Summary
I denne artikkelen viser vi hvordan absorberende microbiopsy teknikken er utført og hvordan prøven kan brukes for RNA utvinning for enkel og samtidige prøvetaking av hud og blod i en minimalt invasiv måte.
Abstract
Konvensjonelle huden biopsi begrenser klinisk forskning som involverer kosmetisk følsomme områder eller pediatric programmer på grunn av sin invasiveness. Her beskriver vi protokollen for å bruke en absorberende microneedle-basert enhet, absorberende microbiopsy, for minimal invasiv utvalg av hud og blod blanding. Vårt mål er å hjelpe lette rask fremgang i klinisk forskning, etablering av biomarkers for huden sykdommen og å redusere risikoen for klinisk forskning deltakere. I motsetning til konvensjonelle huden biopsi teknikker, absorberende microbiopsy kan utføres innen sekunder og krever ikke intensiv trening på grunn av sin enkle design. I denne rapporten beskriver vi bruk av absorberende microbiopsy, inkludert lasting og programmet, på frivillig. Deretter viser vi hvordan du isolerer RNA fra absorbert eksempel. Til slutt, viser vi bruk av kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) å kvantifisere mRNA uttrykk nivåer av både blod (CD3E og CD19) og hud (KRT14 og TYR). Metodene som beskriver vi benytte av sokkelen kits og reagenser. Denne protokollen gir en minimal invasiv tilnærming for samtidige prøvetaking av hud og blod innenfor samme absorberende microbiopsy matrise. Vi har funnet menneskelige komiteer, klinikere og frivillige til å være støttende av denne tilnærmingen til dermatologisk forskning.
Introduction
Hudbiopsi er en av de viktigste teknikkene i Dermatologi for huden prøvetaking og senere diagnosen hudsykdommer gjennom histopathological vurdering. Biopsi teknikken innebærer en medisinsk faglig bruker en bladet eller punch biopsi fjerne mistenksom lesjonen på pasientens hud for eksamen1. Om teknikken er effektiv, det er svært invasiv og begrenser klinisk forskning som endepunktet innebærer vanligvis molekylærbiologi teknikker2,3. Molekylær analyse av hudsykdommer har potensial til å gi svært spesifikke biologiske informasjon at histopathological analyse kan dermed tilrettelegge drug discovery og sykdom diagnose4,5. Dessuten kan prøve etterspørselen i mest molekylær teknikker er relativt liten og føre til en reduksjon i dyr bruk og tillate et større tall av replikat. Derfor er det et klart behov for en alternativ teknikk som muliggjør molekylær analyse i klinisk forskning og reduserer risikoen for deltakerne.
For å løse slike behov innen, har vår gruppe utviklet en ny microneedle-baserte diagnostiske plattform, absorberende microbiopsy, som muliggjør innsamling av en liten mengde hud blandet med blod i en enkel og minimal invasiv måte6. Formålet med denne publikasjonen er å beskrive den absorberende microbiopsy som et utvalg verktøy for å forenkle molekylær analyse gjennom RNA utvinning i klinisk forskning.
Vi har tidligere beskrevet den første versjonen av microbiopsy, hud microbiopsy, som består av en microneedle laget i en trelags stålplate trekke ut små biter av huden vev7. Nyheten av denne enheten kommer fra flere kontakten poeng fra microneedle som gir effektiv vev utvinning3. Derimot en sirkulær huden punch biopsi gir eneste kontaktpunkt og bare tårer huden uten å fange noen eksempler i noen tilfeller. Basert på huden microbiopsy, utviklet vi nylig av absorberende microbiopsy som har både blod og hud prøvetaking evner. Enheten har vist seg å være mulig for bruk i ressurs-fattig områder i et siste epidemiologisk studie6.
På grunn av sin enkle design, absorberende microbiopsy kan utføres innen få sekunder og krever ikke omfattende opplæring. Dessuten lokalbedøvelse er ikke nødvendig, og programmet nettstedet føre ikke til arrdannelse. Nåværende protokollen gjør at forskere eller medisinske fagfolk uten relevante prøvetaking trening å få målrettede huden data for molekylær analyse. Vi forventer microsampling enheter å bli rutine i huden forskning i fremtiden.
Selv om microbiopsy har blitt rapportert i andre hud sykdom studier som involverte molekylær diagnostiske teknikker6,8,9,10, som Humant papilloma virus DNA oppdagelsen, denne protokollen er først til å vise detaljene for eksempel utvinning og bearbeiding teknikker for den absorberende microbiopsy. Videre, dette er den første rapporten beskriver den relative gene expression profilering av hud og blod celler i microbiopsy prøver.
Protocol
Studien ble godkjent av Metro Sør menneskelige forskning etikk og den universitetet av Queensland menneskelige forskning etikk komiteen (HREC-13-QPAH-551 og UQ2013001551) og Universitetet i South Australia menneskelige etikk (200607).
1. absorberende Microbiopsy fabrikasjon
- Laser cut microneedle deler fra 50 µm medisinsk kvalitet rustfritt stål ark og absorberende lag (filter papir), henholdsvis (figur 1).
Merk: Andre deler, inkludert stempelet og saken, enheten er fabrikkert med rapid prototyping teknikker, for eksempel 3D-utskrift. - Nyt alle deler, unntatt de absorberende lag, i 70% etanol (EtOH) i 5 min og luft tørke dem i 30 min etterpå.
- Samle tre-lags microneedle, med de absorberende lag i midten (figur 1a).
- Sett inn den monterte microneedle i spalten på stempelet.
- Sett på våren og sette inn stempelet i tilfelle (figur 1 c). Unngå microneedle berører i sammenstillingen prosedyren for å kvalitetssikre nål.
- Forsegle den sammensatte absorberende microbiopsy i en pakke for γ-stråling sterilisering før du bruker.
2. prøvetaking med absorberende Microbiopsy
- Bruke engangshansker, og spray hender og verktøy som tang, med 70% EtOH.
- Rense programmet nettstedet med en alkohol-tørke.
- Fjerne microbiopsy fra γ-stråling sterilisert pakke uten å berøre microneedle i prosessen.
- Laste enheten ved å trekke av stempelet for å komprimere til våren før det er en "Klikk" lyd og stempelet låser på plass.
- Rett enheten mot huden som skal avsøkes, slik at Prøvetakingsområdet er i en fast stilling.
- Kontroller at enheten er ca vinkelrett på huden, deretter bruke ≥1 kg av makt til enheten på huden.
Merk: Anvende makt nedover i huden er nødvendig for å sikre tilstrekkelig gjennomtrenging av microneedle. - Trykk på avtrekkeren og hold enheten i stedet for minst 10 s blodprøve å bli absorbert.
Merk: Hvis enheten er frigitt før 10 s, er det mindre utvalg fanget.
3. RNA utvinning
Merk: RNA utvinning prosedyrene ble endret fra produsenter protokollen for optimal isolering av RNA fra microbiopsied prøve. Alle reagenser og kolonne brukes i RNA utvinning er inkludert i pakken med mindre annet er angitt.
- Dra ut stempelet og absorberende microneedle fra saken av hender forsiktig. Kontroller at spissen av microneedle ikke kommer i kontakt med noe under fjerning.
- Fjern den absorberende microneedle fra stempelet. Holde på to hullene på microneedle med et par sterilt tang og trekk den.
- Sette på intakt microneedle i en 2 mL microcentrifuge tube (ikke fra RNA isolering kit; se Tabellen for materiale) forhåndsutfylt med 50 µL av utvinning Buffer, med nål side vender ned mot bunnen. For å minimere eksempel tap, la røret på tørris i 5 minutter før behandling utvalget.
- Vortex kort (3-5 s) til å fjerne noen av samplet fra spissen.
- Inkuber microneedle i røret på en rocker i 30 min på 42 ° C.
Merk: Buffer løsning blir absorbert inn de absorberende lag umiddelbart. - Plass den øverste delen av microneedle (motsatt side på p) nivået med toppkanten av 2 mL microfuge røret ved hjelp av sterile pinsett.
- Lukk lokket på røret slik at toppen av microneedle holdes på plass mellom dekselet og rør.
- Spin røret på 16.000 x g eller med maksimal hastighet for 30 s fjerne samplet materialet fra de absorberende lag av enheten.
- Fjerne microneedle nøye med tang uten dipping tilbake i buffer løsning. Holde røret og kast microneedle.
- Sentrifuge prøvene 3000 x g i 2 min. Pipette nedbryting som inneholder de utpakkede RNA nøye inn i et nytt microcentrifuge rør.
- Legg til 250 µL condition bufferen på rensing kolonnen filter membranen og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge kolonnen i samlingen røret på 16.000 x g eller maksimumshastighet for 1 min.
- Legge til 50 µL av 70% EtOH i samlet prøven fra trinn 3.9. Bland godt av pipettering forsiktig opp og ned.
- Overføre blanding (~ 100 µL) i kolonnen preconditioned rensing.
- Sentrifuger i 2 minutter på 100 x g umiddelbart etterfulgt av en sentrifugering 16.000 x g for 30 å fjerne gjennomflytsenhet.
- Legg 100 µL vask Buffer 1 (W1) i rensing kolonne og sentrifuge for 1 min 8000 x g.
- Forberede DNase løsning ved å legge til 5 µL av DNase jeg lager løsning på 35 µL av Buffer RDD i en separat microcentrifuge rør for hvert utvalg. Bland ved forsiktig invertere.
Merk: DNase behandling er å utført på kolonnen rensing i stedet for i PCR platen etterpå fordi mengden av prøven. - Legge til 40 µL DNase inkubasjon Mix direkte til rensing kolonnen membranen. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Legge til 40 µL av W1 i rensing kolonnen membranen. Sentrifuger 8000 x g 15 s.
- Pipetter 100 µL av vask Buffer 2 (W2) i kolonnen rensing etter DNase behandling og sentrifuge for 1 min 8000 x g.
- Legg til en annen 100 µL av W2 i kolonnen rensing og sentrifuge i 2 minutter på 16.000 x g. Sjekk kolonnen rensing for eventuelle gjenværende vaskebuffer. Nytt sentrifuge 16.000 x g for 1 min hvis noen vaskebuffer forblir.
- Overføre rensing kolonnen til en ny 0,5 mL microcentrifuge tube i settet.
- Pipetter 11 µL RNase-gratis vann (ikke levert i RNA isolering kit), i stedet for elueringsrør Buffer (EB), direkte på membranen av kolonnen rensing. Forsiktig Berør tuppen på Pipetter til overflaten av membranen mens dispensing RNase-fritt vann for å sikre maksimal absorpsjon av RNase-fritt vann i membranen. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
- Sentrifuge kolonnen for 1 min 1000 x g å distribuere RNase-fri vannet i kolonnen, og deretter sentrifuge for 16.000 x g ved 1 min til elute RNA.
Merk: RNA kvantifisering anbefales ikke på grunn av små mengder prøven. - Stoppe punkt #1: lagre totalt RNA prøven ved-80 ° C hvis cDNA syntese ikke utføres umiddelbart.
Merk: Unngå frysing om ikke nødvendig gitt lav konsentrasjon av RNA prøve.
4. cDNA syntese
- Tine frossen prøven på is (fra trinn 3,25).
- Syntetisere cDNA fra totalt RNA cDNA syntese Kit etter prosedyren nedenfor.
- Forberede reaksjonen blanding: 11 µL av totalt 4 µL av 5 x TransAmp Buffer, 1 µL av revers transkriptase, 4 µL av DNase/RNase-fritt vann. Bland forsiktig ved pipettering.
- Kjøre omvendt transkripsjon på en termisk cycler apparater: 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 15 min, etterfulgt av en siste revers transkriptase inaktivering trinn på 85 ° C i 5 minutter.
- Stoppe punkt #2: lagre omvendt transkribert prøven ved-80 ° C før bruk.
5. qPCR reaksjon og dataanalyse
Merk: Primerne for qPCR reaksjoner ble utformet for å omfatte intron grenser for å unngå forsterkning av genomisk DNA med NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Referanse genet brukt i denne studien er RPLP0 (se drøftingen for mer informasjon).
- Tine frossen prøven på is (fra trinn 4.5).
- Utføre qPCR med qPCR master mix kit etter prosedyren nedenfor.
- Klargjør master blandingen inneholder følgende per reaksjon: 5 µL av 2 x qPCR reaksjonen blanding, 0.4 µL av 10 µM frem primer, 0.4 µL av 10 µM omvendt primer, 2.2 µL DNase uten vann. Bland forsiktig ved pipettering. Definere eksemplene i triplicates.
- Pipetter 8 µL av master blandingen i hver brønn av en 384-vel PCR platen først og deretter 2 µL av cDNA fra hver prøve (totalt 10 µL per brønn).
Merk: Ingen mal kontroll (NTC) og ingen revers transkriptase kontroll (-RT) inkluderes som negative kontroller. - Forsegle platen med lim og sentrifuge kort.
- Kjøre forsterkning reaksjonen på en sanntid termisk cycler: 95 ° C i 2 minutter (polymerase aktivisering), etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 5 s (rødsprit), 60 ° C for 10 s (annealing) og 72 ° C for 10 s (filtypen).
- Beregn konsentrasjonen RNA prøver av interpolering fra et standardkurve forberedt fra maler med kjente konsentrasjoner.
- Opprett et Nytt eksperiment i programvaren.
- Klikk Definer og sette opp standarder angi føljetong fortynning for plater.
- Velge og ordne brønnene standarder og eksempler. Velger du Bruk.
- Klikk analyser i kategorien resultat å vurdere standardkurven. Bekrefte stigningstallet, R2 verdi, forsterkning effektivitet og feil møter eksperimentell kriteriene.
- Sjekk antall ukjente prøvene visuelt på standardkurven basert på Ct-verdiene.
Merk: Byggingen av standardkurve, inkludert valg av fortynningsfaktoren, utføres ifølge publiserte protokoller11,12,13.
- Utføre gene expression analyse av mRNA ved hjelp av metoden ΔCt (Ct er normalisert til et refence gen).
- Trekk Ct verdien av målet genet fra Ct verdien av referanse genet å få ΔCt verdien.
- Gjennomsnittlig ΔCt verdiene av tekniske replikerer.
- Plot og analysere genuttrykk med statistikk programvare11,14 (se Tabell for materiale).
Merk: Alternativt gene expression Dybdeanalyser blir foretatt ifølge publiserte protokoller13.
Representative Results
Vi har tidligere rapportert at microneedle av hud microbiopsy penetrerer huden rundt 500 µm dyp7. Microneedle utformingen av huden microbiopsy er svært lik en absorberende microbiopsy (figur 2a). Mens den absorberende microbiopsy besto av et absorberende lag i midten for blod absorpsjon, inneholdt hud microbiopsy en kanal for mekanisk fangst av huden vev. Bruk av absorberende lag førte også til en liten forskjell i microneedle dimensjon (absorberende: 1,50 x 0,50 x 0.21 mm vs hud: 1,50 x 0,50 x 0.15 mm).
Figur 2b viser webområdene program 5 min etter absorberende og huden microbiopsies ble brukt på venstre volar arm av mannlige frivillig. På grunn av likheten mellom de to microneedle designene var søknad nettsteder fra begge enhetene sammenlignbare, med mindre erythema. Begge søknad nettsteder var ikke merkbar etter 48 timer med ingen arr igjen bak. Dette støtter hypotesen at minimal invasiv enheten har potensialet å hjelpe skjermen flere søknad nettsteder eller utføres regelmessig.
Figur 2 viser et representativt bilde av absorberende laget av absorberende microbiopsy etter mot volar armen av en mannlig frivillig. Som vist i figur, noen små biter av huden ble tatt nær spissen av microneedle, og blod var absorbert inn i papiret filter. Dette indikerer at enheten trengt huden og tatt både hud og blod samtidig innenfor samme absorberende microbiopsy matrise. Figur 2d viser etter prøvetaking huden microbiopsy, den forrige generasjonen av microbiopsy, for sammenligning. Kanalen av huden microbiopsy fanget en liten bit av huden, men mengden av blod på microneedle var liten i forhold til den absorberende microbiopsy. Begge søknad nettsteder var ikke merkbar innen 48 timer. I forsøket, absorberende microbiopsy ble brukt med en 10-s holder tid etter søknad, mens huden microbiopsy utgitt umiddelbart etter bruk på grunn av forskjellen i design.
Som vist i figur 3a, to grupper av absorberende microbiopsy var involvert i dette eksperimentet basert på programprotokollen: 'Umiddelbar løslatelse' og ' 10-s holde '. Den 'Umiddelbar løslatelse' gruppen ble enheten brukt ved hjelp av samme opprinnelige huden microbiopsy, med enheten blir fjernet fra programmet nettstedet umiddelbart etter påføring. For ' 10-s avholdelse ' gruppen enheten ble holdt på plass etter programmet for 10 å forbedre prøvetaking. De to gruppene av absorberende microbiopsy ble satt opp til å demonstrere hvordan programmet tilnærming kan påvirke hvor prøven. 10-s holder tiden ble valgt som klinisk rimelig tid å demonstrere at programmet tiden påvirker mengden utvinnbare prøven.
Mengden av RNA utvinnes fra de to absorberende microbiopsy gruppene var 0,33 ± 0,39 ng for 'Umiddelbar løslatelse' og 1.43 ± 0,88 ng for ' 10-s holde ' (figur 3a, n = 20), foreslå en 4-fold økning med ekstra holder tid. Dette indikerer at bruk absorberende enheten med 10-s holder tid resulterte i flere RNA utdraget. Forskjellen kan skyldes tilstedeværelse av økt blodprøve i absorberende lag (Figur 3 c). Faktisk gruppen 'Umiddelbar løslatelse' (figur 3b) mislyktes å samle en lignende mengde blod med de absorberende lag i forhold til ' 10-s holder ' gruppen (Figur 3 c). Det bør også bemerkes at mest umiddelbart utgitt microbiopsies ble nær x-aksen, antyder de negative hendelser eller vises veldig lite RNA. Derfor validert resultatet hypotesen som holder tiden vil ha innvirkning på ytelsen til enheten som det kan ta tid for blodet å bli absorbert av absorberende lag.
Siden enheten ble utviklet etter blod og huden prøvetaking, ble qPCR brukt til å oppdage uttrykk for hud og blod biomarkers for begge enhetene for sammenligning. Vi brukte tyrosinase, TYR, som en biomarkør for melanocytter og KRT14 som en biomarkør for keratinocytter i levedyktig overhuden. Hud microbiopsy prøver ble inkludert i eksperimentet for sammenligning. Som vist i Figur 4, men huden og absorberende microbiopsies ble brukt annerledes på grunn av forskjellen i design, uttrykket nivåer for både huden biomarkers TYR og KRT14 var sammenlignbare for begge enhetene som angitt av den data. Hvite blodlegemer biomarkers (CD3E, T celler og CD19, B celler) ble funnet for å være mer utbredt i absorberende microbiopsy prøver enn hud microbiopsy prøver. Dette resultatet antyder at den absorberende microbiopsy utføres bedre i blod samling men bevart kapasiteten for fange huden i forhold til huden microbiopsy (n = 5).
Figur 1. Fabrikasjon av absorberende microbiopsy. (a) tre-lags microneedle. (b) alle deler av enheten. (c) samlet absorberende microbiopsy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Den absorberende microbiopsy kunne fange hud og blod prøver samtidig uten å forlate et arr på venstre volar arm av mannlige frivillig. (a) en sammenligning mellom microneedles av absorberende og hud microbiopsies. (b) søknaden nettsteder venstre av absorberende og hud microbiopsies 5 minutter etter påføring. (c, d) Microneedles av absorberende og hud microbiopsies etter påføring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Den absorberende microbiopsy fanget mer blod og RNA prøven når anvendt for 10-s. (a) 10-s etter søknad holder tid resulterte i et høyere beløp av RNA enn slippe enheten umiddelbart (n = 20). Feilfelt representerer SD fra middelverdien (***p< 0,0001). (b, c) Representant bilder av absorberende microbiopsies etter program med 'Umiddelbar løslatelse' og ' 10-s holde ' tilnærminger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Sammenligning av mRNA uttrykk nivåer mellom hud og absorberende microbiopsies (n = 5). Av genuttrykk hadde blitt normalisert med referanse gene RPLP0. Feilfelt representerer SD fra middelverdien (*p< 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Disse resultatene viser at den absorberende microbiopsy kan brukes som et verktøy for enkel og minimal invasiv prøvetaking av hud og blod blanding for molekylær karakterisering. Enheten søknaden i henhold til våre protokollen er viktig for å få pålitelige resultater som vist av forskjellen i RNA beløpet med forskjellige programprotokoller (Figur 3). Når prøven er pakket ut, er etterfølgende prøven behandlingstrinn for RNA utvinning svært lik etablerte protokoller15,16. Dessuten fra de første trinnene i RNA utvinning som er endret for den absorberende microbiopsy, er en annen viktig endring bruken av RNase-fritt vann å forbedre resultatene for nedstrøms programmer. Videre er det verdt å nevne at referanse genet brukt i denne studien er RPLP0. RPLP0, hvis funksjon er kjent for ulike celler og vev typer17, har blitt rapportert som et passende referanse gen for bruk i ikke-melanom hudkreft og forstadier lesjoner18.
En av de viktigste begrensningene for enheten er fjerning av microbiopsy fra enheten, som er tidkrevende og potensielt øker sjansen for eksempel tap, særlig for følsom prøver som RNA. Likevel kan problemet overvinnes ved å kjøle før alle sterilt bildebehandling verktøy, for eksempel 2 mL microcentrifuge rør, på tørris.
Bruk av absorberende microbiopsy er enkel og krever ikke intensiv trening. Konvensjonelle biopsi er ikke nødvendig som microbiopsy tillater molekylær karakterisering med etablerte molekylær diagnostisering teknikker, som RT-qPCR. Videre kvantifisere og demonstrere prøvetaking av absorberende microbiopsy, ble tidligere litteratur som involverte RNA utvinning fra menneskelig hud vev undersøkt. Fra en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre studier har rapportert utdraget RNA beløpene variert fra 50 til 200 ng per mg huden vev19,20,21. Sammenligne med 1,43 ng av som ble gjenopprettet fra den absorberende microbiopsy i gjennomsnitt (Figur 3), vekten av samplet hudvevet forventes å rekkevidde fra 0.29-115 µg basert på samme RNA-til-vev forholdet fra huden punch biopsi studier.
Denne protokollen er ikke uten potensielle fallgruver, selv om noen av problemene kan være lett overvinnes. For eksempel foreslått RNA utvinning data en betydelig variasjon selv med 10-s holder tiden (Figur 3). For å løse problemet, innebærer en potensiell løsning optimalisere programprotokollen. Parametere som brukes på huden og holder tid skal være testet og optimalisert for å redusere variasjoner i prøven utvinning. Andre potensielle problemet er fjerning av microbiopsy fra enheten, som kan påvirke eksempel integritet og gjenoppretting. Selv om fjerne microbiopsy for RNA utvinning er en effektiv tilnærming, hele prosedyren er kjedelig, og prøven kan bli utsatt for forurensning i prosessen. Endring av prøve behandling protokollen er derfor svært ønsket for å sikre eksempel integritet og forhindre prøve tap.
Når ovennevnte to problemene er adressert, forventes det at enheten vil bli et standardverktøy for klinisk forskning. Det er viktig å merke seg at enheten registrerer både hud og blodprøve samtidig, og dette bør tas i betraktning når du analyserer genuttrykk data. Avslutningsvis beskriver denne protokollen informasjon om utføring av absorberende microbiopsy som en enkel og minimal invasiv verktøy for kombinert hud og blodprøve og påfølgende prøven behandling for relativ gene expression profilering.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne NHMRC stipend APP1109749 og APP1111216, Universitetet i Queensland Centennial stipend og internasjonale Postgraduate forskning stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
