Summary
I den här artikeln visar vi hur absorberande microbiopsy tekniken utförs och hur provet kan användas för RNA-extraktion för enkel och samtidig provtagning för hud och blod på ett minimalt invasivt sätt.
Abstract
Konventionella hudbiopsi begränsar den kliniska forskning som involverar kosmetiskt känsliga områden eller pediatric applikationer på grund av dess invasivt. Här beskriver vi protokollet för att använda en absorberande microneedle-baserad enhet, absorberande microbiopsy, för minimalt invasiv provtagning av hud och blod blandning. Vårt mål är att bidra till att underlätta snabba framsteg i klinisk forskning, inrättandet av biomarkörer för hudsjukdom och minska risken för klinisk forskning deltagare. I motsats till konventionella huden biopsi tekniker, den absorberande microbiopsy kan utföras inom sekunder och kräver inte intensiv träning på grund av sin enkla design. I den här rapporten beskriver vi användning av absorberande microbiopsy, inbegripet lastning, ansökan och volontär. Sedan visar vi hur man isolera RNA från absorberade provet. Slutligen visar vi användningen av kvantitativa omvänd transkription PCR (RT-qPCR) för att kvantifiera mRNA-uttrycksnivåerna för både blod (CD3E och CD19) och hud (KRT14 och TYR). De metoder som vi beskriver utnyttja off hylla kit och reagenser. Detta protokoll erbjuder en minimalt invasiv metod för samtidig provtagning av hud och blod inom samma absorberande microbiopsy matris. Vi har hittat mänskliga etiska kommittéer, kliniker och frivilliga att vara stödjande av detta tillvägagångssätt för Dermatologisk forskning.
Introduction
Hudbiopsi är en av de mest grundläggande teknikerna i dermatologi för huden provtagning och efterföljande diagnos av hudsjukdomar genom histopatologisk bedömning. Biopsi tekniken innebär en läkare använder en blade eller punch biopsi ta bort misstänkta lesionen på patientens hud för undersökning1. Även om tekniken är effektiv, det är mycket invasiva och begränsar klinisk forskning som slutpunkten innebär vanligtvis molekylärbiologiska tekniker2,3. Molekylär analys av hudsjukdomar har potential att ge mycket specifik biologisk information att histopatologisk analys kan inte, vilket underlättar drug discovery och sjukdom diagnos4,5. Dessutom kan prov efterfrågan i den molekylära tekniker är jämförelsevis liten och leda till en minskad användning av djur och tillåta ett större antal replikat. Därför finns det ett klart behov för en alternativ teknik som möjliggör molekylär analys i klinisk forskning och sänker risken för deltagarna.
För att lösa sådana behov i fältet, har vår grupp utvecklat en roman microneedle-baserade diagnostiska plattform, absorberande microbiopsy, som möjliggör insamling av en liten mängd hud blandat med blod i en enkel och minimalinvasiv sätt6. Syftet med denna skrift är att beskriva den absorberande microbiopsy som en provtagning verktyg för att underlätta molekylär analys via RNA-extraktion i klinisk forskning.
Tidigare har vi beskrivit den första versionen av microbiopsy, huden microbiopsy, som består av en microneedle gjord av en tre lager stålplåt design att extrahera små bitar av huden vävnader7. Nyhet i enheten kommer från flera kontaktpunkter från den microneedle som tillåter effektiv vävnad utvinning3. Däremot en cirkulär hudbiopsi punch ger endast en kontaktpunkt och helt enkelt tårar huden utan att fånga varje prov i vissa fall. Baserat på den huden microbiopsy, utvecklat vi nyligen den absorberande microbiopsy som har både blod och hud provtagning kapacitet. Enheten har visat sig vara genomförbart för användning i resurssvaga områden i en nyligen epidemiologisk studie6.
På grund av sin enkla design, den absorberande microbiopsy kan utföras inom ett par sekunder och kräver inte omfattande utbildning. Dessutom behövs inte lokalbedövning och appliceringsstället orsakar inte ärrbildning. Detta protokoll kan forskare eller vårdpersonal utan relevant provtagning utbildning att få riktade hud data för molekylär analys. Vi förväntar oss microsampling enheter att bli rutin i huden forskning i framtiden.
Även om microbiopsy har rapporterats i andra studier av hud sjukdom som involverade molekylära diagnosmetoder6,8,9,10, såsom humant papillomvirus DNA upptäckt, detta protokoll är de första att Visa detaljerna i de prov utvinning och bearbetning av teknikerna för den absorberande microbiopsy. Vidare, detta är den första rapporten som beskriver relativa gen uttryck profilering av huden och blodkroppar i microbiopsy prover.
Protocol
Studien var godkänd av Metro South mänskliga forskningsetisk kommitté och University of Queensland mänsklig forskning etikkommittén (HREC-13-QPAH-551 och UQ2013001551) och University of South Australia mänskliga etikkommittén (200607).
1. absorberande Microbiopsy Fabrication
- Laserskurna microneedle delar från 50 µm medicinsk kvalitet rostfri plåt och absorberande skikt (filterpapper), respektive (figur 1).
Obs: Andra delar, inklusive kolven och fallet av enheten tillverkas med rapid-prototyping tekniker, såsom 3D-utskrifter. - Njut av alla delar, utom i absorberande skiktet i 70% etanol (EtOH) för 5 min och luft torka dem för 30 min efteråt.
- Montera de tre lager microneedle, absorberande skikt i mitten (figur 1a).
- Infoga den monterade microneedle i skåran på kolven.
- Sätta på våren och sätt in kolven i fallet (figur 1 c). Undvika den microneedle att röra något i förfarandet montering för att kvalitetssäkra nål.
- Försegla den monterade absorberande microbiopsy i ett paket för γ-strålning sterilisering innan du använder.
2. provtagning med den absorberande Microbiopsy
- Använd engångshandskar, och spray händer och verktyg, såsom tången, med 70% EtOH.
- Sanera appliceringsstället med en alkoholservett.
- Ta bort microbiopsy från γ-strålning steriliserad paketet utan att röra microneedle i processen.
- Ladda enheten genom att dra kolven för att komprimera våren tills det finns ett 'klick' ljud och kolven låser på plats.
- Sikta enheten på huden som skall provtas, garanterar provtagningsområdet i en fast position.
- Se till att enheten är ungefär vinkelrätt mot huden, applicera sedan ≥1 kg kraft i enheten på huden.
Obs: Tillämpa kraft nedåt in i huden krävs för att säkerställa tillräcklig penetration av microneedle. - Tryck på avtryckaren och håll enheten på plats för minst 10 s för blodprovet att absorberas.
Obs: Om enheten släpps innan 10 s, det finns mindre prov tagna.
3. RNA-extraktion
Obs: RNA extraktion förfarandena ändrades från tillverkarnas protokoll för optimal isolering av RNA från microbiopsied provet. Alla reagenser och kolumn som används i RNA-extraktion ingår i kit om inget annat anges.
- Dra ut kolven och absorberande microneedle från fallet av händer försiktigt. Se till att spetsen på microneedle inte kommer i kontakt med något under borttagning.
- Ta bort den absorberande microneedle från kolven. Hålla fast vid de två hålen på microneedle med ett par steril pincett och dra ut.
- Sätta den intakt microneedle i en 2 mL mikrocentrifug rör (inte från RNA isolering kit; se Tabell för material) förfyllda med 50 µL av utvinning buffert, med nålen vänd mot botten. För att minimera prov förlust, lämna röret på torris för 5 min innan provet.
- Vortex kort (3-5 s) ta bort några av de samplade material från spets.
- Inkubera i microneedle i röret på en rocker för 30 min vid 42 ° C.
Obs: Buffertlösningen kommer att absorberas i det absorberande lagret omedelbart. - Placera den övre delen av nivån microneedle (motsatt sida från nålen) med den övre kanten av de 2 mL mikrofugrör med steril pincett.
- Stäng locket på röret så att toppen av microneedle hålls på plats mellan den gemensamma jordbrukspolitiken och röret.
- Snurra röret på 16 000 x g eller med maximal hastighet för 30 s för att ta bort de samplade material från det absorberande lagret av enheten.
- Ta bort microneedle försiktigt med pincett utan doppa tillbaka i buffertlösningen. Håll röret och kassera microneedle.
- Centrifugera proverna vid 3 000 x g i 2 min. pipett supernatanten som innehåller de extraherade RNA noga in i en ny mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 250 µL av konditionering buffert på rening kolumn filtermembranet och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Centrifugera kolumnen i samling röret på 16 000 x g eller på maxhastighet för 1 min.
- Tillsätt 50 µL av 70% EtOH i det insamlade provet från steg 3,9. Blanda väl genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Över blandningen (~ 100 µL) i kolumnen betingade rening.
- Centrifugera under 2 minuter vid 100 x g omedelbart, följt av en centrifugering vid 16 000 x g i 30 s för att ta bort genomflöde.
- Tillsätt 100 µL av Wash Buffer 1 (W1) in i rening kolumn och Centrifugera i 1 min vid 8000 x g.
- Bered DNAS genom att lägga till 5 µL av DNAS jag lager lösning 35 µL buffert RDD i en separat mikrocentrifug rör för varje prov. Blanda genom att försiktigt vända.
Obs: DNAS behandling är att utföras på kolumnen rening, i stället för i PCR-plattan efteråt, på grund av mängden av provet. - Tillsätt 40 µL av DNAS inkubation mix direkt i rening kolumn membranet. Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 40 µL av W1 till rening kolumn membranet. Centrifugera vid 8000 x g i 15 s.
- Pipettera 100 µL av Wash Buffer 2 (W2) i kolumnen rening efter DNAS behandling och Centrifugera i 1 min vid 8000 x g.
- Lägga till en annan 100 µL av W2 i kolumnen rening och Centrifugera i 2 min på 16.000 x g. Kontrollera kolumnen rening för eventuella resterande tvättbuffert. Centrifugera igen vid 16 000 x g i 1 min om någon tvättbuffert förblir.
- Överföra kolumnen rening till en ny 0,5 mL mikrocentrifug rör i kit.
- Pipettera 11 µL av RNase-fritt vatten (medföljer inte i RNA isolering kit), i stället för eluering buffert (EB), direkt på membranet i kolumnen rening. Försiktigt röra spetsen på pipetten på ytan av membranet medan dispensering RNase-fria vattnet för att säkerställa maximal absorption av RNase-fritt vatten in i membranet. Odla i rumstemperatur i 2 min.
- Centrifugera kolumnen för 1 min på 1 000 x g att distribuera RNase-fria vattnet i kolumnen, sedan Centrifugera i 16 000 x g på 1 min till eluera RNA.
Obs: RNA kvantifiering rekommenderas inte på grund av den lilla mängden av provet. - Stoppa punkt #1: lagra det totala RNA-provet vid-80 ° C om cDNA syntes inte utförs omedelbart.
Obs: Undvik frysning om inte nödvändigt med tanke på den låga koncentrationen av RNA-prov.
4. cDNA syntes
- Tina frusna provet på is (från steg 3,25).
- Syntetisera cDNA från total-RNA med cDNA syntes kit enligt proceduren nedan.
- Förbereda reaktionsblandning: 11 µL av total-RNA, 4 µL av 5 x TransAmp buffert, 1 µL av omvänt transkriptas, 4 µL av DNAS/RNase-gratis vatten. Blanda försiktigt genom pipettering.
- Köra omvänd transkription på en termocykel apparater: 25 ° C i 10 min, 42 ° C under 15 minuter, följt av en avslutande omvänt transkriptas inaktivering steg vid 85 ° C i 5 min.
- Stoppa punkt #2: lagra omvänd transkriberas provet vid-80 ° C fram till användning.
5. qPCR reaktion och dataanalys
Obs: Primers för qPCR reaktioner var avsedda att spänna intron gränser för att undvika förstärkning av genomisk DNA använder NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Referensgenen används i denna studie är RPLP0 (se avsnittet diskussion för mer information).
- Tina frusna provet på is (från steg 4,5).
- Utföra qPCR med qPCR huvudmixen kit enligt proceduren nedan.
- Förbereda master mix som innehåller följande per reaktion: 5 µL 2 x qPCR reaktion mix, 0.4 µL 10 µM framåt primer, 0.4 µL 10 µM reverse primer, 2,2 µL av DNAS-gratis vatten. Blanda försiktigt genom pipettering. Ställa in proverna i exemplar.
- Pipettera 8 µL master mix i varje brunn på en 384-väl PCR-plattan första och sedan 2 µL av cDNA från varje prov (totalt 10 µL per brunn).
Obs: Ingen mall kontroll (NTC) och ingen omvänt transkriptas kontroll (-RT) ingår som negativa kontroller. - Försegla plattan med självhäftande film och centrifugera kort.
- Kör förstärkning reaktionen på en realtid termocykel: 95 ° C i 2 min (polymeras aktivering), följt av 40 cykler av 95 ° C för 5 s (denaturering), 60 ° C under 10 s (glödgning) och 72 ° C under 10 s (förlängning).
- Beräkna den RNA-koncentrationen av prover genom interpolering från en standardkurva beredd från mallar med kända koncentrationer.
- Skapa ett Nytt Experiment i programvaran.
- Klicka på definiera och ställa upp normer att ställa in seriell utspädning för plåtar.
- Välj och ordna brunnarna för standarder och prover. Klicka på tillämpa.
- Klicka på analysera i fliken resultat att bedöma standardkurvan. Bekräfta den lutning, R2 värde, förstärkning effektivitet och fel uppfyller de experimentella.
- Kontrollera kvantiteterna av de okända proverna visuellt på standardkurvan baserat på deras Ct-värden.
Obs: Byggandet av standardkurvan, inklusive valet av utspädningsfaktorn, utförs enligt publicerade protokoll11,12,13.
- Utföra gen uttryck analys av mRNA med metoden ΔCt (Ct är normaliserad till en refence-gen).
- Subtrahera Ct värdet av målgenen från Ct värdet av referensgenen att erhålla det ΔCt värdet.
- Genomsnittliga ΔCt värdena för tekniska replikat.
- Rita och analysera genuttrycket med statistik programvara11,14 (se Tabell för material).
Obs: Alternativt gene expression analysen utförs enligt publicerade protokoll13.
Representative Results
Vi har tidigare rapporterat att microneedle av den huden microbiopsy penetrerar huden cirka 500 µm djupa7. Microneedle utformningen av hud microbiopsy är mycket lik den på absorberande microbiopsy (figur 2a). Medan den absorberande microbiopsy bestod av ett absorberande lager i mitten för blod absorption, innehöll den huden microbiopsy en kanal för mekanisk upptagning av huden vävnader. Användning av absorberande lager också lett till en liten skillnad i dimensionen microneedle (absorberande: 1,50 x 0,50 x 0.21 mm vs hud: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).
Figur 2b visar applikationsställena 5 min efter absorberande och huden mikrobiopsier tillämpades på vänster volara arm av manlig volontär. På grund av likheten mellan de två microneedle mönster var applikationsställena från båda enheterna jämförbara, med mindre erytem. Både ansökan platser var inte märkbar efter 48 h med inga ärr kvar bakom. Detta stöder hypotesen att minimalt invasiv enheten har potential att hjälpa skärmen flera appliceringsställen eller utföras regelbundet.
Figur 2 c visar en representativ bild av det absorberande skiktet av det absorberande microbiopsy efter tillämpas på volar armen av en manlig volontär. I figuren visas några små bitar av huden fångades nära spetsen av microneedle och lite blod var absorberas i pappersfiltret. Detta indikerar att enheten trängt igenom huden och fångas både hud och blod samtidigt inom samma absorberande microbiopsy matris. Figur 2d visar en efter provtagning huden microbiopsy, den tidigare generationen av microbiopsy, för jämförelse. Kanalen för den hud microbiopsy fångade en liten bit av huden, men mängden blod på microneedle var liten i förhållande till den absorberande microbiopsy. Både ansökan platser var inte märkbar inom 48 h. I experimentet, tillämpades den absorberande microbiopsy med en 10 s hålltid efter applicering, samtidigt som huden microbiopsy släpptes omedelbart efter applicering på grund av skillnaden i design.
Som visas i figur 3a, två grupper av absorberande microbiopsy var inblandade i detta experiment utifrån programprotokoll: 'Omedelbar frigivning' och ' 10-s innehav '. För gruppen 'Omedelbar frigivning' tillämpades enheten använder samma ursprungliga huden microbiopsy protokoll, med enheten tas bort från applikationsstället omedelbart efter applicering. För ' 10-s innehav ' grupp, enheten hölls på plats efter ansökan om 10 s att förbättra provsamling. De två grupperna av absorberande microbiopsy sattes upp att demonstrera hur metoden ansökan kunde påverka provmängden. De 10 s hålltid valdes som kliniskt rimlig tid att demonstrera att ansökningstiden påverkar mängden utvinningsbara provet.
Mängden RNA återhämtat sig från de två absorberande microbiopsy grupperna var 0,33 ± 0,39 ng 'Pressmeddelande' och 1,43 ± 0,88 ng för ' 10-s anläggning ' (figur 3a, n = 20), vilket tyder på en 4-faldig ökning med den extra hålltid. Detta indikerar att tillämpa absorberande enheten med 10 s innehav tiden resulterat i mer RNA extraherade. Skillnaden kan bero på förekomsten av ökad blodprov i absorberande lager (figur 3 c). Faktiskt gruppen 'Omedelbar frigivning' (figur 3b) lyckats samla ett liknande belopp av blod med absorberande skiktet jämfört med ' 10-s innehav ' gruppen (figur 3 c). Det bör också noteras att mest omedelbart släppt mikrobiopsier var nära x-axeln, vilket tyder på de negativa händelser eller visas en mycket låg mängd RNA. Därför verifieras resultatet hypotesen att hålltid skulle ha en inverkan på prestanda för enheten eftersom det kan ta tid för blodet att absorberas av det absorberande skiktet.
Eftersom apparaten var avsedd för blod och hud provtagning, användes qPCR för att upptäcka uttrycket av hud och blod biomarkörer för båda enheterna för jämförelse. Vi använde tyrosinase, TYR, som en biomarkör för melanocyter och KRT14 som en biomarkör för keratinocyter i livskraftiga epidermis. Hud microbiopsy prover ingick i experimentet för jämförelse. Som visas i figur 4, även om huden och absorberande mikrobiopsier tillämpades annorlunda på grund av skillnaden i design, uttrycket nivåer för både hud biomarkörer TYR och KRT14 var jämförbar för båda enheterna som anges av den data. Vita blodkroppar biomarkörer (CD3E, T-celler och CD19, B-celler) befanns vara vanligare i absorberande microbiopsy prover än i huden microbiopsy prover. Detta resultat tyder på att den absorberande microbiopsy klarat sig bättre i blodinsamling men ändå behållit kapacitet för att fånga huden jämfört med den huden microbiopsy (n = 5).
Figur 1. Tillverkning av absorberande microbiopsy. (a) tre skikt microneedle. (b) alla delar av enheten. (c) monterade absorberande microbiopsy. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Den absorberande microbiopsy kunde fånga hud och blod prover samtidigt utan att lämna ett ärr på vänster volara arm av manlig volontär. (a) en jämförelse mellan mikronålar av absorberande och hud mikrobiopsier. (b) tillämpning platser kvar av absorberande och hud mikrobiopsier 5 min efter applicering. (c, d) Mikronålar av absorberande och hud mikrobiopsier efter applicering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Den absorberande microbiopsy fångat mer blod och RNA-prov när tillämpas för 10-s. (a) 10 s efter ansökan hålltid resulterade i en högre mängd RNA än släppa enheten omedelbart (n = 20). Felstaplar representera S.D. från medelvärdet (***p< 0,0001). (b, c) Representativa bilder av det absorberande mikrobiopsier efter applicering med 'Omedelbar frigivning' och ' 10-s innehav ' metoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Jämförelse av mRNA-uttrycksnivåerna mellan hud och absorberande mikrobiopsier (n = 5). Genuttrycket hade varit normaliserade med referens gen RPLP0. Felstaplar representera S.D. från medelvärdet (*p< 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Dessa resultat visar att det absorberande microbiopsy kan användas som ett verktyg för enkel och minimalt invasiv provtagning av hud och blod blandning för molekylär karakterisering. Enheten ansökan i enlighet med våra protokoll är viktigt för att få tillförlitliga resultat som visas av skillnaden i RNA-belopp som återvinns med olika applikationsprotokoll (figur 3). När provet extraheras, är efterföljande provet bearbetningssteg för RNA-extraktion mycket liknande till etablerade protokoll15,16. Förutom från de första stegen i RNA-extraktion som modifieras för den absorberande microbiopsy, är en annan viktig förändring att använda RNase-fritt vatten för att förbättra resultaten för nedströms tillämpningar. Dessutom är det värt att nämna att referensgenen används i denna studie är RPLP0. RPLP0, vars funktion är känt för olika celler och vävnad typer17, har rapporterats som en lämplig referensgenen för användning i icke-melanom hudcancer och precancerösa lesioner18.
En av de viktigaste begränsningarna av enheten är avlägsnande av microbiopsy från enheten, vilket är tidskrävande och potentiellt ökar chansen att prov förlust, speciellt för känslig prover som RNA. Frågan kan dock lösas genom pre-Cooling alla sterila bearbetning verktyg, såsom 2 mL mikrocentrifugrör, på torris.
Användningen av det absorberande microbiopsy är enkel och kräver inte intensiv träning. Konventionella biopsi är inte nödvändig eftersom microbiopsy tillåter molekylär karakterisering med etablerade molekylär diagnos tekniker, såsom RT-qPCR. För att ytterligare kvantifiera och förmåga provtagning av absorberande microbiopsy, undersöktes tidigare litteratur som involverade RNA-extraktion från mänsklig hudvävnad. Från en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre studier har rapporterat de extraherade RNA beloppen varierade från 50 till 200 ng per mg hud vävnad19,20,21. Jämföra med 1,43 ng av RNA som återfanns från den absorberande microbiopsy i genomsnitt (figur 3), vikten av samplade huden vävnader väntas ligga från 0,29-115 µg baserat på samma RNA-till-vävnad förhållandet från huden punch biopsi studier.
Detta protokoll är inte utan potentiella fallgropar, men vissa problem kan lösas enkelt. Till exempel föreslog RNA extraktion data en avsevärd variation även med 10 s innehav tiden (figur 3). För att lösa problemet, innebär en potentiell lösning att optimera programprotokoll. Parametrar såsom kraft appliceras på huden och håller tid bör testas och optimeras för att minska variationerna i provet extraktion. Andra potentiella frågan är avlägsnande av microbiopsy från enheten, vilket kan påverka prov integritet och återhämtning. Även om du tar bort microbiopsy för RNA-extraktion är ett effektivt tillvägagångssätt, hela förfarandet är tråkiga, och provet kan exponeras för föroreningar i processen. Ändring av protokollet prov bearbetning önskas därför mycket för att säkerställa urvalet integritet och förhindra förlust av provet.
När ovanstående två frågor behandlas, förväntas det att enheten kommer att bli en standard verktyg för klinisk forskning. Det är viktigt att notera att enheten fångar både hud och blod prov samtidigt och detta bör beaktas när man analyserar gen uttryck data. Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll för att utföra absorberande microbiopsy som ett lätt och minimalt invasiva verktyg för kombinerad hud och blodprovstagning och efterföljande provet bearbetning för relativa gen uttryck profilering.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna NHMRC stipendier APP1109749 och APP1111216, University of Queensland Centennial stipendium och internationella forskarutbildning forskning Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
