Summary
במאמר זה נדגים איך מתבצעת טכניקת microbiopsy סופג ו איך המדגם יכולים לשמש לחילוץ RNA לדיגום סימולטני ופשוט של עור ודם בצורה פולשנית.
Abstract
הניגודי קונבנציונאלי מגביל את מחקר קליני המערבת האזורים הרגישים קוסמטית או יישומים בילדים בגלל invasiveness שלה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לשימוש של המכשיר סופג מבוסס microneedle,. microbiopsy ספיגה, לדיגום פולשנית של תערובת עור ודם. המטרה שלנו היא לעזור להקל על ההתקדמות המהירה במחקר קליני, הקמתה של סמנים ביולוגיים עבור מחלת העור והפחתת הסיכון למשתתפי מחקר קליני. בניגוד קונבנציונאלי העור ביופסיה טכניקות, microbiopsy סופג יכולה להתבצע תוך שניות, אינו דורש אימונים אינטנסיביים בשל העיצוב הפשוט שלו. בדו ח זה, אנו מתארים את השימוש microbiopsy סופג, כולל וטעינה של יישום, מתנדב. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לבודד RNA מדגם נספג. לבסוף, נדגים את השימוש שעתוק במהופך כמותיים PCR (RT-qPCR) לכמת mRNA רמות הביטוי של דם (CD3E ו- CD19) וגם העור (KRT14 ו- TYR). השיטות אנו מתארים לנצל את המדף ערכות של ריאגנטים. פרוטוקול זה מציע בגישה פולשנית לדיגום סימולטני של עור ודם בתוך המטריצה microbiopsy בולע אותו. מצאנו ועדות האתיקה של האדם, קלינאים ומתנדבים לתמוך בגישה זו דרמטולוגיים למחקר.
Introduction
העור ביופסיה היא אחת מהטכניקות החיוניים ביותר בדרמטולוגיה לדיגום העור ואבחון עוקבות של מחלות עור באמצעות הערכת histopathological. הטכניקה ביופסיה כרוכה רפואי מקצועי באמצעות ביופסיה להב או אגרוף כדי להסיר את הנגע חשוד על עור המטופל בדיקה1. על פי הטכניקה היא יעילה, היא פולשני ביותר, מגביל מחקר קליני כמו נקודת הקצה בדרך כלל כרוך ביולוגיה מולקולרית טכניקות2,3. ניתוח מולקולריים של מחלות עור יש פוטנציאל לספק מידע ביולוגי ספציפי מאוד כי ניתוח histopathological יכול, ובכך להקל על סמים גילוי של מחלה אבחון4,5. חוץ מזה, הדרישה מדגם בטכניקות מולקולריות ביותר הוא קטן יחסית עשוי להוביל לירידה בשימוש בבעלי חיים ואת היתר מספר גדול יותר של משכפל. לכן ברור הצורך טכניקה חלופית מאפשרת ניתוח מולקולרית במחקר קליני, מוריד את הסיכון עבור המשתתפים.
כדי לטפל כזה צורך בשטח, פיתחה הקבוצה שלנו עם הפלטפורמה האבחון מבוססת microneedle הרומן, microbiopsy סופג, המאפשר איסוף כמות זעירה של העור מעורב בדם בצורה פשוטה ולא פולשנית6. מטרת הפרסום היא לתאר את. microbiopsy ספיגה ככלי הדגימה כדי להקל על אנליזה מולקולרית באמצעות החילוץ-RNA במחקר קליני.
בעבר, תארנו את הגרסה הראשונה של microbiopsy, microbiopsy עור, אשר מורכב microneedle של עיצוב תלת שכבתי פלדה כדי לחלץ חתיכות קטנות של רקמות העור7. החידוש של התקן זה נובע בנקודות המגע מרובים מ- microneedle המתיר רקמות יעיל חילוץ3. לעומת זאת, ביופסיה ניקוב עור עגול מספק נקודת קשר אחד בלבד, פשוט קורע את העור ללא לכידת דוגמה במקרים מסוימים. בהתבסס על microbiopsy העור, פיתחנו לאחרונה את microbiopsy ספיגה אשר יש דם ועור הדגימה יכולות. המכשיר הוכח להיות ריאלי עבור שימוש באזורים משאב מסכן המחקר אפידמיולוגיים האחרונות6.
בשל העיצוב הפשוט שלו,. microbiopsy ספיגה יכול להתבצע תוך כמה שניות, אינה דורשת הכשרה נרחבת. בנוסף, הרדמה מקומית אינה דרושה, האפליקציות באתר אינו גורם הצטלקות. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר חוקרים או אנשי מקצוע רפואיים ללא רלוונטי דגימה אימון להשגת עור יישוב נתונים, לצורך ניתוחם מולקולרית. אנו מצפים microsampling התקנים להיות שגרתי במחקר העור בעתיד.
למרות microbiopsy שדווח במחקרים אחרים מחלות עור מעורבים טכניקות אבחון מולקולריות6,8,9,10, כגון נגיף הפפילומה האנושי זיהוי ה-DNA, פרוטוקול זה הוא הראשון כדי להדגים את הפרטים של דוגמת הפקת ועיבוד טכניקות. microbiopsy ספיגה. יתר על כן, זהו הדוח הראשון המתאר את פרופיל ביטוי גנטי היחסי של העור, בתאי הדם בדגימות microbiopsy.
Protocol
המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה מחקר אנושי בדרום המטרו, אוניברסיטת קווינסלנד האנושי מחקר ועדת האתיקה (HREC-13-QPAH-551 ו- UQ2013001551), האוניברסיטה של דרום אוסטרליה האנושי ועדת האתיקה (200607).
1. ספיגה Microbiopsy ייצור
- לייזר לחתוך חלקים microneedle מ 50 מיקרומטר פלדת אל-חלד באיכות רפואית גיליון ו סופג שכבה (נייר סינון), בהתאמה (איור 1).
הערה: חלקים אחרים, לרבות על הבוכנה, המקרה של המכשיר מיוצרים בטכניקות רפיד-שטנץ, כגון הדפסת תלת-ממד. - לטבול כל החלקים, מלבד השכבה סופג, 70% אתנול (EtOH) במשך 5 דקות, אוויר יבש אותם למשך 30 דקות לאחר מכן.
- להרכיב את microneedle תלת שכבתי, עם השכבה סופג באמצע (איור 1 א').
- הכנס את microneedle התאספו לתוך הסדק של הבוכנה.
- לשים על המעיין והכנס הבוכנה לתוך התיק (איור 1 c). למנוע את microneedle לגעת בשום דבר במסגרת ההליך וההספק כדי להבטיח את איכות המחט.
- חותם את microbiopsy סופג שהורכב חבילה עבור קרינה-γ עיקור לפני השימוש.
2. דגימה עם Microbiopsy סופג
- ללבוש כפפות חד פעמיות, ואת הידיים ספריי כלים, כגון מלקחיים, עם 70% EtOH.
- לחטא האפליקציות באתר עם המחיקה אלכוהול.
- להסיר microbiopsy את חבילת סטיריליים γ-קרינה בלי לגעת microneedle את התהליך.
- לטעון את המכשיר על ידי משיכת הבוכנה כדי לדחוס את האביב עד שיש 'קליק' קול, את המנעולים הבוכנה במקום.
- מטרת המכשיר על העור, מתחננות שיטעמו שהייתך אזור הדגימה בעמדה קבועה.
- ודא שהתקן בניצב העור ולאחר מכן להחיל ≥1 ק ג של כוח על המכשיר על העור.
הערה: הפעלת כוח כלפי מטה לתוך העור נדרש כדי להבטיח מספיק חדירת microneedle. - תלחץ על ההדק ותחזיק את המכשיר במקום למשך תקופה מינימלית של 10 s עבור דגימת הדם להיספג.
הערה: אם המכשיר הוא שוחרר לפני 10 s, יש פחות מדגם בשבי.
3. RNA החילוץ
הערה: ההליכים החילוץ RNA שונו מפרוטוקול היצרנים לבידוד אופטימלי של RNA מהדגימה microbiopsied. כל ריאגנטים, עמודה בשימוש החילוץ-RNA כלולים בערכה אלא אם צוין אחרת.
- משוך החוצה את הבוכנה ואת microneedle סופג את התיק על ידי הידיים בעדינות. ודא כי קצה microneedle לא בא במגע עם משהו במהלך ההסרה.
- הסר את. microneedle ספיגה הבוכנה. להחזיק שני החורים על microneedle עם זוג מלקחיים סטרילי, תוציא את זה החוצה.
- מכניסים את microneedle שלמות צינור microcentrifuge 2 מ"ל (ולא מתוך ערכת בידוד RNA; ראה טבלה של חומרים) שמולאו מראש עם 50 µL מאגר החילוץ, עם הצד המחט פונה כלפי מטה לתחתית. כדי למזער אובדן לדוגמה, להשאיר את הצינור קרח יבש במשך 5 דקות לפני עיבוד הדגימה.
- מערבולת לזמן קצר (3-5 s) כדי להסיר חלק מהחומרים שנדגמו מהקצה.
- דגירה של microneedle בצינור על כיסא נדנדה למשך 30 דקות ב 42 º C.
הערה: בופר ייקלטו השכבה סופג באופן מיידי. - מניחים את החלק העליון של רמת microneedle (הצד הנגדי של המחט) עם הקצה העליון של הצינור microfuge 2 mL באמצעות מלקחיים סטרילי.
- . סגור את המכסה של הצינור כך העליון של microneedle מתקיים במקום בין שווי שפופרת
- לסובב את הצינורית על 16,000 x g או המהירות המרבית עבור 30 s כדי להסיר את החומרים שנדגמו מהשכבה ספיגה של המכשיר.
- להסיר את microneedle בזהירות עם מלקחיים מבלי חיטט בחזרה בופר. לשמור את הצינור וזורקים את microneedle.
- Centrifuge את הדגימות ב 3000 g x עבור 2 דק פיפטה תגובת שיקוע המכיל את הרנ א שחולצו בזהירות לתוך צינור microcentrifuge.
- הוסף µL 250 מאגר מיזוג לתוך קרום סינון טיהור עמודה ' תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Centrifuge העמודה ' ' הצינור אוסף 16,000 x g או במהירות המרבית עבור 1 דקות.
- להוסיף µL 50 70% EtOH לתוך הדגימה שנאספו מ- 3.9 שלב. מערבבים היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- להעביר את התערובת (~ 100 µL) לתוך העמודה טיהור preconditioned.
- צנטריפוגה למשך 2 דקות ב g x 100 באופן מיידי, ואחריו צנטריפוגה-16,000 g x עבור 30 s כדי להסיר את הזרימה דרך.
- להוסיף 100 µL של שטיפת מאגר 1 (W1) לתוך עמודה טיהור צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 8,000 g x.
- להכין DNase פתרון על-ידי הוספת 5 µL של DNase אני מניות לפתרון µL 35 של מאגר הדויוות ב microcentrifuge נפרדים צינור עבור כל דגימה. מערבבים על-ידי היפוך בעדינות.
הערה: הטיפול DNase הוא להתבצע על העמודה טיהור, במקום בצלחת PCR אחר כך, בגלל הכמות של המדגם. - הוסף µL 40 של מיקס הדגירה DNase ישירות לתוך קרום עמודות טיהור. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הוסף µL 40 של W1 לתוך קרום עמודות טיהור. צנטריפוגה ב 8000 g x 15 s.
- פיפטה µL 100 של שטיפת מאגר 2 (W2) לתוך העמודה טיהור אחרי טיפול DNase צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 8,000 g x.
- להוסיף עוד 100 µL של W2 לתוך העמודה טיהור, צנטריפוגה למשך 2 דקות ב- 16,000 x ג סימון העמודה טיהור עבור כל מאגר לשארי שטיפת. Centrifuge מחדש ב g 16,000 x עבור 1 דקות אם נותר כל מאגר לשטוף.
- להעביר את העמודה טיהור 0.5 mL microcentrifuge צינור המסופק בערכה.
- פיפטה µL 11 נטולת RNase מים (לא סיפקה בערכה בידוד רנ א), במקום • תנאי מאגר (EB), ישירות על גבי הקרום של העמודה טיהור. בעדינות לגעת בקצה של פיפטה השטח של הקרום תוך מחלק את המים ללא RNase כדי להבטיח לספיגה מרבית של מים נטולי RNase לתוך הקרום. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
- Centrifuge את העמודה עבור 1 דקות ב- 1,000 x g כדי להפיץ את המים ללא RNase בעמודה ולאחר מכן צנטריפוגה עבור g 16,000 x-1 דקות עד elute RNA.
הערה: RNA כימות אינה מומלצת בשל כמות קטנה של המדגם. - לעצור את נקודת #1: לאחסן את המדגם RNA ב-80 מעלות צלזיוס אם cDNA סינתזה אינה מבוצעת באופן מיידי.
הערה: להימנע קופאת אם לא הכרחי רמת הריכוז נמוך מדגם ה-RNA.
4. cDNA סינתזה
- להפשיר את הדגימה קפוא בקרח (מתוך שלב 3.25).
- לסנתז cDNA של RNA הכולל עם cDNA סינתזה הערכה על פי ההליך שלהלן.
- מכינים את תערובת התגובה: µL 11 של RNA הכולל, µL 4 5 x מאגר TransAmp, 1 µL של רוורס טרנסקריפטאז, µL 4 DNase/RNase ללא מים. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
- לרוץ שעתוק במהופך על מנגנון הצנטרפוגה תרמי: 25 º C למשך 10 דקות, 42 º C למשך 15 דקות, ואחריו צעד איון הסופי רוורס טרנסקריפטאז ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- לעצור את נקודת #2: לאחסן את הדגימה משועתקים הפוכה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
5. qPCR התגובה וניתוח נתונים
הערה: צבעי יסוד תגובות qPCR תוכננו כדי להתפרס אינטרון גבולות כדי להימנע ההגברה של הדנ א באמצעות NCBI פריימר הפיצוץ (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). הגן הפניה השתמשו במחקר זה הוא RPLP0 (ראה דיון בסעיף למידע נוסף).
- להפשיר את הדגימה קפוא בקרח (מתוך שלב 4.5).
- לבצע qPCR עם ערכת מיקס מאסטר qPCR על-פי ההליך שלהלן.
- להכין תערובת הבסיס המכיל שמקיפים לכל תגובה: µL 5 של תערובת התגובה x qPCR 2, µL 0.4 10 מיקרומטר פריימר לפנים, µL 0.4 של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, µL 2.2 DNase ללא מים. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting. להגדיר את הדגימות ב- triplicates.
- פיפטה 8 µL של המיקס מאסטר לתוך כל טוב של 384-ובכן PCR צלחת הראשונה ו- 2 µL של cDNA של כל דגימה (סך של µL 10 לכל טוב).
הערה: אין שליטה תבנית (NTC), שליטה רוורס טרנסקריפטאז (-RT) הינם כלולים כפקדי שלילי. - לאטום את הצלחת עם סרט דביק, צנטריפוגה בקצרה.
- להפעיל את תגובת הגברה הצנטרפוגה תרמי בזמן אמת: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (הפעלה פולימראז), ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 5 s (דנטורציה), 60 מעלות צלזיוס במשך 10 s (ריפוי) ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 10 s (סיומת).
- לחשב את הריכוז RNA של דוגמאות על-ידי אינטרפולציה של עיקול רגיל מקריסטלים של תבניות עם ריכוזים ידועים.
- ליצור התנסות חדשה של התוכנה.
- לחץ על הגדר, לקבוע את הסטנדרטים להגדיר דילול טורי עבור לוחות.
- לבחור, לארגן הבארות סטנדרטים ודוגמאות. לחץ על החל.
- לחץ על נתח בכרטיסיה ' תוצאה ' כדי להעריך את עקומת סטנדרטי. לאשר את המדרון, ערך2 R, הגברה ויעילות שגיאה בקריטריונים ניסיוני.
- בדוק את הכמויות של הדגימות לא ידוע מבחינה ויזואלית בעקומה רגיל המבוסס על ערכיהם Ct.
הערה: הבנייה של עיקול רגיל, כולל הבחירה של גורם לדילול, מתבצע על פי פרוטוקולים שפורסמו11,12,13.
- לבצע ניתוח ביטוי גנטי של mRNA על ידי שימוש בשיטת ΔCt (Ct מנורמל ל גן refence).
- חיסור הערך Ct של ג'ין המטרה מהערך Ct של הפניה ג'ין כדי לקבל את הערך ΔCt.
- ממוצע הערכים ΔCt של משכפל טכני.
- מגרש ולנתח בביטוי הגן עם סטטיסטיקה תוכנה11,14 (ראה טבלה של חומרים).
הערה: לחלופין, הביטוי מפענוח מתבצע על פי פרוטוקולים שפורסמו13.
Representative Results
בעבר דיווחנו כי microneedle של microbiopsy העור חודר עמוק כ-500 מיקרומטר7את העור. העיצוב microneedle של העור microbiopsy דומה מאוד ל- one על. microbiopsy ספיגה (איור 2 א). בעוד microbiopsy סופג מורכבת שכבת סופג באמצע לקליטה דם, microbiopsy העור הכיל ערוץ עבור לכידת מכני של רקמות העור. השימוש של שכבה סופג הוביל גם הבדל קטן בממד microneedle (ספיגה: 1.50 x 0.50 x 0.21 מ מ לעומת עור: 1.50 x 0.50 x 0.15 מ מ).
איור 2b מראה האתרים יישום 5 דקות לאחר ספיגה, העור microbiopsies הוחלו על זרוע שמאל volar של מתנדב זכר. בשל הדמיון בין שני העיצובים microneedle, האתרים יישום של שני ההתקנים היו דומות, עם אריתמה משנית. בשני האתרים יישום היו לא מורגש לאחר 48 שעות עם צלקות לא נשאר מאחור. זה תומך את ההשערה כי זה מכשיר פולשנית יש פוטנציאל לסייע לסנן אתרים יישומים מרובים או שיש לבצע על בסיס קבוע.
איור 2 c מראה תמונה ייצוגית של השכבה ספיגה של microbiopsy סופג לאחר החלת את הזרוע volar של גבר מתנדבים. כפי שמוצג באיור, כמה חתיכות. קטנות של העור נלכדו סמוך לקצה microneedle, קצת דם נספג לתוך נייר הסינון. אפשרות זו מציינת כי המכשיר שחדר לעור, שנתפסו העור וגם הדם בו-זמנית בתוך המטריצה microbiopsy בולע אותו. איור דו-ממדי הופעות דגימה שלאחר העור microbiopsy, הדור הקודם של microbiopsy, לשם השוואה. הערוץ של microbiopsy העור נכבש חתיכה קטנה של העור, אך כמות הדם על microneedle היה קטן יחסית. microbiopsy ספיגה. בשני האתרים יישום היו לא מורגש בתוך 48 שעות. בניסוי,. microbiopsy ספיגה הוחלה עם זמן מחזיק 10-s שלאחר יישום, תוך העור microbiopsy שוחרר מיד לאחר החלת בשל הבדל בעיצוב.
כפי שמוצג באיור 3a, שתי קבוצות של. microbiopsy ספיגה היו מעורבים בניסוי זה, המבוסס על פרוטוקול יישום: 'שחרור מיידי' ואחזקת ' 10-s'. עבור הקבוצה 'שחרור מיידי', המכשיר הוחל שימוש באותו המקורי העור microbiopsy פרוטוקול, עם ההתקן הוסר מהאתר היישום מיד לאחר יישום. עבור מחזיק ' 10-s' קבוצה, המכשיר נערך במקום לאחר היישום עבור 10 s לשיפור איסוף הדגימה. שתי הקבוצות של. microbiopsy ספיגה סידרו להדגים איך הגישה יישום שיכול להשפיע על כמות הדגימה. הפעם 10-s מחזיק נבחר על-זמן סביר קלינית כדי להדגים כי הפעם היישום משפיע על כמות הדגימה ההשבה.
הכמות של RNA התאוששה שתי הקבוצות microbiopsy סופג היו 0.33 ± 0.39 ng עבור 'שחרור מיידי' ו 1.43 ± 0.88 ng להחזקת ' 10-s' (איור 3a, n = 20), רומז עלייה 4-fold עם הזמן אחזקות נוספות. אפשרות זו מציינת כי החלת המכשיר סופג עם הזמן מחזיק 10-s הביא יותר RNA שחולצו. ההבדל יכול להיות בגלל הנוכחות של דגימת דם מוגברת בשכבה סופג (איור 3 c). אכן, הקבוצה "שחרור מיידי" (איור 3b) נכשלה לאסוף כמות דומה של הדם עם השכבה סופג לעומת החזקת ' 10-s' קבוצה (איור 3 c). יש גם לציין כי microbiopsies באופן מיידי שפורסמו היו בקרבת ציר ה-x, רומז שהם היו אירועים שליליים או מוצג סכום נמוך מאוד של RNA. לכן, התוצאה לאמת את ההשערה הזמן אחזקות שתהיה לה השפעה על הביצועים של המכשיר כפי עלול לקחת זמן עבור הדם להיקלט על ידי השכבה סופג.
מאז המכשיר תוכנן עבור הדגימה עור ודם, qPCR שימש כדי לזהות את הביטוי של סמנים ביולוגיים עור ודם עבור שני מכשירים להשוואה. השתמשנו tyrosinase, TYR, כמו סמן מלנוציטים ו KRT14 כמו סמן עבור keratinocytes האפידרמיס קיימא. דגימות microbiopsy עור נכללו בניסוי להשוואה. כפי שמוצג באיור4, למרות העור, microbiopsies סופג יושמו באופן שונה בשל הבדל בעיצוב, הביטוי רמות הן העור סמנים ביולוגיים TYR , KRT14 היו דומות בשני התקנים כפי שמציין נתונים. תא דם לבן סמנים ביולוגיים (CD3E, תאי T ו- CD19, בתאי B) נמצאו להיות נפוץ יותר בדגימות. microbiopsy ספיגה מאשר בדגימות microbiopsy העור. תוצאה זו מרמזת כי. microbiopsy ספיגה ביצעו טוב יותר באוסף דם אבל עדיין שמר את הקיבולת עבור לכידת עור לעומת microbiopsy העור (n = 5).
איור 1. הזיוף של ספיגה microbiopsy. (א) microneedle תלת שכבתי. (ב) כל חלקי המכשיר. (ג microbiopsy ספיגה שהורכב ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. . Microbiopsy ספיגה הצליח ללכוד דגימות עור ודם בו-זמנית מבלי להשאיר צלקת על זרוע שמאל volar של מתנדב זכר. (א) השוואה בין microneedles של. microbiopsies ספיגה של העור. (ב) יישום באתרי שמאל על ידי ספיגה של עור microbiopsies 5 דקות לאחר היישום. (c, d) Microneedles של. microbiopsies ספיגה של העור לאחר היישום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. . Microbiopsy ספיגה שנתפסו יותר דם ודגימת RNA כאשר מוחל על 10-s. (א) את זמן המעצר שלאחר יישום 10-s, גרמו סכום גבוה יותר של RNA יותר משחררים את המכשיר באופן מיידי (n = 20). קווי שגיאה מייצגים ש מן הממוצע (* * *p< 0.0001). (b, c) תמונות נציג microbiopsies סופג לאחר היישום ועם 'שחרור מיידי' מחזיק ' 10-s' גישות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ההשוואה של mRNA רמות הביטוי בין העור סופג microbiopsies (n = 5). היה כבר מנורמל בביטוי הגן עם הפניה ג'ין RPLP0. קווי שגיאה מייצגים ש מן הממוצע (*p< 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
תוצאות אלו מדגימים כי. microbiopsy ספיגה יכול לשמש ככלי עבור הדגימה פשוטה ולא פולשנית של תערובת עור ודם על אפיון מולקולרי. יישום התקן לפי הפרוטוקול שלנו חיוני להשגת תוצאות אמינות כפי שמוצג על ידי ההבדל בכמות ה-RNA התאוששה עם יישומים שונים פרוטוקולים (איור 3). ברגע המדגם מופק, הדגימה הבאים עיבוד שלב לחילוץ RNA דומה מאוד פרוטוקולים הוקמה15,16. חוץ מזה מן השלבים הראשונים ב- RNA החילוץ ששונו עבור. microbiopsy ספיגה, שינוי מפתח נוסף הוא השימוש במים נטולי RNase כדי לשפר את התוצאות עבור יישומים במורד הזרם. יתר על כן, ראוי להזכיר כי הגן הפניה השתמשו במחקר זה הוא RPLP0. RPLP0, שתפקידם הוא נודע בזכות תאים שונים, סוגי רקמות17, דווחה גנים התייחסות מתאימה לשימוש עור שאינו מלנומה סרטן נגעים טרום סרטניים18.
אחת המגבלות העיקריות של המכשיר היא הסרת microbiopsy של המכשיר, אשר גוזלת זמן, פוטנציאל מגדילה את הסיכוי לאובדן לדוגמה, במיוחד עבור דגימות רגיש כמו ה-RNA. למרות זאת, הסוגיה ניתן להתגבר על ידי קירור קדם כל הכלים לעיבוד סטרילי, כגון צינורות microcentrifuge 2 מ"ל, על קרח יבש.
השימוש. microbiopsy ספיגה הוא פשוט, לא דורשת אימונים אינטנסיביים. ביופסיה הקונבנציונלית אינה הכרחית כמו microbiopsy מאפשרת אפיון מולקולרי עם טכניקות אבחון מולקולרי הוקמה, כגון RT-qPCR. עוד יותר לכמת, להפגין את יכולת דגימה של. microbiopsy ספיגה, נחקר ספרות הקודם מעורבים החילוץ-RNA מרקמות העור האנושי. ממעטפת טיפוסי 3.0 או 4.0 מ"מ אגרוף ביופסיה, שלושה מחקרים דיווחו על הכמויות RNA שחולצו נע בין 50 ל-200 ng לכל מ"ג של העור רקמות19,20,21. השוואת 1.43 נג של RNA אשר התאושש את. microbiopsy ספיגה בממוצע (איור 3), המשקל של רקמות העור שנדגמו צפוי טווח של 0.29-115 µg המבוססים על היחס RNA לרקמות באותו ממחקרים ביופסיה של העור אגרוף.
פרוטוקול זה אינה ללא מוקשים פוטנציאליים, אם כי חלק מהבעיות בקלות ניתן להתגבר. לדוגמה, הנתונים החילוץ RNA הציע וריאציה ניכרת אפילו עם הזמן 10-s אחזקות (איור 3). כדי לטפל בבעיה, פתרון פוטנציאלי אחד כולל אופטימיזציה של פרוטוקול יישום. פרמטרים כגון כוח נמרח על העור, מחזיק זמן צריך להיות נבדק אופטימיזציה להקטנת הווריאציות מדגם החילוץ. הנושא פוטנציאליים אחרים הוא הסרת microbiopsy של המכשיר, אשר עשוי להשפיע את מדגם ובטחונו לשחזור. למרות הסרת את microbiopsy לחילוץ RNA היא גישה יעילה, כל תהליך מייגע, הדגימה עלולה להיחשף לזיהום בתהליך. לכן, השינוי של פרוטוקול עיבוד הדגימה רצוי מאוד כדי להבטיח שלמות הדגימה ולמנוע אובדן הדגימה.
לאחר שני הנושאים לעיל מטופלות, צפוי כי המכשיר יהיה כלי תקני למחקר קליני. חשוב לשים לב כי המכשיר לוכד דגימת עור ודם בו זמנית, זה צריך לקחת בחשבון בעת ניתוח הנתונים ביטוי גנים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ביצוע microbiopsy סופג ככלי קל ולא פולשנית עור משולב, לקיחת דמים, הדגימה הבאים עיבוד פרופיל ביטוי גנטי היחסי.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות NHMRC מלגות APP1109749 ו- APP1111216, אוניברסיטת קווינסלנד סנטניאל מלגה, מלגת מחקר לתארים מתקדמים הבינלאומי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
