلايا T) تم العثور على أن تكون أكثر انتشارا في ميكروبيوبسي ماصة عينات من العينات ميكروبيوبسي الجلد. هذه النتيجة تشير إلى أن ميكروبيوبسي ماصة أداؤها أفضل في جمع الدم ولكن لا يزال يحتفظ القدرة على التقاط الجلد بالمقارنة مع ميكروبيوبسي الجلد (n = 5).
رقم 1. تصنيع ميكروبيوبسي ماصة. (أ) ثلاثة طبقة ميكرونيدلي. (ب) جميع الأجزاء من الجهاز. (ج) تجميع ميكروبيوبسي ماصة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. ميكروبيوبسي ماصة كانت قادرة على التقاط عينات الجلد والدم في وقت واحد دون ترك ندبة على الذراع الأيسر فولر من المتطوعين الذكور. (أ) إجراء مقارنة بين ميكرونيدليس ميكروبيوبسيس ماصة والجلد. (ب) تطبيق المواقع التي خلفها ميكروبيوبسيس ماصة والجلد 5 دقائق بعد التطبيق. (ج، د) ميكرونيدليس ميكروبيوبسيس ماصة والجلد بعد التطبيق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. ميكروبيوبسي ماصة القبض على المزيد من الدم وعينات الحمض النووي الريبي عند تطبيقها على 10-س. (أ) الساعة 10-s بعد تطبيق عقد أسفر عن كمية أكبر من الحمض النووي الريبي من الإفراج عن الجهاز فورا (n = 20). أشرطة الخطأ تمثل التنمية المستدامة من الوسط (* * *ف< 0.0001). (ب، ج) صور الممثلة ميكروبيوبسيس ماصة بعد التطبيق مع 'الإفراج الفوري' وعقد 10-s ' النهج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. مقارنة مستويات التعبير مرناً بين الجلد وميكروبيوبسيس ماصة (n = 5). التعبير الجيني قد تم تطبيع مع إشارة الجينات RPLP0. أشرطة الخطأ تمثل التنمية المستدامة من الوسط (*p< 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وتبين هذه النتائج أن ميكروبيوبسي ماصة يمكن استخدامها كأداة لأخذ عينات بسيطة وكسبها من الجلد والدم مخلوط للتوصيف الجزيئي. تطبيق الجهاز وفقا للبروتوكول لدينا أمر ضروري للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها كما هو موضح بالفرق في الجيش الملكي النيبالي المبلغ المسترد مع تطبيق مختلف البروتوكولات (الشكل 3). حالما يتم استخراج العينة، تكون العينة اللاحقة تجهيز خطوة لاستخراج الحمض النووي الريبي مماثل جداً للبروتوكولات المعمول بها15،16. إلى جانب ذلك هو تغيير رئيسي آخر من الخطوات الأولية في استخراج الحمض النووي الريبي التي يتم تعديلها ميكروبيوبسي ماصة، استخدام المياه خالية من رناسي لتحسين النتائج للتطبيقات المتلقين للمعلومات. وعلاوة على ذلك، فمن الجدير بالذكر أن الجين المرجعية المستخدمة في هذه الدراسة هو RPLP0. ذكر RPLP0، وظيفتها معروف جيدا لخلية مختلفة و أنواع الأنسجة17، كجينات مرجعية مناسبة للاستخدام في سرطانات الجلد غير الميلانوما وأورام18.
أحد القيود الرئيسية للجهاز هو إزالة ميكروبيوبسي من الجهاز، والتي تستغرق وقتاً طويلاً، ويحتمل أن يزيد من فرصة لفقدان عينة، خاصة بالنسبة للعينات الحساسة مثل الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه المسألة بالتبريد قبل جميع أدوات المعالجة العقيمة، مثل أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل، على الثلج الجاف.
استخدام ميكروبيوبسي ماصة بسيطة ولا تتطلب تدريبا مكثفا. خزعة التقليدية ليس من الضروري كما يسمح ميكروبيوبسي التوصيف الجزيئي مع تقنيات التشخيص الجزيئي المنشأة، مثل الرايت qPCR. كذلك قياس وإثبات قدرته أخذ العينات من ميكروبيوبسي ماصة، تم التحقيق في المؤلفات السابقة التي تنطوي على استخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة جلد الإنسان. من جلد ملم نموذجي 3.0 أو 4.0 لكمه خزعة، أفادت ثلاث دراسات الحمض النووي الريبي المستخرج المبالغ تتراوح من 50 إلى 200 نانوغرام كل مغ من الجلد الأنسجة19،،من2021. مقارنة مع 1.43 الحرس الوطني للجيش الملكي النيبالي الذي تم استرداده من ميكروبيوبسي ماصة على وزن الجلد عينات الأنسجة في المتوسط (الشكل 3)، من المتوقع أن مجموعة من 0.29-115 ميكروغرام استناداً إلى نفس نسبة الحمض النووي الريبي للأنسجة من دراسات خزعة لكمه الجلد.
هذا البروتوكول لا تخلو من المزالق المحتملة، على الرغم من أن بعض المشاكل يمكن التغلب عليها بسهولة. على سبيل المثال، اقترح البيانات استخراج الحمض النووي الريبي تباين كبير حتى مع الوقت عقد 10-s (الشكل 3). لمعالجة هذه المشكلة، ينطوي أحد الحلول المحتملة على الاستفادة المثلى من بروتوكول التطبيق. معلمات مثل القوة المطبقة على الجلد وينبغي اختبار زمن الاحتباس والأمثل للحد من التباينات في استخراج عينة. والمسألة الأخرى المحتملة هي إزالة ميكروبيوبسي من الجهاز، والتي قد تؤثر على سلامة العينة والانتعاش. على الرغم من أن إزالة ميكروبيوبسي لاستخراج الحمض النووي الريبي نهج فعال، الإجراء بأكمله مملة، والعينة قد يكون عرضه للتلوث في هذه العملية. ولذلك هو الغاية المطلوب تعديل البروتوكول تجهيز العينة بغية ضمان سلامة العينة والحيلولة دون فقدان عينة.
متى يتم تناول المسألتين أعلاه، فمن المتوقع أن الجهاز سوف تصبح أداة قياسية للبحوث السريرية. من المهم أن نلاحظ أن يلتقط الجهاز عينة الجلد والدم في وقت واحد، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تحليل البيانات التعبير الجيني. وفي الختام، هذا البروتوكول وصف تفاصيل أداء ميكروبيوبسي ماصة كأداة سهلة وكسبها للعينة اللاحقة التجهيز للتنميط التعبير الجيني النسبي وأخذ عينات من الدم والجلد مجتمعة.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونود أن نعترف بتمويل المنح الدراسية APP1109749 و APP1111216، ومنحة العيد المئوي لجامعة كوينزلاند ومنحة أبحاث الدراسات العليا الدولية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
